1、第一部分 色譜法 第一章 色譜法引論 第一節 概述 色譜法早在1903年由俄國植物學家茨維特分 離植物色素時采用。 他在研究植物葉的色素成分時，將植物葉子的萃取物倒入填有碳酸鈣的直立玻璃管內，然后加入石油醚使其自由流下，結果色素中各組分互相分離形成各種不同顏色的譜帶。這種方法因此得名為色譜法。以后此法逐漸應用于無色物質的分離，“色譜”二字雖已失去原來第一節 概述 的含義，但仍被人們沿用至今。在色譜法中，將填入玻璃管或不銹鋼管內靜止不動的一相（固體或液體）稱為固定相 ；自上而下運動的一相（一般是氣體或液體）稱為流動相 ；裝有固定相的管子（玻璃管或不銹鋼管）稱為色譜柱 。當流動相中樣品混合物經過固

2、定相時，就會與固定相發生作用，由于各組分在性質和結構上的差異，與固定相相互作用的類型、強弱也有差異，因此在同一推動力的作用第一節 概述 下，不同組分在固定相滯留時間長短不同，從而按先后不同的次序從固定相中流出。 從不同角度，可將色譜法分類如下： 1. 按兩相狀態分類氣體為流動相的色譜稱為氣相色譜（GC） 根據固定相是固體吸附劑還是固定液（附著在惰性載體上的一薄層有機化合物液體），第一節 概述 又可分為氣固色譜（GSC）和氣液色譜（GLC）。液體為流動相的色譜稱液相色譜（LC） 同理液相色譜亦可分為液固色譜（LSC）和液液色譜（LLC）。超臨界流體為流動相的色譜為超臨界流體色譜（SFC）。 隨著

3、色譜工作的發展，通過化學反應將固定液鍵合到載體表面，這種化學鍵合固定相的色譜又稱化學鍵合相色譜（CBPC）.第一節 概述2. 按分離機理分類利用組分在吸附劑（固定相）上的吸附能力強弱不同而得以分離的方法，稱為吸附色譜法。利用組分在固定液（固定相）中溶解度不同而達到分離的方法稱為分配色譜法。利用組分在離子交換劑（固定相）上的親和力大小不同而達到分離的方法，稱為離子交換色譜法。第一節 概述利用大小不同的分子在多孔固定相中的選擇滲透而達到分離的方法，稱為凝膠色譜法或尺寸排阻色譜法。最近，又有一種新分離技術，利用不同組分與固定相（固定化分子）的高專屬性親和力進行分離的技術稱為親和色譜法，常用于蛋白質的

4、分離。 層析法一 色譜的起源，發展，分類 1931年,Kuhn卵黃(葉黃素) 黃體素+玉米黃質素 1941年, Martin,分配柱層析 1944年, Martin,紙層析 1952年, James, 氣相色譜法 1956年,Stahl,薄層層析法 1967年, 高壓液相色譜法 固定相 流動相 差速遷移 色譜法的分類: 流動相 : 液體：液相色譜法 氣體：氣相色譜法 固定相 : 固體 液體 按兩相所處的狀態分： 固定相 固體 液體流動相 液體 L- SC L- LC 氣體 G- SC G - LC 按層析過程的機理分： 吸附層析： L-SC 分配層析： L-LC 按操作形式分： 柱層析 紙層析

5、 薄層層析二色譜法的基本過程 三 色譜法的基本原理：差速遷移2 液相柱層析法 : 吸附柱層析 分配柱層析一. 吸附柱層析（一) 基本原理： 吸附力不同 保留時間不同 差速遷移 分離（二) 分離過程（三) 吸附等溫線在一定的溫度下，一個組分在吸附劑上的吸附規律，可以用在平衡狀態時此組分在兩相中的濃度關系曲線圖來表示，這叫做吸附等溫線。 圖9-2三類等溫線與相應的色譜峰 （四） 吸附柱層析的固定相 吸附劑1. 對吸附劑的要求（基本要求） 應具有較大的吸附表面和一定的吸附能力（這種吸附應是可逆的，有利于組分的分離); 與流動相和樣品中各組分不發生化學反應（包括不相溶）; 吸附劑的顆粒應有一定的粒度且

6、均勻,常用目數表示，目數越大，顆粒越小。2. 吸附劑的種類和選擇性 極性吸附劑: 酸性吸附劑：硅酸（分離酸性物質） 堿性吸附劑：氧化鋁（分離堿性物質） 非極性吸附劑：活性炭 （分離高分子化合物） 3. 常用的吸附劑及其活性 硅膠 酸性 氧化鋁 中性 見吸附劑表 堿性 活性炭 液-固色譜中可用的固定相（按活性增加次序）: 1蔗糖 5滑石 9磷酸鈣 13硅酸鎂 2淀粉 6碳酸鈉 10碳酸鎂 14氧化鋁 3旋復花粉 7碳酸鉀 11氧化鎂 15活性炭 4檸檬酸鎂 8碳酸鈣 12硅膠 16 漂白土 4.吸附劑的線性容量： 吸附劑的比表面積; 吸附劑的活性:活性越強,線性容量越小,故常用去活性來增大線形容

7、量。 （加水） （五）吸附柱層析的流動相 洗脫劑1.對流動相(洗脫相)的基本要求: 純度合格;與樣品、吸附劑不發生化學反應;能溶解樣品組分,且粘度小易流動,不致洗脫太慢保持柱效的穩定性(即不能有損柱效,也不能改變柱的保留特性)；對樣品的回收率沒有干擾,即溶劑易蒸發除去。 2.洗脫劑的選擇 ： 依相似者相容的原理常用的流動相的極性遞增次序:石油醚環己烷 CCL4苯甲苯氯仿醋酸乙醚正丁烷丙酮乙醇水二.分配柱層析.對固定液的要求: 選擇性高 化學穩定性好 蒸氣壓低,熱穩定性好 粘度低 溶解度好(一) 分配色譜的基本原理及分離過程被分離組分在兩相間的K=Cs/Cm不同來分離(二) 分配色譜的固定相和流

8、動相,兩相的選擇:兩相極性應相差較大,彼此不能互溶樣品中被分離組分在兩相中的溶解度要足夠高分配色譜的兩種方式正相分配色譜(常規) ： 極性較強的溶劑為固定相 極性較小的溶劑為流動相反相分配色譜: 與正相相反 第三節 平面色譜法比移值第三節 高效液相色譜的固定相 和流動相一、固定相 高效液相色譜固定相以承受高壓能力來分類，可分為剛性固體和硬膠兩大類。 剛性固體以二氧化硅為基質，可承受7.01081.0109Pa的高壓，可制成直徑、形狀、孔隙度不同的顆粒。如果在二氧化硅表面鍵合各種官能團，可擴大應用范圍，它是目前最廣泛使用的一種固定相。 硬膠主要用于離子交換和尺寸排阻色譜中，它由聚苯乙烯與二乙烯苯

9、基交聯而成。可承受壓力上限為3.5108Pa。固定相按孔隙深度分類，可分為表面多孔型和全多孔型固定相第三節 高效液相色譜的固定相 和流動相兩類。1. 表面多孔型固定相 它的基體是實心玻璃球，在玻璃球外面覆蓋一層多孔活性材料，如硅膠、氧化硅、離子交換劑、分子篩、聚酰胺等。這類固定相的多孔層厚度小、孔淺，相對死體積小，出峰迅速、柱效亦高；顆粒較大，滲透性好，裝柱容易，梯度淋洗時能迅速達到平衡，較適合做常規分析。由于多孔層厚度薄，最大允許量受到限制。2. 全多孔型固定相 由直徑為10nm的硅膠微粒凝聚而成。這類固定相由于顆 第三節 高效液相色譜的固定相 和流動相粒很細（510m），孔仍然較淺，傳質速

10、率快，易實現高效、高速。特別適合復雜混合物分離及痕量分析。二、流動相 由于高效液相色譜中流動相是液體，它對組分有親合力，并參與固定相對組分的競爭，因此，正確選擇流動相直接影響組分的分離度。對流動相溶劑的要求是：（1）溶劑對于待測樣品，必須具有合適的極性和良好的選擇性。（2）溶劑與檢測器匹配。對于紫外吸收檢測器，應注意選用檢測器波長比溶劑的紫外截止波長 要長。所謂溶劑第三節 高效液相色譜的固定相 和流動相 的紫外截止波長指當小于截止波長的輻射通過溶劑時， 溶劑對此輻射產生強烈吸收，此時溶劑被看作是光學不 透明的，它嚴重干擾組分的吸收測量。 對于折光率檢測器，要求選擇與組分折光率有較大差別的溶劑作

11、流動相，以達到最高靈敏度。（3）高純度 由于高效液相色譜靈敏度高，對流動相溶劑的純度也要求高。不純的溶劑會引起基線不穩，或產生“偽 峰”。第三節 高效液相色譜的固定相 和流動相（4）化學穩定性好（5）低粘度（粘度適中） 若使用高粘度溶劑，勢必增高壓力，不利于分離。常用的低粘度溶劑有丙酮、甲醇和乙腈等；但粘度過低的溶劑也不宜采用，例如戊烷和乙醚等，它們容易在色譜柱或檢測器內形成氣泡，影響分離。第四節 液固色譜法 液固色譜的固定相是固體吸附劑。吸附劑是一些多孔的固體顆粒物質，位于其表面的原子、離子或分子的性質是多少不同于在內部的原子、離子或分子的性質的。表層的鍵因缺乏覆蓋層結構而受到擾動。因此，表

12、層一般處于較高的能級，存在一些分散的具有表面活性的 吸附中心 。因此，液固色譜法是根據各組分在固定相上的吸附能力的差異進行分離，故也稱為液固吸附色譜。 吸附劑吸附試樣的能力，主要取決于吸附劑的比表面積和理化性質，試樣的組成和結構以及洗脫液的性質等。組分與吸附劑的性質相似時，易被吸附，呈現高的保留值；當組分分子結構與吸附劑表面活性中心的剛性幾何結構相適應時，第四節 液固色譜法易于吸附。從而使吸附色譜成為分離幾何異構體的有效手段；不同的官能團具有不同的吸附能，因此，吸附色譜可按族分離化合物。吸附色譜對同系物沒有選擇性（即對分子量的選擇性小），不能用該法分離分子量不同的化合物。一、液固色譜法固定相

13、液固色譜法采用的固體吸附劑按其性質可分為極性和非極性兩種類型。極性吸附劑包括硅膠、氧化鋁、氧化鎂、硅酸鎂、分子篩及聚酰胺等。非極性吸附劑最常見的是活性炭。 極性吸附劑可進一步分為酸性吸附劑和堿性吸附劑。酸性吸附劑包括硅膠和硅酸鎂等，堿性吸附劑有氧化鋁、氧化第四節 液固色譜法鎂和聚酰胺等。酸性吸附劑適于分離堿，如脂肪胺和芳香胺。堿性吸附劑則適于分離酸性溶質，如酚、羧和吡咯衍生物等。 各種吸附劑中，最常用的吸附劑是硅膠，其次是氧化鋁。在現代液相色譜中，硅膠不僅作為液固吸附色譜固定相，還可作為液液分配色譜的載體和鍵合相色譜填料的基體。 三、液-固吸附色譜流動相 液相色譜的流動相必須符合下列要求： （

14、1）能溶解樣品，但不能與樣品發生反應。 （2）與固定相不互溶，也不發生不可逆反應。 （3）粘度要盡可能小，這樣才能有較高的滲透性和柱效。第四節 液固色譜法 （4）應與所用檢測器相匹配。例如利用紫外檢測器時，溶劑要不吸收紫外光。 （5）容易精制、純化、毒性小，不易著火、價格盡量便宜等。 在液-固色譜中，選擇流動相的基本原則是 極性大的試樣用極性較強的流動相，極性小的則用低極性流動相。 為了獲得合適的溶劑極性，常采用兩種、三種或更多種不同極性的溶劑混合起來使用，如果樣品組分的分配比k值范圍很廣則使用梯度洗脫。第五節 液液色譜法 液液色譜又稱液液分配色譜。 在液液色譜中，一個液相作為流動相，而另一個

15、液相則涂漬在很細惰性載體或硅膠上作為固定相。流動相與固定相應互不相溶，兩者之間應有一明顯的分界面。分配色譜過程與兩種互不相溶的液體在一個分液漏斗中進行的溶劑萃取相類似。 以氣液分配色譜法一樣，這種分配平衡的總結果導致各組分的差速遷移，從而實現分離。分配系數（K）或分配比（k）小的組分，保留值小，先流出柱。然而與氣相色譜法不同的是，流動相的種類對分配系數有較大的影響。第五節 液液色譜法一、固定相 液液色譜的固定相由載體和固定液組成。常用的載體有下列幾類：（1）表面多孔型載體（薄殼型微珠載體），由直徑為30 40m的實心玻璃球和厚度約為1 2 m的多孔性外層所組成。（2）全多孔型載體，由硅膠、硅藻

16、土等材料制成，直徑30 50 m的多孔型顆粒。（3）全多孔型微粒載體，由nm級的硅膠微粒堆積而成，又稱堆積硅珠。這種載體粒度為5 10 m。由于顆粒小， 第五節 液液色譜法所以柱效高，是目前使用最廣泛的一種載體。 由于液相色譜中，流動相參與選擇作用，流動相極性的微小變化，都會使組分的保留值出現較大的差異。因此，液相色譜中，只需幾種不同極性的固定液即可。如， 氧二丙腈（ODPN），聚乙二醇（PEG），十八烷（ODS）和角鯊烷固定液等。二、流動相 在液液色譜中，除一般要求外，還要求流動相對固定相的溶解度盡可能小，因此固定液和流動相的性質往往處于兩 個極端，例如當選擇固定液是極性物質時，所選用的流動

17、相第五節 液液色譜法通常是極性很小的溶劑或非極性溶劑。 以極性物質作為固定相，非極性溶劑作流動相的液液色譜，稱為正相分配色譜，適合于分離極性化合物； 反之，如選用非極性物質為固定相，而極性溶劑為流動相的液液色譜稱為反相分配色譜，這種色譜方法適合于分離芳烴、稠環芳烴及烷烴等化合物。第六節 化學鍵合相色譜 將固定液機械地涂漬在擔體上組成固定相。盡管選用與固定液不互溶的溶劑作流動相，但在色譜過程中固定液仍會有微量溶解。以及流動相經過色譜柱的機械沖擊，固定相會不斷流失，即使將流動相預先用固定相液體飽和或在色譜柱前加一個前置柱，使流動相先通過前置柱，再進入色譜柱，但仍難以完全避免固定液的流失。 70年代

18、初發展了一種新型的固定相化學鍵合固定相。這種固定相是通過化學反應把各種不同的有機基團鍵合到硅膠（載體）表面的游離羥基上，代替機械涂漬的液體固定相。這不僅避免了液體固定相流失的困擾，還大大改善了固定相的功能，提高了分離的選擇性，化學鍵合色譜適用于分離幾第六節 化合鍵合色譜法乎所有類型的化合物。 根據鍵合相與流動相之間相對極性的強弱，可將鍵合相色譜分為極性鍵合相色譜和非極性鍵合相色譜。在極性鍵合相色譜中，由于流動相的極性比固定相極性要小，所以極性鍵合相色譜屬于正相色譜。弱極性鍵合相既可作為正相色譜，也可作為反相色譜。但通常所說的反相色譜系指非極性鍵合色譜。反相色譜在現代液相色譜中應用最為廣泛。一、

19、化學鍵合固定相法 化學鍵合固定相一般都采用硅膠（薄殼型或全多孔微粒型）為基體。在鍵合反應之前，要對硅膠進行酸洗、中和、第六節 化合鍵合色譜法干燥活化等處理，然后再使硅膠表面上的硅羥基與各種有機物或有機硅化合物起反應，制備化學鍵合固定相。鍵合相可分為四種鍵型：（1）硅酸酯型（=Si-O-C=）鍵合相 將醇與硅膠表面的羥基進行酯化反應，在硅膠表面形成（=Si-O-C=）鍵合相。反應生成單分子層鍵合相。一般用極性小的溶劑洗脫，分離極性化合物。（2）硅氮型（=Si-N=）鍵合相 如果用SOCl2將硅膠表面的羥基先轉化成鹵素（氯化），再與各種有機胺反應，可以得到各種不同極性基因的鍵合相。第六節 化合鍵合

20、色譜法可用非極性或強極性的溶劑作為流動相。（3）硅碳型（=Si-C=）鍵合相 將硅膠表面氯化后，使Si-Cl鍵轉化為Si-C鍵。在這類固定相中，有機基團直接鍵合在硅膠表面上。（4）硅氧烷型（=Si-O-Si-C=）鍵合相 將硅膠與有機氯硅烷或烷氧基硅烷反應制備。這類鍵合相具有相當的耐熱性和化學穩定性，是目前應用最為廣泛的鍵合相。第六節 化合鍵合色譜法二、反相鍵合相色譜法 在反相色譜中，一般采用非極性鍵合固定相，如硅膠-C18H37（簡稱O D S或C18）硅膠-苯基等，用強極性的溶劑為流動相，如甲醇/水，乙腈/水，水和無機鹽的緩沖液等。 目前，對于反相色譜的保留機制還沒有一致的看法，大致有兩種

21、觀點：一種認為屬于分配色譜，另一種認為屬于吸附色譜。 分配色譜的作用機制是假設混合溶劑（水+有機溶劑）中極性弱的有機溶劑吸附于非極性烷基配合基表面，組分分子在流動相中與被非極性烷基配合基所吸附的液相中進行分配。第六節 化合鍵合色譜法 吸附色譜的作用機制是把非極性的烷基鍵合相，看作是在硅膠表面上覆蓋了一層鍵合的十八烷基的“分子毛”，這種“分子毛”有強的疏水特性。當用水與有機溶劑所組成的極性溶劑為流動相來分離有機化合物時，一方面，非極性組分分子或組分分子的非極性部分，由于疏溶劑的作用，將會從水中被“擠”出來，與固定相上的疏水烷基之間產生締合作用。另一方面，被分離物的極性部分受到極性流動相的作用，使

22、它離開固定相，減少保留值，此即解締過程。顯然，這兩種作用力之差，決定了分子在色譜中的保留行為。 一般地，固定相的烷基配合基或分離分子中非極性部分配。第六節 化合鍵合色譜法的表面積越大，或者流動相表面張力及介電常數越大，則締合作用越強，分配比也越大，保留值越大。 在反相鍵合相色譜中，極性大的組分先流出，極性小的組分后流出。三、正相鍵合色譜法 在正相色譜中，一般采用極性鍵合固定相，硅膠表面鍵合的是極性的有機基團，鍵合相的名稱由鍵合上去的基團而定。最常用的有氰基（-C N）、氨基（-NH2）、二醇基（DIOL）鍵合相。流動相一般用比鍵合相極性小的非極性或弱極性有機溶劑，如烴類溶劑，或其中加入一定量的

23、極性第六節 化合鍵合色譜法溶劑（如氯仿、醇、乙腈等），以調節流動相的洗脫強度。通常用于分離極性化合物。 一般認為正相色譜的分離機制屬于分配色譜。組分的分配比K值，隨其極性的增加而增大，但隨流動相中極性調節劑的極性增大（或濃度增大）而降低。同時，極性鍵合相的極性越大，組分的保留值越大。 該法主要用于分離異構體，極性不同的化合物，特別是用來分離不同類型的化合物。第六節 化合鍵合色譜法四、離子性鍵合相色譜法 當以薄殼型或全多孔微粒型硅膠為基質化學各種離子交換基團如-SO3H , -CH2NH2 , -COOH , -CH2N(CH3)Cl等時，形成了所謂的離子性鍵合色譜。其分離原理與離子交換色譜一樣

24、，只是填料是一種新型的離子交換劑而已。化學鍵合色譜具有下列優點：（1）適用于分離幾乎所有類型的化合物。一方面通過控制化學鍵合反應，可以把不同的有機基團鍵合到硅膠表面上，從而大大提高了分離的選擇性；另一方面可以第六節 化合鍵合色譜法 通過改變流動相的組成合乎種類來有效地分離非極性、極性和離子型化合物。（2）由于鍵合到載體上的基團不易被剪切而流失，這不僅解決了由于固定液流失所帶來的困擾，還特別適合于梯度洗脫，為復雜體系的分離創造了條件。（3）鍵合固定相對不太強的酸及各種極性的溶劑都有很好的化學穩定性和熱穩定性。（4）固定相柱效高，使用壽命長，分析重現性好。第七節 離子交換色譜法 離子交換色譜以離子

25、交換樹脂為固定相，樹脂上具有固定離子基團及可交換的離子基團。當流動相帶著組分電離生成的離子通過固定相時，組分離子與樹脂上可交換的離子基團進行可逆交換，根據組分離子對樹脂親合力不同而得到分離。一、固定相 離子交換色譜常用的固定相為離子交換樹脂。目前常用的離子交換樹脂分為三種形式：一是常見的純離子交換樹脂；第二種是玻璃珠等硬芯子表面涂一層樹脂薄層構成的表面層離子交換樹脂；第三種為大孔徑網絡型樹脂。第七節 離子交換色譜法 典型的離子交換樹脂是由苯乙烯和二乙烯苯交聯共聚而成。其中，二乙烯苯起到交聯和加牢整個結構的作用，其含量決定了樹脂交聯度的大小。交聯度一般控制在4 16%范圍內，高度交聯的樹脂較硬而

26、且脆，但選擇性較好。在基體網狀結構上引入各種不同酸堿基團作為可交換的離子基團。 按結合的基團不同，離子交換樹脂可分為陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂。 陽離子交換樹脂上具有與陽離子交換的基團。陽離子交換樹脂又可分為強酸性和弱酸性樹脂。強酸性陽離子交換樹脂所帶的基團為-SO3-H+ ，其中-SO3-和有機聚合物牢固結合形成固定部分，H+是可流動的能為其它陽離子所交換的離子。 第七節 離子交換色譜法 陰離子交換樹脂具有與樣品中陰離子交換的基團。陰離子交換樹脂也可分為強堿性和弱堿性樹脂。二、流動相 離子交換樹脂的流動相最常使用水緩沖溶液，有時也使用有機溶劑如甲醇或乙醇同水緩沖溶液混合使用，以提高特殊的

27、選擇性，并改善樣品的溶解度。第八節 排阻色譜法 排阻色譜法也稱空間排阻色譜或凝膠滲透色譜法，是一種根據試樣分子的尺寸進行分離的色譜技術。 排阻色譜的色譜柱的填料是凝膠，它是一種表面惰性，含有許多不同尺寸的孔穴或立體網狀物質。凝膠的孔穴僅允許直徑小于孔開度的組分分子進入，這些孔對于流動相分子來說是相當大的，以致流動相分子可以自由地擴散出入。對不同大小的組分分子，可分別滲入到凝膠孔內的不同深度，大個的組分分子可以滲入到凝膠的大孔內，但進不了小孔甚至于完全被排斥。小個的組分分子，大孔小孔都可以滲入，甚至進入很深，一時不易洗脫出來。因此，大的組分分子在色譜柱中停留時間較短，很快被洗脫出來，它的洗脫體積

28、很第八節 排阻色譜法小，小的組分分子在色譜柱中停留時間較長，洗脫體積較大，直到所有孔內的最小分子到達柱出口，完成按分子大小而分離的洗脫過程。 尺寸排阻色譜被廣泛應用于大分子的分級，即用來分析大分子物質相對分子質量的分布。 排阻色譜的固定相一般可分為 軟性、半剛性和剛性凝膠 三類。 所謂凝膠，指含有大量液體（一般是水）的柔軟而富有彈性的物質，它是一種經過交聯而具有立體網狀結構的多聚體。第八節 排阻色譜法（1）軟性凝膠 如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠都具有較小的交聯結構，其微孔能吸入大量的溶劑，并能溶漲到它干體的許多倍。它們適用于水溶性作流動相，一般用于小分子質量物質的分析，不適宜在高效液相色譜中。（2）半剛性凝膠 如高交聯度的聚苯乙烯。常以有機溶劑作流動相。（3）剛性凝膠 如多孔硅膠、多孔玻璃等，它們既可用水溶性溶劑，又可用有機溶劑作流動相，可在較高壓強和較高流速下操作。 第九節 色譜分離方法的選擇 要正確地選擇色譜分離方法，首先必須盡可能多的 了解樣品的有關性質，其次必須熟悉各種色譜方法的主要特點及其應用范圍。 選擇色譜分離方法的主要根據 是樣品的相對分子質量的大小，在水中和有機溶劑中的溶解度，極性和穩定程度以及化學結構等物理、化學性質。一、相對分子質量 對于相對分子質量較低（一般在200以下），揮發性比較好，