1、細胞增殖及調(diào)控 如果時光倒流25年，在座的各位還只不過是父母身體里的一個細胞；他們相遇融合為一個細胞，經(jīng)過不斷地細胞增殖及其對這個過程的精密調(diào)控，才長成了今天這樣你。 在今后漫長的人生中，你們身體里的大多數(shù)細胞還要繼續(xù)增殖并受到調(diào)控，如果這個過程發(fā)生了異常，健康就會受到威脅HeLa cell in culture幾個概念細胞增殖（cell proliferation）是細胞生命活動的重要特征，包括細胞生長和細胞分裂的過程。細胞生長（cell growth）細胞分裂（cell division）細胞增殖的生物學(xué)意義生物繁育的基礎(chǔ) 細胞補充創(chuàng)傷修復(fù)第一節(jié)細胞周期一、細胞周期概述二、細胞周期各時相的

2、動態(tài)變化 前期（prophase）早中期（prometaphase）中期（ metaphase ）后期（ anaphase ）末期（ telophase ）胞質(zhì)分裂（ cytokinesis ）細胞周期G1期（Gap1 phase）S 期 （S phase）G2期（Gap2 phase）interphaseM phase間期分裂期一、細胞周期概述interphaseprometaphaseprophasemetaphaseanaphasetelophasecytokinesis單向性：G1 S G2 M，不能逆行階段性：各時相的細胞形態(tài)和代謝特點都有明顯差異。細胞周期特點不同生物的細胞tC存在

3、很大差異不同組織的細胞TC也有差異tStG2tM 相對恒定變化小G1期持續(xù)時間差異大，tG1決定細胞周期的長短。細胞周期時間（tC）從增殖的角度來看，所有真核細胞可分為周期細胞（連續(xù)分裂細胞）靜止期細胞（休眠細胞、G0期細胞）終末分化細胞（不分裂細胞）細胞分類指在細胞周期中連續(xù)運轉(zhuǎn)的細胞（細胞增殖） 如小腸絨毛上皮隱窩細胞 表皮基底層細胞 骨髓造血細胞周期細胞(cycling cell)暫時脫離細胞周期，不進行增殖，但在適當(dāng)刺激下可重新進入細胞周期的細胞 肝脾細胞、淋巴細胞、成纖維細胞靜止期細胞(quiescent cell, G0)指終端分化的細胞，發(fā)生不可逆地脫離細胞周期，喪失分裂能力，但

4、保持生理機能活動的細胞 神經(jīng)元、肌肉細胞、紅細胞終末分化細胞細胞同步化 （synchronization of cells）指在生理過程中自然發(fā)生的或經(jīng)人為處理造成的使細胞處于同一細胞周期時相的方法。 自然同步化與人工同步化 人工同步化選擇同步化誘導(dǎo)同步化有絲分裂選擇法細胞沉降分離法 DNA合成阻斷法有絲分裂中期阻斷法適用于單層培養(yǎng)的細胞利用M期細胞呈圓球狀隆起，與培養(yǎng)皿的附著力減弱的特點振蕩、收集、保存在4、多次重復(fù)優(yōu)點：細胞不受藥物傷害，同步化程度高缺點：分離出來的M期細胞數(shù)量較少有絲分裂選擇法(mitotic shake-off)有絲分裂選擇法HeLa cell in culture屬于

5、細胞沉降分離法，適用于任何懸浮培養(yǎng)的細胞處于細胞周期不同時相的細胞體積不同優(yōu)點：同時獲得大量不同周期時相的同步化細胞，分離效率高，對細胞活性影響小缺點：需專門的裝備、價格貴活細胞離心淘洗法選用DNA合成抑制劑，可逆地抑制DNA合成TdR（胸腺嘧啶核苷）雙阻斷法該方法適用于（tG1+tG2+tM）tS細胞優(yōu)點：適用于任何培養(yǎng)體系，同步化程度高， 可使所有的細胞同步化缺點：細胞可能出現(xiàn)非均衡生長的問題DNA合成阻斷法第一次阻斷：加入過量的TdR， S期細胞停止運轉(zhuǎn)，其他期細胞最后停止在G1-S交界處第二次阻斷：移去TdR，釋放時間大于tS時，再次加入過量TdR，細胞群體阻斷在G1-S交界處，再經(jīng)釋

6、放獲得S期細胞TdR雙阻斷法( double thymidine block)TdR雙阻斷法重點，理解藥物阻斷法有絲分裂中期阻斷法利用某些藥物（ 秋水仙素,Taxol, nocodazole）抑制微管的聚合，抑制有絲分裂器的形成，從而把細胞阻斷在有絲分裂中期優(yōu)點：操作簡便、同步化效率較高缺點：阻斷的可逆性差Hela, Noc: 100ng/m, 16h二、細胞周期各時相的動態(tài)變化 有絲分裂完成到DNA合成之前tG1變化最大，控制著連續(xù)分裂細胞的增殖率是細胞生長和DNA合成準(zhǔn)備時期中心體分離，為進行中心體復(fù)制作準(zhǔn)備G1/S檢驗點（限制點，Restriction point）G1 期與DNA合成起

7、始與進行有關(guān)的酶與細胞從G1期到S期的轉(zhuǎn)換有關(guān)的蛋白質(zhì)G1期合成的蛋白質(zhì)細胞周期蛋白( cyclin D, E等)從DNA合成開始到DNA合成結(jié)束的全過程主要生化事件S 期DNA復(fù)制組蛋白和非組蛋白合成核小體組裝中心體復(fù)制DNA復(fù)制檢測點（S phase checkpoint)真核細胞DNA復(fù)制特點DNA復(fù)制多個復(fù)制起點復(fù)制起點成簇活化DNA復(fù)制不同步GC含量較高的DNA序列在早S期復(fù)制AT含量較高的DNA序列在晚S期復(fù)制常染色質(zhì)先復(fù)制異染色質(zhì)在晚S期復(fù)制組蛋白與DNA的合成是一種聯(lián)動關(guān)系在細胞S期存在一個反饋機制，調(diào)節(jié)游離組蛋白水平，保證組蛋白形成的數(shù)量與DNA量相適應(yīng)。組蛋白合成DNA復(fù)制

8、完成到有絲分裂開始前的時期細胞核內(nèi)DNA含量已增加一倍，由G1期的2n變成了4n活躍的RNA和蛋白質(zhì)的合成，為M期的分裂作準(zhǔn)備。G2 期加速合成微管蛋白，為M期紡錘體微管的組裝提供原料成熟促進因子（MPF）形成已復(fù)制的中心體在G2期逐漸長大，并開始向細胞兩極分離G2/M檢驗點G2 期細胞分裂開始到分裂成兩個子細胞的過程染色質(zhì)高度螺旋化，遺傳物質(zhì)均等分配，形成2個子細胞RNA合成停止，蛋白質(zhì)合成減少細胞呈球形紡錘體組裝檢驗點(spindle assembly checkpoint)M 期第二節(jié)細胞分裂無絲分裂（amitosis）：是細胞的直接分裂方式;減數(shù)分裂（meiosis）：在生殖細胞的成熟

9、過程中進行;有絲分裂（mitosis）：在體細胞中進行，將其遺傳物質(zhì)載體平均分配到兩個子細胞中.有絲分裂有絲分裂過程人為劃分為前期（prophase）早中期（prometaphase）中期（metaphase）后期（anaphase）末期（telophase） 胞質(zhì)分裂（cytokinesis）有絲分裂器（mitotic apparatus）紡錘體（spindle）中心粒中心粒周圍物質(zhì)星體（aster）中心體（centrosome）星體微管動粒微管極微管Microtubule: a/b-tubulin heterodimerChristiane Wiese, and Yixian Zheng,

10、 JCB, 2006Microtubule NucleationK-fiberInterpolar microtubuleAstral microtubuleSpindle Microtubules:Key components of mitotic spindle中心體周期（centrosome cycle） 中心體經(jīng)過一系列發(fā)育過程達到成熟并具有微管組織中心（MTOC）的作用 ；指在間期中中心體的復(fù)制至有絲分裂開始時兩個新的中心體分離的過程。中心體周期 Centrosome 染色質(zhì)凝集開始組裝有絲分裂裝置核仁解體前期（prophase）核被膜崩解核纖層解聚紡錘體進一步裝配紡錘體微管與染色體

11、接觸、結(jié)合動粒微管牽拉染色體劇烈地旋轉(zhuǎn)、振蕩，往返于兩極之間早中期（prometaphase）染色體排列到赤道面上染色體最大程度凝集形成完整的有絲分裂器中期（metaphase）姊妹染色單體相互分離并移向兩極后期A：染色單體向兩極運動后期B：紡錘體兩極移動分開后期（anaphase）Anaphase AAnaphase B子染色體到達兩極動粒微管消失 染色體開始解螺旋核膜碎片重組成完整核被膜核仁重新出現(xiàn)末期（telophase） 開始于細胞分裂后期，完成于細胞分裂末期 分裂溝：赤道板周圍處細胞表面下陷形成收縮環(huán)：由微絲束環(huán)繞細胞一周形成胞質(zhì)分裂（cytokinesis）胞質(zhì)分裂第三節(jié)細胞增殖調(diào)

12、控一、細胞周期調(diào)控的關(guān)鍵分子二、細胞周期檢測點難點：有點難，但很重要喔！一、細胞周期調(diào)控的關(guān)鍵分子細胞增殖是一個多階段、多因子參與，高度精確的過程，這個過程是由不同基因嚴格按照時間順序表達的結(jié)果，也是基因與環(huán)境因素相互作用的結(jié)果。細胞周期的調(diào)控是嚴格有序、極其復(fù)雜的過程，涉及多個因子在多層次上的作用1960s，LelandHartwell以芽殖酵母為實驗材料，發(fā)現(xiàn)cdc28基因cdc28基因編碼一個34KD的蛋白激酶，促進細胞通過G1/S檢測點研究背景budding yeast1970s，Paul Nurse以裂殖酵母為實驗材料發(fā)現(xiàn)cdc2基因cdc2基因編碼一個34KD的蛋白激酶，促進細胞通

13、過G2/M檢測點命名為周期蛋白依賴性蛋白激酶 研究背景Fission yeast1980s，Timothy Hunt以海膽為實驗材料發(fā)現(xiàn)細胞周期蛋白（Cyclin A和B）研究背景Leland H. Hartwell R. Timothy (Tim) Hunt Sir Paul M. Nurse 2001年10月8日Hartwell、Nurse和Hunt因?qū)毎芷陉P(guān)鍵調(diào)控分子的研究而獲諾貝爾生理學(xué)/醫(yī)學(xué)獎。周期蛋白 （Cyclin）周期蛋白依賴性蛋白激酶（Cyclin-dependent kinase，Cdk）周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制蛋白（Cdk inhibitor，CKI）細胞周期調(diào)控的

14、關(guān)鍵分子在細胞周期中呈周期性的積累和消失分子結(jié)構(gòu)特點：含周期蛋白框、破壞框結(jié)構(gòu)域Cyclin與Cdk形成二聚復(fù)合物，表現(xiàn)出激酶活性，Cdk為催化亞基，Cyclin為調(diào)節(jié)亞基在高等真核生物中，Cyclins主要包括 Cyclin A-H 8個成員周期蛋白（Cyclin）周期蛋白分類G1-Cyclins： Cyclin DG1/S-Cyclins：Cyclin ES-Cyclins：Cyclin AM-Cyclins：Cyclin BG1G1SG2Mconcentration與周期蛋白結(jié)合，進而表現(xiàn)出絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性在高等真核生物中至少有8種，即Cdk 1（Cdc 2）Cdk 8各種Cd

15、k在細胞周期內(nèi)特定的時間被激活，通過磷酸化底物，驅(qū)使細胞完成細胞周期 周期蛋白依賴性蛋白激酶（Cyclin dependent kinase, Cdk）Cyclin磷酸化與去磷酸化(phosphorylation & dephosphorylation)CKICDK活性的調(diào)節(jié)因素CyclinCDKCKIPSubstrateSubstratePCDK/Cyclin活化位點：第161位的蘇氨酸（T161） 抑制位點：第14位的蘇氨酸（T14）抑制位點：第15位的酪氨酸（Y15） CDK1磷酸化位點CDK1CyclinBThr161Thr14Tyr15PPPPCDK1CyclinBThr161Thr

16、14Tyr15PPCDK1CyclinBThr161Thr14Tyr15PCDK1Thr161Thr14Tyr15PCDK1Thr161Thr14Tyr15CyclinBCDK1Thr161Thr14Tyr15CyclinBCyclinB degradationActive MPFMitosisCdc25Wee1Myt1inactiveRegulation of CyclinB/CDK1磷酸化調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)泛素化調(diào)節(jié)CyclinBCdk1CyclinBCdk1UbUbUbUbCdc20APC/CB細胞周期的驅(qū)動G1期：CyclinD與Cdk4、Cdk6結(jié)合，激活與DNA復(fù)制相關(guān)的基因表達G1-S期

17、：CyclinE與Cdk2結(jié)合，促使細胞通過G1/S檢測點，啟動DNA合成S期：CyclinA與Cdk2結(jié)合，使DNA復(fù)制得以延續(xù)M期：CyclinB與Cdk1結(jié)合，促進有絲分裂事件的發(fā)生G1/S transitionCDK2/CyclinE CDK4/6/CyclinD 活化RB 磷酸化E2F-1去抑制,激活轉(zhuǎn)錄G1S又稱細胞促分裂因子（mitosis-promoting factor）、M期促進因子（M phase-promoting factor ）是 Cdk1（Cdc2）和 Cyclin B 形成的復(fù)合物促進細胞由G2期進入M期 成熟促進因子（maturation-promoting

18、factor ，MPF ）CDK1CyclinBThr161Thr14Tyr15PG2MG2/M transition對CDK激酶活性起負性調(diào)控的蛋白質(zhì)與CDK或Cyclin-CDK復(fù)合物結(jié)合，拮抗Cyclin，抑制CDK的激活CKI分為CIP/KIP和INK4兩大家族周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制蛋白（CKI）p21是CIP/KIP家族的典型代表與多種Cyclin-CDK復(fù)合物結(jié)合，抑制大多數(shù)Cdk的激酶活性與DNA復(fù)制聚合酶的功能亞基PCNA（增殖細胞核抗原）結(jié)合，直接抑制DNA的合成CIP/KIP家族p16是INK4家族的典型代表與Cyclin D競爭性結(jié)合Cdk4和Cdk6抑制Cdk 4和

19、Cdk 6的活性抑制Rb磷酸化阻止細胞由G1期進入S期INK4家族CKI 對細胞周期的調(diào)控CDKs/CyclinsMG1G2SCKIs: p15, p16, p21, p27Tumor suppressors: p53細胞周期調(diào)控二、細胞周期檢驗點（checkpoint）在長期進化過程中，細胞形成了一套保證細胞周期中DNA復(fù)制和染色體分配的監(jiān)控機制，稱為細胞周期檢驗點 高等真核生物和酵母細胞中普遍存在負反饋調(diào)節(jié)機制 細胞周期檢驗點S checkpoint二、細胞周期檢驗點（checkpoint）DNA損傷檢驗點（DNA damage check point ）：檢測DNA有無損傷、合成有無錯誤

20、， DNA損傷、合成未完成，不能進入S期或M期G1/S檢驗點（G1/S checkpoint）G2/M檢驗點（G2/M checkpoint）早G1期和晚G1之間存在的一個特定檢驗點在酵母細胞中該點被稱為啟動點（start）高等真核細胞中該點被稱為限制點（ R點，restriction point ）G1/S檢驗點是控制細胞增殖的關(guān)鍵，由此細胞可能有3種不同命運的出現(xiàn)G1/S檢驗點繼續(xù)增殖細胞暫時不增殖細胞不增殖細胞DSBsSensorsTransducersEffectorsCell Cycle ArrestDNA RepairApoptosisDNA Damage Response (DDR)是控制細胞增殖的關(guān)鍵，由此細胞可能有3種不同命運的出現(xiàn)G2/M檢驗點繼續(xù)增殖細胞暫時不增殖細胞不增殖細胞CDK1CDK1離子輻射DNA損傷激活細胞周期檢驗點的信號傳導(dǎo)通路p53CHK2Pp21CDC25APCDK2p21CyclinECDK2p21CyclinEPPATMMDC153BP1MRNBRCA1MDC153BP1MR