1、第六章分子雜交與印跡技術Molecular Hybridization & Blotting Technology一、分子雜交和印跡技術（一）分子雜交和印跡技術的基本原理；（二）影響分子雜交的因素；（三）核酸探針（四）分子雜交和印跡技術的種類及應用掌握分子雜交及印跡技術的基本原理，分子雜交、探針的概念。熟悉探針的來源，選擇探針的基本原則，寡核苷酸探針的選擇要求，探針的同位素標記及非同位素標記的特點及種類。核酸分子雜交種類，Southern Blot、 Northern Blot的基本原理、過程及區別。了解影響雜交反應的因素，各種雜交條件的選擇。核酸分子雜交 (nucleic acid hybr

2、idization ) 分子雜交以DNA的變性和復性為理論基礎。DNA在某些理化因素的作用下堿基對間氫鍵破壞，由雙鏈變成單鏈的過程謂之DNA變性。變性DNA的單鏈重新合成雙鏈的過程為DNA的復性。 分子雜交是不同來源的單鏈核酸通過堿基互補形成雜合雙鏈的過程。 在DNA復性過程中，如果把不同DNA單鏈分子放在同一溶液中，或把DNA與RNA放在一起，只要在DNA或RNA的單鏈分子之間有一定的堿基配對關系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙鏈(heteroduplex) 。一、分子雜交與印跡技術的基本原理DNA的變性(denaturation)定義：在某些理化因素作用下，DNA雙鏈解開成兩條單鏈的過程

3、。本質：只改變二級結構，不改變核苷酸排列方法：過量酸，堿，加熱，變性試劑如尿素、 酰胺以及某些有機溶劑如乙醇、丙酮等。變性后其它理化性質變化：OD260增高粘度下降比旋度下降浮力密度升高酸堿滴定曲線改變生物活性喪失目 錄DNA變性的本質是雙鏈間氫鍵的斷裂例：變性引起紫外吸收值的改變DNA的紫外吸收光譜增色效應：DNA變性，由于解鏈使更多的共軛雙鍵暴露，使其溶液OD260增高，并與解鏈程度有一定的比例關系的現象。目 錄熱變性解鏈曲線：如果在連續加熱DNA的過程中以溫度對A260（absorbance，A，A260代表溶液在260nm處的吸光率）值作圖，所得的曲線稱為解鏈曲線。目 錄 Tm：變性是

4、在一個相當窄的溫度范圍內完成。在DNA變性過程中，紫外光吸收值達到最大值的50%（一半）時的溫度稱為DNA的解鏈溫度，又稱融解溫度(melting temperature, Tm)。其大小與G+C含量成正比。G、C含量越高，Tm越大；DNA越長，Tm越大；溶液的離子強度增高，Tm增加。在Tm時，有一半的DNA雙鏈被打開DNA的復性與分子雜交 DNA復性(renaturation)的定義在適當條件下，變性DNA的兩條互補鏈可恢復天然的雙螺旋構象，這一現象稱為復性。減色效應DNA復性時，其溶液OD260降低。熱變性的DNA經緩慢冷卻后即可復性，這一過程稱為退火(annealing) 。目 錄變性和

5、復性的應用：核酸分子雜交(hybridization) 在DNA變性后的復性過程中，如果將不同種類的DNA單鏈分子或RNA分子放在同一溶液中，只要兩種單鏈分子之間存在著一定程度的堿基配對關系，在適宜的條件（溫度及離子強度）下，就可以在不同的分子間形成雜化雙鏈(heteroduplex)。 這種雜化雙鏈可以在不同的DNA與DNA之間形成，也可以在DNA和RNA分子間或者RNA與RNA分子間形成。這種現象稱為核酸分子雜交。復性RNADNA二、影響雜交的因素核酸分子的濃度和長度濃度大，復性快；分子量大，復性慢溫度離子強度雜交液中的甲酰胺核酸分子的復雜性非特異性雜交反應三、核酸探針 *探針 (prob

6、e)概念 一小段用同位素、生物素或熒光染料標標記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸，與固定在NC膜上的核苷酸結合，判斷是否有同源的核酸分子存在。 探針的種類 基因組DNA探針；cDNA 探針； RNA探針；寡核苷酸探針。基因組DNA探針： 為某一基因的全部或部分序列；制備：基因組文庫選取某一基因，與質粒或噬菌 體連接，基因克隆后酶切獲得。 PCR擴增基因組DNA片段 注意：真核基因使用編碼序列（外顯子）作為探針，避免使用內含子和其它非編碼序列。DNA探針的優點： 制備方法簡單；相對RNA而言DNA探針不易降解； DNA探針的標記方法較成熟cDNA探針：cDNA上指點互補mRNA的DNA分子優點

7、：不含內含子和高度重復序列 但不易獲得.RNA探針單鏈RNA分子優點:無互補雙鏈的竟爭,雜交效率高,穩定性高 不存在重復序列,非特異性雜交較少 可用RNase將未雜交的探針水解,減少本底干擾. 但：易降解；標記復雜應用:檢測DNA、mRNA；觀察基因轉錄及真核基因的表達調控寡核苷酸探針優點： 根據需要合成相應序列，可避免天然探針存在的高度重復序列帶來的不利影響 鏈短（1050bp)、復雜性低、分子量小，與點量靶位點完全雜交所需時間短（短于克隆探針） 能識別序列內1個堿基的變化，明顯降低雜交的Tm值 可大量合成，價格低、可進行酶學或化學方法進行非放射性標記設計原則 長度：1050bp（過長，合成

8、困難、雜交時間長；過短， 特異性差） G+C含量：4060% 探針分子內部無互補序列，否則會引起發夾結構 避免同一堿基重復出現多于4個 一旦選定某一寡核苷酸序列，需與已知的各種基因序列進行同源性比較，若與非靶基因序列有70%以上的同源性，應重新設計DNA探針通常為400500個堿基，在探針標記過程中可調整DNA探針的長度。RNA探針的長度 相對就不那么易控制 探針的長度探針太短，可與多個位點雜交降低特異性探針的最小長度取決于其靶序列的復雜性。F=(1/4)L2NF值：探針和靶序列雜交的可能頻率L：探針的核苷酸數目（長度）N：靶序列的復雜性 DNA和RNA探針寡核苷酸探針探針的標記標記物核素標記

9、物（同位素標記）：32P、35S、3H等非核素標記物（非同位素標記）：生物素、地高辛、熒光素等一個理想的探針標記物：具有高度靈敏性標記物與探針結合后不影響雜交時的堿基配對檢測方法有高靈敏性、高特異性、假陽性低、環境污染少、價格低若用酶學方法標記時，對酶的Km值影響小，也不影響下一步酶促反應可準確定量，靈敏度高可檢測固相介質上10fg(10-15g)的DNA本底低，易除去舊探針重新雜交新探針特異性高, 對雜交無影響放射性標記應用最多的一類優點缺點短半衰期的探針要求臨時制備, 隨用隨標放射性遞減使探針降解放射性對人體有害,需防護費用貴無放射性，對人體的危害小探針性質穩定，可供長時間內持續使用檢測過

10、程快，可同時進行不同標記探針的雜交本底較低 非放射性標記優點缺點靈敏度和特異性不如放射性探針雜交條件受到報告基團的限制重新雜交新探針較困難 生物素地高辛熒光素：FITC，羅丹明化學發光物：如ECL光密度或電子密度標記物堿性磷酸酶(ALP)辣根過氧化物酶(HRP)非放射性標記物種類探針標記方法缺口平移法(nick translation)隨機引物法(random primer)：六核苷酸殘基的引物PCR標記法末端標記法探針純化四、印跡技術的類別及應用（一）DNA印跡技術 (Southern blotting) 用于基因組DNA、重組質粒和噬菌體的分析。（二）RNA印跡技術 (Northern b

11、lotting) 用于RNA的定性定量分析。（三）蛋白質的印跡分析 (Western blotting) 用于蛋白質定性定量及相互作用研究。 （四）其他斑點印跡 (dot blotting) 原位雜交 (in situ hybridization)DNA點陣 (DNA array) DNA芯片技術 (DNA chip)分子雜交實驗目 錄(一) Southern 印跡雜交1975年，英國Southern創建DNA/DNA雜交，即將DNA電泳、轉印到固相支持物上，用探針進行檢測的方法。Southern 雜交(Southern bloting)的主要步驟待測DNA樣品的制備、酶切待測DNA 樣品的電

12、泳分離：瓊脂糖凝膠電泳凝膠中DNA的變性：堿變性Southern轉膜：硝酸纖維素(NC)膜、尼龍膜毛細管虹吸印跡法、電轉印法、真空轉移法探針的制備 Southern雜交雜交結果的檢測Southern印跡雜交法M1210SSC 轉移緩沖液Whatman濾紙凝膠Whatman濾紙紙巾玻璃板重物支持物500g12與探針同源雜交的基因DNA片段基因組DNADNA酶切片段內切酶NC或尼龍膜NC膜或尼龍膜(二) Northern 印跡雜交(Northern bloting)檢測RNA（主要是mRNA）的方法與Southern雜交的不同靶核酸：RNARNA電泳轉膜：不需變性Northern印跡雜交RNA的提

13、取由于RNase具有活性高、不易滅活的特點，在提取中必須防止RNase對RNA的降解作用。細胞裂解液異硫氰酸胍可以抑制此酶活性。RNA變性電泳電泳前應加變性劑，如甲醛、乙二醛等使RNA二級結構解體，才能使RNA嚴格按相對分子質量大小分離。變性劑還可促進RNA與硝酸纖維素膜結合。印跡轉移若待測的RNA片段較大，可預先將凝膠置于0.05mol/L NaOH中浸泡20 min，以水解成較小的片段，再用20 xSSC浸泡45 min，以加快RNA的印跡轉移。預雜交雜交洗膜放射自顯影或化學顯色(三)Western 雜交印跡法(Western bloting)檢測蛋白質，即將電泳分離的非標記蛋白質轉移到固

14、相載體上，用特異的抗血清對蛋白質進行鑒定及定量的方法主要步驟：蛋白質樣品的制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳蛋白質的電轉移：NC膜靶蛋白的免疫學檢測靶蛋白于第一抗體（一抗）反應與標記的第二抗體（酶標二抗）反應顯色反應：酶促反應Western印跡雜交三種印跡技術的比較放射自顯影照片目 錄(四)原位雜交(in situ hybridization)將標記的核酸探針與細胞或組織中的核酸進行雜交，稱為原位雜交。特點能在成分復雜的組織中進行單一細胞的研究不需從組織或細胞中提取核酸，對含量極低的靶序列靈敏度高能準確反映組織細胞的相互關系及功能狀態核酸原位雜交的基本步驟細胞或組織的固定：載玻片組織細胞雜交前的預處理用去垢劑或蛋白酶除去核酸表面蛋白質探針的選擇和標