1、實驗報告實驗名稱肥達試驗實驗日期院 系專 業班 級姓 名學 號一、實驗目的學會肥達反應的原理、方法以及結果分析。理解肥達反應在傷寒和副傷寒桿菌感染檢測中的 應用。、實驗器材試劑：生理鹽水、患者血清、傷寒桿菌H菌液、傷寒桿菌O菌液、甲型副傷寒桿菌H液、乙型副傷寒桿菌H菌液器材：水浴鍋、冰箱、小試管32支、試管架、記號筆、移液槍三、實驗原理.傷寒桿菌有三種抗原：分別為菌體抗原（O抗原）、鞭毛抗原（H抗原）、體表抗原（Vi 抗原）。其中以O抗原及H抗原的抗原性較強，而Vi抗原的抗原性不強，且相應抗體效價 低且為時短暫，隨細菌的消除而消失，故不列為肥達試驗的檢測項目。（但其檢查有助于發 現傷寒帶菌者。

2、）當抗原遇到特異性抗體（抗O及抗H）時，便會發生凝集反應，通過對凝 集物量多少來推算病人體內抗體的多少，以協助診斷、治療及判斷預后。.用已知的傷寒沙門菌菌體（O）抗原和鞭毛（H）抗原，以及引起副傷寒的甲型副傷寒沙 門菌、乙型副傷寒沙門菌H抗原的診斷菌液與受檢血清做試管或微孔板凝集實驗，測定受 檢血清中有無相應抗體及其效價的試驗。四、實驗過程及步驟.取清潔小試管32支，分成4排，每排8支，依次編號。.32支小試管，用移液槍各注入0.5ml生理鹽水。.第一管內加入1： 10稀釋的患者血清0.5ml，用1ml吸管吹吸三次，混勻，吸出0.5ml注入第二管作對倍稀釋,依次稀釋至第7管，棄去0.5ml，第

3、8管為對照。第二排、第三排、第四排以相同步驟加入患者血清。.第一排各管內注入傷寒桿菌H菌液0.5ml；第二排各管注入傷寒桿菌O菌液0.5ml；第三 排各加入甲型副作寒桿菌H液0.5ml；第四排各管加入乙型副傷寒桿菌H菌液0.5ml。.置于56水浴箱24小時。.放冰箱過夜或放37水浴箱18小時后觀察結果。.結果觀察最強:上液澄清，細菌全部凝集沉淀于管底。強：上液輕度混濁，細菌大部分凝集沉淀于管底。弱：上液混濁，細菌少部分凝集。不凝：液體呈乳狀與對照管相同。五、實驗總結.結果與分析：先觀察對照管，正確結果應無凝集現象，再觀察各試驗管的凝集現象，凝集程度以“+”多 少表示之。（+）最強，上液澄清，細

4、菌全部凝集沉淀于管底。（+）強，上液輕度混濁，細菌大部分凝集沉淀于管底。（+）弱，上液混濁，細菌少部分凝集。（-）不凝，液體呈乳狀與對照管相同。效價判定：以能出現“+”凝集現象的血清最高稀釋度為該血清的凝集效價。一般認為O抗體效價在1： 80以上，H抗體效價在1： 160以上，有輔助診斷意義。H甲或H乙達到1： 80或以上具有診斷意義。但在分析結果時，應注意以下兩點：（1）非腸熱癥患者，由于曾接種過傷寒，副傷寒疫苗或以往在流行區有過隱性感染或患過 傷寒，副傷寒，以及回憶反應等原因，也可呈現陽性結果。不過，由這些原因所引起的陽性 反應主要是H抗體升高，O抗體效價一般不高，同時，每隔57天試血一次

5、，其抗體效價 一般不會隨病程而升高。上述這些都有別于現癥感染。（2）少數腸熱癥患者，由于發病初期曾使用大量抗生素，或機體有免疫缺陷病，或機體反 應性極弱等原因，抗體效價可以很低，甚至為陰性結果。因此不能只根據肥達氏試驗的結果去作簡單肯定或否定的結論，必須結合當地流行情況，既 往接觸史，以及臨床癥狀和體征，做出正確的判斷。.肥達反應的診斷標準：肥達反應是診斷傷寒副傷寒的輔助診斷，其結果的解釋必須結合臨床變現和病程，病史，以 及地區流行病學情況。機體患傷寒、副傷寒，一般于發病后12周內血液中出現特異性抗體并且隨著病程延長而效 價漸升，此時即可為陽性，第4周可達峰值，以后又逐漸降低。一般以“O”凝集

6、效價在1/80或以上和H”在1/160或以上為陽性。O抗體主要是IgM,出現較早；H抗體主要是IgG,出現較晚。根據此特點，肥達試驗結果有 如下診斷價值：二者均超過正常值，患傷寒的可能性大；二者均在正常值內，患傷寒的可能性小；H抗體效價超過正常值，O抗體效價正常，可能是接種了傷寒菌苗或者是接種的回憶反應; O抗體效價超過正常值，H抗體效價正常，可能是傷寒早期或者其他沙門氏菌感染； 一般間隔12周復查，若抗體效價比前次結果增高24倍，則具有診斷價值。選擇題：請正確點選肥這反應檢測結果與相應的臨床意義TO TH TA IB TC I臨床意義飾寒及副佛寒感染早期/交叉反應防寒及副傷寒感染晚期/預防接

7、種/非特異性回憶反應市寒甲型副惰賽乙型副傷寒丙型副傷寒接種傷寒及副傷寒三聯疫苗非腸熱癥/早期用抗生素/免疫功能低下六、教師評價實驗報告實驗名稱沉淀反應實驗日期院 系專 業班 級姓 名學號一、實驗目的掌握對流免疫電泳的原理和方法，了解其用途。二、實驗器材器材：電子天平、錐形瓶、200ml量筒、藥匙、稱量紙、水浴鍋、微波爐、洗耳球、玻片、移液管、廢液缸、打孔器、膠頭滴管、移液槍、鑷子、紗布條、電泳槽試劑：pH8.6 0.05mol/L巴比妥緩沖液、瓊脂粉三、實驗原理1.對流免疫電泳也稱反向免疫電泳或免疫電滲電泳，其實質是定向加速的電泳技術與免疫雙 擴散技術的結合?？乖涂贵w在一定的pH條件下，由于

8、帶電荷量的多少及分子量大小不同， 在電場中以不同的速度作定向移動。在pH8.6的緩沖液中，多數蛋白質抗原物質帶負電荷， 在電場作用下向陽極移動；而其抗體大多為Y球蛋白，等電點較高，帶負電荷較少，且分子 量較大，電泳速度慢，受電滲作用影響向負極移動。由于抗原抗體孔相對排列，當兩者比例 適當時，特異性抗原抗體互相結合形成肉眼可見的白色沉淀線。同時，由于電場限制了抗原 抗體分子的自由擴散，從而提高了試驗的敏感性，且縮短了試驗時間。此法可用于抗原或抗 體的快速診斷。但缺點是分辨力低，較復雜的抗原抗體系統不宜用此法。2.在一定溫度和電解質存在的條件下，可溶性抗原與相應抗體在比例合適處形成肉眼可見的 沉淀

9、線，稱為沉淀反應(precipitationreaction)。參與反應的抗原稱為沉淀原，抗體稱為沉淀素。 可溶性沉淀原分子小，單位體積內所含的抗原量多，與抗體結合的總面積大，故試驗時需對 抗原進行稀釋，確?？乖c抗體以合適的比例結合，并以抗原的稀釋度作為沉淀反應的效價。 目前廣泛應用的沉淀反應是凝膠免疫擴散(Agar-gelimunodiffUsion)。在凝膠內電解質的參與 下，特異性抗原、抗體在凝膠內擴散并相遇，免疫復合物在最適比例處(在平衡區帶，即抗 體決定簇的數目等于抗原決定簇數目時)發生沉淀。常用的12%瓊脂凝膠形成的構架網孔 較大，允許分子量在20萬以下的物質(如絕大多數可溶性抗

10、原和抗體)通過，在凝膠中自 由擴散。而免疫復合物因顆粒較大不擴散，形成沉淀線。這種沉淀線是一組抗原抗體的特異 性復合物。如果凝膠中有多種不同抗原抗體存在時，便依各自擴散速度的差異，在適當部位 形成獨立的沉淀線，因此廣泛地用于抗原成分的分析。瓊脂擴散試驗可根據抗原抗體反應的 方式和特性分為單向免疫擴散、雙向免疫擴散、免疫電泳、對流免疫電泳、火箭電泳、免疫 固定電泳等試驗。以下為對流免疫電泳測定血清中的AFP。四、實驗過程及步驟任務一：制備巴比妥瓊脂板.電子天平稱取0.500g瓊脂粉，加入錐形瓶，用量筒量取50ml pH8.6 0.05mol/L巴比妥緩 沖液加入錐形瓶?；靹蚝笪⒉t加熱2分鐘。再

11、放入56恒溫水浴鍋中。(0.05ml/LpH8.6巴比妥緩沖液的配制方法：巴比妥-1.84g；巴比妥鈉-10.3g；加蒸餾水至 1000ml).取4.5ml已融化的1%巴比妥瓊脂溶液滴于載玻片上提示：(1)所用載玻片要潔凈、邊緣無破損，否則難以澆制瓊脂板，可用75%乙醇沖洗干凈，晾 干備用。(2)吸取瓊脂溶液的量，太少不能鋪滿整張玻片，太多將溢出玻片，都會導致瓊脂板制備 失敗。(3)澆制瓊脂板時動作要迅速，過于緩慢容易邊加邊凝，使瓊脂板凹凸不平。任務二：打孔L待瓊脂板凝固后在瓊脂板中間部分打四個孔，孔徑3mm,孔距 10mm。在左上角打一個孔 作為標記。用膠頭滴管吸去空上廢液。提示：（1）打孔

12、時要小心，勿使瓊脂層脫離載玻片或瓊脂板底層開裂，以免加樣時順裂縫或底部 散失。一旦出現裂縫或脫離現象，可向孔內滴加少許溫瓊脂加以彌補或將瓊脂板在火焰高處 來回通過幾次補底。（2）在瓊脂板左上角打上標記孔，有助于確定正負極方向和樣本上樣位置，通常情況下， 有標記孔側，放置于正極端。任務三：加樣1.如下圖所示加樣，用移液槍每個孔加10微升對應液體：以抗體Q C q抗原R抗悻O 0 D-抗原C：人待測血清；D：人陽性血清；E：抗人血清抗體/診斷血清 提示：（1）抗原和抗體在一定的pH條件下，由于帶電荷量的多少及分子量大小不同，在電場中 以不同的速度作定向移動。在pH8.6的緩沖液中，多數蛋白質抗原物

13、質帶負電荷，在電場作 用下向陽極移動，而其抗體大多為Y球蛋白，等電點較高，帶負電荷較少，且分子量較大， 電泳速度慢，受電滲作用影響向負極移動。（2）加樣時勿使樣品外溢或在邊緣殘存小氣泡，以免影響擴散結果。（3）抗原、抗體的量應相接近時容易出現沉淀帶，反之不易發生，如抗原過多，可造成假 陰性結果，可通過稀釋抗原加以解決。任務四：正確放置瓊脂板至電泳槽.向電泳槽中加入約2/3體積的pH8.6 0.05mol/L巴比妥溶液，將加好樣的瓊脂板放入電泳槽， 有標記孔的一側放在正極端。.用紗布條搭在瓊脂板兩側，以便電泳。提示：（1）電泳時抗原、抗體電極方向不可放反。（2）搭橋時應注意與凝膠接觸緊密，否則會使電流不均勻，致使沉淀線