1、重組人胸腺肽1在大腸桿菌中的表達純化與鑒定尹鳳紅1,2，肖清江2，周衛東2，陳清西1* (1.廈門大學 生命科學學院，福建 廈門361102； 2.廈門特寶生物工程股份有限公司，福建 廈門361022) 摘要：采用大腸桿菌作為宿主表達重組人胸腺肽1 (rhT1)融合蛋白，純化獲得rhT1并對其鑒別于300 L發酵罐進行中試發酵表達rhT1融合蛋白；經IPTG誘導，離心發酵液收集菌體，菌體經破碎、離心、親和層析捕獲，獲得融合蛋白；每升發酵液可獲得約170 mg硫氧環蛋白-胸腺肽1融合蛋白融合蛋白經腸激酶酶切后、經親和層析、反相層析、體積排阻層析等純化步驟，獲得高純度rhT1；通過本純化工藝獲得的

2、rhT1原液經SDS和HPLC-SEC的檢測純度均大于99%；采用玫瑰花結形成率測定rhT1活性與市售化學合成胸腺肽（日達仙）標準品一致；質譜分析分子質量為3066.59 u，分子質量大小與去乙?；膔hT1理論分子質量(3066 u)一致；N端測序結果與理論值一致說明本工藝可實現工業化規模生產關鍵詞：重組人胸腺肽1蛋白；表達；純化中圖分類號：Q 3561 文獻標志碼：A 文章編號： 收稿日期：2015-03-30基金項目：國家高技術研究發展（863）計劃（2007AA021604）*通信作者： HYPERLINK mailto: 胸腺素1（Thymosin-alpha 1，T1）作為免疫調節

3、因子，可以啟動T淋巴細胞的成熟，刺激分泌干擾素及各種淋巴細胞介素，以及增強自然殺傷（NK）細胞介導的細胞毒性對T1的臨床研究主要集中在治療乙型肝炎及丙型肝炎方面，能夠顯著增強機體免疫力，對肝炎病毒的復制繁殖具有顯著的抑制作用 1-3；也有有關T1治療肺癌等腫瘤及其他免疫缺陷疾病的報道4-51977年由Goldstein等首次在胸腺組織內發現人胸腺肽1是由28個氨基酸組成，N端乙?；乃嵝远嚯?，其相對分子質量為3108 u、等電點為4.2、分子中有6對重復氨基酸殘基；氨基酸序列為：N-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile- Thr-Thr-Lys

4、-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-C6目前人胸腺肽1生產工藝主要有兩種：一種是生化提取法，另一種是化學合成法生化提取材料來源受限，有效成分胸腺肽1含量低（小于1%），成本高；化學合成的胸腺肽1雖然已經臨床應用，但價格昂貴，在合成過程中污染環境當前臨床用藥以合成法生產的胸腺五肽和T1為主，其銷售金額占據國內該類藥物93% 的市場份額7采用基因工程技術生產的rhT1通過查詢CFDA暫未有獲批產品有關基因工程技術表達純化的rhT1暫時還停留在實驗室水平，發酵規模從搖瓶至20 L不等8,9 本文采用基因工程技術，構建高效表

5、達rhT1的表達菌株，在中試規模下，發酵表達并分離純化，獲得高純度、高活性的rhT1，為rhT1產業化大生產打下堅實的基礎1 材料和方法1.1 材 料大腸桿菌TOP10/ pThioHis A-T1 基因工程菌株由本實驗室構建并保存；酵母提取物和蛋白胨為Oxoid公司產品，丙烯酰胺為Promega公司產品；Chelating Sepharose Fast Flow、Q Sepharose Fast Flow、SOURCE 30RPC及G-25填料為GE公司產品；T1標準品（日達仙）購自SciClone；其它試劑均為國產分析純實驗使用主要儀器：30 L、300 L全自動發酵罐，BBraun Bi

6、otech公司；全溫振蕩器，哈爾濱東明醫療器械廠；離心機，BECKMAN公司；P2B005A01超濾膜，Millipore公司；Basic 100蛋白純化儀，GE公司；MALDI-TOF MS，Bruker公司；N端蛋白序列分析儀，島津公司； 1.2 方 法1.2.1 rhT1 融合蛋白的發酵表達取rhT1工程菌株TOP10/pThioHis A-T1，按1：400（體積比）接種于150 mL LB培養基/1000 mL三角瓶，37 、200250 rpm培養68 h為一級種；一級種子按1：200（體積比）接種至24 L LB培養基/30 L種子罐，37 、200250 rpm培養68 h為二

7、級種二級種按1：6（體積比）接種到含150 L LB培養基的D300發酵罐中，37 ，DO 30%60%培養，待菌液濃度達OD600nm=3.0，用含1 mmol/L IPTG的氮源補料液1.5 L于2 h內流加誘導，過程中補加碳源或2 mol/L NaOH以維持pH 7.0，誘導總時長約7 h1.2.2 菌體收集和破碎發酵完畢，離心收集菌體，菌體用pH 8.0的20 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris-HCl緩沖液重懸后采用35 MPa高壓破碎2次；再用高速冷凍離心機以10，10000 rpm離心40 min，獲得上清液1.2.3 rhT1融合蛋白的捕獲初步純化離心上清液，

8、上樣Chelating Sepharose Fast Flow（CS）層析柱，采用pH 8.0的20 mmol/L NaCl, 50 mmol/L Tris-HCl緩沖液和pH 8.0的20 mmol/L NaCl，50 mmol/L 咪唑，50 mmol/L Tris-HCl緩沖液，以梯度洗脫方式洗脫目的蛋白，按峰收集目的樣1.2.4 rhT1融合蛋白的酶解親和層析捕獲的rhT1融合蛋白，用5K超濾膜（0.1 m2）濃縮，超濾替換成pH 8.0的1 mmol/L CaCl2，50mmol/L Tris-HCl緩沖體系，收集樣品，并調節濃度至1 mg/mL；按摩爾比為1:30（EK酶/底物）的

9、比例，加入EK酶并混勻，48酶切16 h1.2.5 rhT1的分離純化取EK酶切后的樣品，首先通過Chelating Sepharose Fast Flow（CS）層析柱初步純化，上樣預先用pH 8.0的20 mmol/L NaCl, 50 mmol/L Tris-HCl緩沖液平衡的CS柱，收集樣在214 nm檢測進一步應用Q Sepharose Fast Flow（QFF）層析柱純化，將CS穿透樣上樣至預先用pH 8.0的20 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris-HCl緩沖液平衡好的QFF層析柱，用pH 8.0的250 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris-

10、HCl緩沖液洗脫目的多肽然后，將收集到的QFF柱后的目的多肽通過SOURCE 30RPC層析柱進行精細的純化，用流動相0.07%三氟乙酸-2.0%乙腈(體積分數)和流動相0.07%三氟乙酸-80.0%乙腈(體積分數)梯度洗脫，按峰收集目的多肽繼而用Q Sepharose Fast Flow層析柱純化，采用pH 8.0的400 mmol/L NaCl, 50 mmol/L Tris-HCl緩沖液洗脫目的樣品，收集獲得rhT1最后，精細分離純化后的樣品以不高于20%的柱床體積上樣Sephadex G-25 Medium分子篩，用pH7.0的10 mmol/L PBNa緩沖液洗脫，收集目的樣；0.2

11、2m過濾膜過濾除菌，分裝即為原液，-65以下凍存1.2.6 rhT1的純度檢測和理化性質鑒定采用脫E受體法測定T1活性，顯微鏡下計數不少于200個淋巴細胞的玫瑰花環，計算玫瑰花環形成率rhT1的純度鑒定采用SDS及高效液相（HPLC-SEC）的方法分析檢測SDS電泳的積層膠濃度為5%(質量分數)，間隙膠濃度10%(質量分數)，分離膠濃度16%(質量分數)；上樣量20 g，電壓80160V，考馬斯亮藍G250染色HPLC-SEC的方法樣品釋到0.2 mg/mL，取50 L上樣(10 g)，按面積歸一化法計算其純度 1.2.7 重組人胸腺肽1的氨基酸序列分析及質譜分子量檢定采用Edman降解法檢測

12、rhT1的N末端15個氨基酸序列，檢測分析委托中國醫學科學院基礎醫學研究所中國協和醫科大學基礎醫學院中心實驗室進行，儀器為PE/ABI PROCISE 491測序儀，檢測程序PL-PVDF-protein采用BRUKER公司REFLEXTMIII型基質輔助激光解吸電離/飛行時間（MALDI-TOF MS）質譜儀，MALDI-TOF MS法測定rhT1分子質量；基質為-氰基-4-羥基肉桂酸（HCCA）2 結果與分析2.1 rhT融合蛋白的發酵表達不同誘導時間的發酵液進行取樣，掃描后取相同OD600的菌體，高溫破碎，15%SDS電泳檢測，試驗結果見圖1-A，rhT1融合蛋白表觀分子質量約為19 k

13、 u，隨著誘導時間的延長，發酵的目的產物逐漸增加，誘導后4 h后表達穩定，隨著時間的延長可以獲得更多的生物量的積累利用軟件SmartView2001分析計算得到細胞裂解蛋白中融合蛋白所占比例為40%300 L發酵罐最終可獲得發酵液約190 L，離心可獲得3.3 k g菌體ArhT1融合蛋白發酵菌體裂解樣電泳圖：lane1：LWM ； lane3：rhT1 誘導0 h對照；lane4：rhT1 誘導1 h后；lane611：rhT1誘導27 h樣品 B菌體破碎及rhT1融合蛋白的CS捕獲電泳圖譜：lane1：LWM；lane3：CS層析柱清洗樣；lane5：發酵菌體處理上清；lane6：發酵上清

14、；lane7：破碎后離心沉淀處理上清；lane8：破碎后上清；lane9：CS層析柱穿透樣；lane10：CS層析柱目的樣圖1 發酵菌體裂解液、菌體破碎及CS捕獲電泳圖Fig.1. Analysis of T1 fermentation、crushing and capture by SDS2.2 菌體破碎菌體破碎后，進行SDS電泳檢測，試驗結果見圖1-B lane7，在高壓破碎的離心沉淀中無目標蛋白檢出（菌體高壓破碎的離心沉淀，重懸后進行煮沸裂解），lane8的破碎后上清中含有rhT1融合蛋白，證明細胞破碎完全，破碎條件合適2.3 rhT1融合蛋白的捕獲初步純化通過基因工程設計與構建，發酵表

15、達的rhT1融合蛋白N末端帶有6個His氨基酸，可特異性與CS層析填料結合，基于這個原理，采用CS層析填料來捕獲rhT1融合蛋白，并與其它蛋白或雜質分離含有rhT1融合蛋白的破碎上清通過CS層析柱后，rhT1融合蛋白特異性結合到層析柱上，而其它蛋白或雜質則穿透或被沖洗掉，然后通過洗脫液洗脫目的蛋白，獲得高純度的rhT1融合蛋白純化洗脫圖譜見圖2-A，電泳檢測圖譜見圖1-B，由圖1-B判斷，上樣的穿透樣(lane 9)及層析柱清洗樣（lane3）均為雜質，目的洗脫樣（lane10）為高純度的rhT1融合蛋白試驗結果顯示，采CS層析柱，在該純化條件下，捕獲分離效果良好，可獲得高純度的rhT1融合蛋

16、白3.3 kg菌體破碎并經親和層析捕獲后可獲得融合蛋白約33 g，折算每升發酵液可獲得融合蛋白173 mg，目的蛋白表達水平基本滿足工業化規模生產2.4 rhT1融合蛋白的酶切通過基因工程設計，表達的rhT1融合蛋白的N末端6個組氨基酸（His）通過腸激酶酶切識別氨基酸序列與rhT1連接，因此采用腸激酶酶切rhT1融合蛋白，以獲得正確氨基酸序列的rhT1EK酶切的rhT1融合蛋白SDS檢測圖譜見圖3-A，由圖3-A lane1、lane3可見，48酶切16 h后，融合蛋白酶切效率達85%以上2.5 rhT1的純化2.5.1 rhT1的初步分離純化rhT1融合蛋白，經EK酶切后，目的蛋白rhT1

17、與組氨酸純化標簽斷裂分開，因此采用CS層析柱結合組氨酸純化標簽，而穿透為rhT1，由于穿透樣品濃度稀，體積大，不利于進行后續純化處理，因此采用QFF層析柱濃縮CS穿透樣品因胸腺肽一級結構中無含苯環氨基酸，280nm檢測收集樣品不靈敏，故采用214nm檢測收集樣品CS及QFF純化洗脫圖譜分別見圖2-B和圖2-C，電泳檢測圖譜見圖3-A，由圖3-A可見，CS層析的穿透樣表觀分子質量大于2.5ku，為rhT1，經QFF濃縮后，無明顯雜質2.5.2 rhT1的精細分離純化為了獲得高純度的rhT1，進一步采用反相分離技術，分離去除rhT1的相關蛋白或雜質后，再用QFF層析柱去除有機溶劑和濃縮目的樣品純化

18、洗脫圖譜見圖2-D、2-E，電泳檢測圖譜見圖3-B，由圖3-B可見，精細純化后再濃縮可獲得高純度的rhT12.5.3 rhT1的原液制備QFF層析柱精細純化后的rhT1用G-25 分子篩脫鹽替換為pH7.0，10 mmol/L PBNa緩沖液，收集目的樣；其洗脫見圖譜2-F，由圖2-F可見，目的樣品峰與離子峰分離效果良好，G-25層析柱收集到的樣品用0.22 m過濾膜過濾除菌，分裝即為原液，-65以下凍存 A. rhT1融合蛋白的CS捕獲圖譜；B. rhT1的CS層析初步純化圖譜；C. rhT1的QFF陰離子層析濃縮圖譜；D. rhT1的RPC反相層析精純圖譜；E. rhT1的QFF陰離子層析

19、濃縮圖譜；F. rhT1的G-25分子篩脫鹽圖譜圖2 rhT1的分離純化層析圖譜Fig.2. Purification of Thymosin1 by AKTA Basic 100A.融合蛋白酶切及CS柱捕獲小肽膠電泳圖譜；lane1：超濾濃縮樣（融合蛋白）；lane2：小肽Maker；lane3：EK酶切樣；lane46：CS柱穿透樣； lane7：洗脫雜質；Lane 8：QFF濃縮樣品. B. rhT1的精細分離純化電泳圖譜；lane1：小肽Maker；lane26：RPC反相層析peak 15；lane7：QFF濃縮樣.圖3 T1純化樣品電泳檢測圖譜Fig.3. Analysis of

20、Thymosin1 by SDS2.6 rhT1原液活性、純度檢測及理化性質鑒定2.6.1 rhT1原液活性檢定胸腺肽可使脫E受體后的胸腺T細胞恢復其E受體功能，從而反映胸腺肽的生物活性本檢測參考胸腺肽溶液質量標準脫E受體法測定玫瑰花結增加率反應T1活性結果見表1，自制rhT1的玫瑰花結增加率為50.0%，市售化學合成的胸腺肽1（日達仙）的玫瑰花結增加率為53.3%，相比較空白均有明顯提高；另外本次檢測自制樣品活性為日達仙的96%，基本一致表1. rhT1活性計算Tab.1. calculation activety of rhT1編號樣品花環形成率/%活性增加量/%花環增加率/%T/C值/%

21、B空白21.2TrhT1(自制)31.810.650.095.5C日達仙(市售)32.311.153.3注：活性增加率增加量/空白.2.6.2 rhT1純度檢定1）采用SDS電泳檢測rhT1的純度以日達仙作為參照品，分別上樣控制帶5%，2%，1%，電泳結果（見圖4）表明：供試品中無可見雜蛋白，樣品的電泳純度大于99%lane1：LWM； lane2：空； lane3：rhT1供試品 20 g；lane4：空；lane5：日達仙 20 g；lane6：日達仙1 g；lane7：日達仙 400 ng；lane8：日達仙 200 ng.圖4 rhT1供試品16%SDStricine電泳檢測圖譜Fig

22、.4. Analysis of Purity rhT1 product Detector by tricine SDS2）采用HPLC檢測rhT1的純度HPLC-SEC檢測方法進行本樣品的關鍵純度檢測重組人胸腺肽1 HPLC-SEC的檢測結果見圖5，結果表明檢測樣品中rhT1的峰面積占總面積的99.84%，表明有關物質遠小于5%的注冊標準10（制劑）圖5. rhT1原液 HPLC-SEC 檢測圖Fig.5. Analysis of Purity of rhT1 by HPLC-SEC2.6.3 重組人胸腺肽1鑒別檢測1）rhT1的N端氨基酸序列測定N端序列測定是蛋白質及多肽一級結構確認的重要組

23、成部分，也是重組蛋白藥物質量控制的必檢項目經N端氨基酸序列測定，rhT1樣品N-末端15個氨基酸殘基序列為N-SDAAV DTSSE ITTKD-C檢測結果與已知rhT1的N-末端氨基酸殘基序列一致2）rhT1質譜法測定分子量檢測結果：供試品rhT1質譜檢測分子質量為3066.59 u（見圖6），分子質量大小與去乙?；腡1理論分子質量(3066 u)一致圖6 MALDI-TOF MS法測定rhT1分子質量Fig.6. Mass spectrum of rhT1 by MALDI-TOF MS3討 論目前常用的制備低分子量多肽的基因工程重組技術有兩種，一種是通過串聯多個目標基因來獲得高表達，雖

24、然該方法已有較多成功例子，但是本實驗室嘗試使用四段或兩段多肽的串聯表達，結果均未見目的蛋白表達，因此本實驗室放棄該方法；另一種方法是通過融合表達，其優點是融合蛋白可攜帶純化標簽，可通過親和層析高效獲得高純度目的蛋白，大大簡化了下游純化工作，因此本實驗室采用第二種方法制備重組人胸腺肽1本方法主要分為3個純化部分：1）采用CS親和層析作為捕獲步驟，捕獲帶有純化標簽的目標蛋白，快速的與細胞破碎后釋放的酶、核酸、菌體蛋白、內毒素以及色素分離，有利于融合蛋白的穩定；2）EK酶切后蛋白首先用CS親和層析純化，存在于酶解混合物中的硫氧還蛋白以及少量未被酶解的融合蛋白由于分子中仍存在His-tag序列，因而被

25、吸附于CS柱上，而酶解釋放出來的游離rhT1則出現在穿透峰中；3）將穿透目標樣品用QFF柱濃縮后，再經SOURCE 30RPC反相層析進行精純，再次濃縮后替換緩沖體系，即為rhT1純品樣品活性、純度分析及鑒別，采用脫E受體法測定T1活性，以日達仙作為參考品，其活性相當；用質譜檢測rhT1分子質量為3066.59 u，與去乙?；膔hT1理論分子質量3066 u相符；rhT1樣品N-末端15個氨基酸殘基序列為SDAAVDTSSE ITTKD，檢測結果與已知胸腺肽1的N-末端15個氨基酸殘基序列為一致； SDS結果表明，rhT1純度超過99%；HPLC-SEC純度為99.84%，遠大于5%的注冊標

26、準本檢測中使用的參考品為市售胸腺肽1，商品名為日達仙，其為化學合成，分子質量與天然的胸腺肽1一致為3108u相關報道稱采用基因工程重組技術得到N端未乙酰化的胸腺肽1，其全部化學性質和體外生物活性與化學合成的胸腺肽1及天然的胸腺肽1相一致11，本實驗室結論與其一致用該方法生產胸腺肽1比用化學合成生產的胸腺肽1成本大為降低，與生化提取方法相比，又具有操作簡單，易于放大、工藝取材不受限制以及活性高等優點，本實驗獲得高純度的重組人胸腺肽，為重組T1的工業化生產提供可靠的技術支持參考文獻：1 Sugahara S. Ichida T. Yamagiwa S. et al. Thymosin-alpha1

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