1、基因操作常規技術(ppt)（優選）基因操作常規技術4.1 核酸的分離與檢測gDNA的分離質粒DNARNA的分離細胞破碎去蛋白DNA沉淀4.1.1 gDNA的提取SDS法酚抽提法CTAB法CTAB法高鹽: 溶解低鹽: 沉淀蛋白、多糖分離NaAc-70% alc如何保持CS-DNA的完整性?物理降解內源DNasepH74.1.2 質粒DNA的分離純化拓撲學的差異 gDNA大, 易解旋質粒小, ccc狀態proteinsocDNAL-DNAcccDNARNAs1. CsCl密度梯度超離心密度梯度沉降=擴散浮力密度差樣品+EB樣品BD = 該位置上的CsCl密度位置分布: 沉降速度、 MW及離心時間S

2、ol I; II; IIIcccDNAL-DNAocDNAD-DNAT-DNA2. 堿變性法pH12: 變性程度pH7: 復性速度離心: 收集?3. 沸水浴法加酶破壁 沸水浴40 s離心Eth沉淀 4.1.3 RNA的提取原理酚-異硫氰酸胍防止RNA降解的措施DEPC處理RNasin專用無菌臺器皿、手套、口罩低溫操作4.1.4 核酸質量檢測紫外光譜法凝膠電泳法ssDNA=33(A260A310) 稀釋dsDNA=50(A260A310) 稀釋ssRNA=40(A260A310) 稀釋熒光分析法二苯胺顯色分子篩; 電荷效應UVEB熒光凝膠電泳技術凝膠成像系統Rf、分辨力的影響因素大小, 構型ge

3、l濃度電壓、時間buffer凝膠濃度 片段大小/kb 0.3 560 0.6 110 0.7 0.820 1.0 0.58 1.2 0.46 1.5 0.23 2.0 0.12緩沖液及其pHTBE: 緩沖力大長 : TAETBE短: TAE分辨力低如何防止pH和離子強度改變?RNA的檢測A260變性膠28S4.5 kb18S2.1 kbPAGE尿素buffer: 0.51TBE同位素或熒光標記測序、多態性分析40kb: Rf與分子大小無關交替改變的電場,線團束狀脈沖場凝膠電泳改變形狀所需時間不同膠孔中摩擦力不同A-+AB-+BB+A-+A-B脈沖電場電泳示意圖A-+AB-+B垂直交變電場系統場

4、翻轉系統箝位勻強電場系統旋轉膠系統A-+AB-+BA-+AB-+B-+影響分辨率的因素脈沖時間(0.1s-1000s): 長脈沖,大片段電壓: 場強,最大片段范圍電場夾角: 110120溫度: 4 4.2 分子雜交技術Southern blotNorthern blotWestern blotdot blotFISH菌落原位雜交4.2.1 探針與探針標記寡核苷酸片段ss or ds足夠長度不含互補區5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 Mg2+ 5dNTP 5ppp dA(-32P-dATP)5 G-C-T-C A

5、-G-C-T-G-G-A-G-T 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 DNase IDNA pol I1. 探針的標記隨機引物標記5末端標記5 HOOH 3 OH 5 T4-PNKMg2+ pppATP (-32P-dATP)5pp 5 3 HO3 HOOH 3 2. 標記物及其檢測標記物及性質 標記方法 雜交體檢測法地高辛: DIG RPL 酶標抗體-底物顯色生物素: Bio-16-dUTP NT,TL,PCR 酶標親合素顯色熒光素: 羅丹明,FIT

6、C 合成法 熒光顯微鏡放射性標記非放射性地高辛系統標記dUTP-連接臂-甾醇半抗原DIG抗體-顯色酶交聯復合物生物素標記GCTTGAGCAGTAACCTG顯色酶Biotin Avidin 烷烴連接臂生色底物顏色產物熒光素標記GCTTGAGCAGTAACCTG熒光素Biotin Avidin烷烴連接臂4.2.2 Southern雜交質粒鑒定、基因位置、分子診斷酶切和電泳法可以嗎?4.2.3 Northern雜交樣品, 電泳, 探針不宜堿變性勿低鹽buffer洗膜膠中無EB4.2.4 Western雜交電泳, 印跡, 免疫學主要步驟SDS, blot雜交(AP或HRP)Semi-dry trans

7、fer system斑點雜交4.2.5Allele-specific oligonucleotide (ASO) dot-blot hybridization can identify individuals with the sickle cell mutation. The schematic dot-blot at top shows the result of probing with an ASO specific for the normal -globin allele (A-ASO). The results are positive (filled circle) for n

8、ormal individuals and for heterozygotes but negative for sickle cell homozygotes (dashed, unfilled circle). The dot-blot at the bottom shows the result of probing with an ASO specific for the sickle cell -globin allele (S-ASO), and in this case the results are positive for the sickle cell homozygote

9、s and heterozygotes but negative for normal individuals. The A- and S-ASO were designed to be 19 nucleotides long in this case chosen from codons 3 to 9 of respectively the sense A and S globin gene sequences surrounding the sickle cell mutation site. The latter is a single nucleotide substitution (

10、AT) at codon 6 in the -globin gene, resulting in a GAG (Glu)GTG (Val) substitution (see middle sequences).制片探針制備雜交鏡檢、拍照4.2.6 FISH雜交基因檢測新技術使膀胱癌確診提前“FISH技術在膀胱癌檢測中的臨床應用研究”,為期2年,對4809例患者開展了臨床檢測實驗.結果:比臨床常規檢查,膀胱癌確診提前36 m雜交探針和檢測試劑已實現國產化,質量穩定可靠,價格比進口產品降低近七成4.2.7 菌落(斑)原位雜交陽性重組子檢測菌落 ?文庫菌斑 ?文庫4.3 PCR擴增技術鏈式反應動物

11、單拷貝GSince its discovery in 1983 the polymerase chain reaction has revolutionized molecular biology. Today, new forms of PCR and the related techniques of cloning are finding new applications at the cutting edge of biomedicine. 4.3.1 基本原理離體合成幾何級數平臺效應4.3.2 反應體系模板引物Taq 酶dNTPs緩沖液DNA or mRNA模板純度數量引物的設計16

12、30 nt, GC含量連續互補堿基3 3正確配對5可被修飾簡并引物耐熱的DNA polTaq酶Pfu酶35校讀高保真緩沖液pH、離子強度Mg2+,酶活Mg2+,非特異引物退火4.3.2 基本過程變性退火延伸擴增精確性的影響因素引物: 1 mol/LdNTPs: 20200 mol/LMg+2: 0.52.5 mmol/Lhot start4.3.3 PCR技術的改進nested PCRinverse PCRanchored PCRRT-PCRin situ PCR實時定量PCR1. 巢式PCR嵌套引物外引物內引物2. 反向PCRX、Y未知序列酶R消化環化再酶切擴增反向PCR的特點難選適當的限制

13、酶擴增的長度有限自身環化效率低3. Anchored PCR錨定引物A擴增產物鑒定特點擴增未知序列無需酶切及連接操作簡單特異性高4. RT-PCR5. 原位PCR原位擴增, 雜交, 定量不需抽提模板靈敏度高100病毒檢測、腫瘤發生率通過對PCR擴增反應中每一個循環產物熒光信號的實時監測,實現對起始模板定量分析的方法6. 實時熒光定量PCRFRET技術; 熒光標記探針擴增、雜交、光譜、實時檢測熒光信號積累,起始模板量熒光定量PCR的原理起點定量與終點定量起點天然重現性好終點加工誤差大熒光擴增曲線的三個階段背景信號階段指數擴增平臺期幾個參數的確定臨界點循環數(Ct)標準曲線基線閾值Ct值DNA0閾

14、值缺省: 3-15個循環的熒光信號的標準偏差的10倍Log濃度與循環數的關系起始數越多,Ct值越小標準曲線樣品Ct值初始模板量DNA產物的熒光標記非特異性熒光標記SYBR Green I特異性熒光標記TaqMan探針分子信標 SYBR Green法只有和dsDNA結合后才發熒光變性時,DNA雙鏈分開,無熒光延伸結束階段采集熒光信號與非特異的dsDNA結合發光,必須在反應結束時做融解曲線分析SYBR Green融解曲線分析PCR反應體系的建立及優化染料:太高抑制Taq酶活性;太低,熒光信號太弱,不易檢測引物:擴增有雜帶,定量不準Mg2+:1.5mM,減少非特異性產物T & T:由酶和引物決定SY

15、BR Green法優缺點對模板無選擇性使用方便,無需探針靈敏;便宜非特異性結合,產生假陽性對引物特異性要求較高5-R; 3熒光淬滅基團(Q)探針完整,R發射的熒光能量被Q吸收,無熒光; R與Q分開,發熒光Taq酶: 53外切酶活性 TaqMan法TaqMan水解型雜交探針原理當一個熒光分子(供體)的熒光光譜與另一個熒光分子(受體)的激發光譜相重疊時,供體熒光分子自身的熒光強度衰減,FRET熒光共振能量轉移擴增1條DNA釋放1個熒光分子熒光信號的累積與PCR產物同步TaqMan法PCR反應的建立PP的設計: 探針Tm為70,30bp, 5非G; 引物Tm為60反應參數: 95 3, 94 15s

16、, 60 60s,40循環PP優化:獲得最小Ct值,最大信號/背景比值primer: 50-900nM; probe: 50-250nMTaqMan法優缺點對目標序列的高特異性引物設計相對簡單重復性比較好只適合一個特定的目標委托公司標記,價格較高 分子信標與擴增產物結合產生熒光,信號的強弱靶序列的多少發夾型熒光探針R與Q接近,產生FRET探針-模板配對,構象改變R與Q分離熒光熒光定量PCR的特點實時檢測特異性強定量精確無需跑膠4.4 DNA測序化學降解法末端終止法G反應: DMS使G、A甲基化G+A: 哌啶使G斷裂T+C: 肼使嘧啶環斷開,哌啶除去堿基C反應: 高鹽下,僅C與肼反應,C末端 1

17、. Maxam-Gilbert化學降解法距標記末端250nt非酶促合成測序,無需引物對合成的寡核苷酸測序蛋白質與DNA的相互作用特點2. Sanger酶學法基本步驟模板純化測序反應模板,引物, Pol, dNTPs (dd)4個反應4組產物 PAGE自顯影X光片上樣電泳放射自顯影測序與PCR的比較 測序 PCR引物 1條 1對合成 線性 指數底物 dNTP和dd dNTP產物 系列長度片段 1條帶CAGTtemplateprimerdATP,dNTPpolymeraseterminator3. DNA全自動測序同位素標記熒光標記單色熒光多色熒光時間長序列短污染大操作難放射自顯影膠圖多色熒光標記

18、templateprimerdNTPpolymeraseterminatorCGTAABI Prism 3100-Avant遺傳分析儀的多種應用基本步驟模板的純化與定量測序反應PCR儀產物的純化與變性上樣電泳測序儀結果分析Automated DNA sequencing with fluorescently labeled ddNTP. (A) The chain termination reactions are carried out in a single tube, with each ddNTP labeled with a different fluorophore. In the

19、 automated sequencer, the bands in the electrophoresis gel move past a fluorescence detector, which identifies which ddNTP is present in each band. The information is passed to the imaging system. (B) The printout from an automated sequencer. The sequence is represented by a series of peaks, one for

20、 each nucleotide position. In this example, a green peak is an A, blue is C, black is G, and red is T. 4. DNA測序技術進展傳統測序技術的缺陷及新進展序列不可能太長費時費力準確度不高結構復雜序列雜交法質譜法DNA芯片法單分子法4.5 DNA的定點誘變盒式取代切除; 合成; 轉化olig介導PCR誘變olig片段退火合成轉化olig介導的誘變Oligonucleotide mismatch mutagenesis can create a desired point mutation at

21、a unique predetermined site within a cloned DNA moleculePCR誘變4.6 DNA與蛋白質互作分析Y2H systemY1H systemgel retardation assaysDNase I footprinting1. 酵母雙雜交(Y2H)GAL4 proteinBD與UAS結合AD激活lac Z單獨不起作用GAL1 UAS啟動子lac Z reporterGAL1 UAS啟動子lac Z reporterXGAL4BDGAL1 UAS啟動子lac Z reporterYGAL4ADAB重組質粒的構建穿梭載體GAL4菌 GAL1 UAS啟動子lac Z reporterX