1、腫瘤相關基因分類和技術研究路線腫瘤相關基因癌基因抑癌基因腫瘤轉移基因腫瘤轉移相關基因腫瘤轉移抑制基因癌基因（oncogene）病毒癌基因virus oncogene（v-onc）細胞癌基因cellular oncogene（c-onc）原癌基因 proto-onc病毒癌基因virus oncogene（v-onc）1968年 Duesberg 等首次發現 Rous 肉瘤病毒基因組 編碼酪氨酸蛋白激酶 基因，證實它在細胞轉化中起關鍵作用來自病毒，因而被命名為病毒癌基因細胞癌基因cellular oncogene（c-onc）1972年Bishop 核酸分子雜交法證實：幾乎在所有高等動物細胞基因組

2、中，都有和v- onc相似的DNA序列這些序列是細胞基因組的成員之一，其編碼的產物具有重要的功能細胞癌基因在正常情況下的表達有時間、空間限制，表達產物參與細胞分化、增殖原癌基因（proto-onc）未激活的細胞癌基因在人體正常細胞中存在是一種正常基因作用：調控細胞生長和分化廣泛存在于生物界中，從酵母到人的細胞中都存在原癌基因的分類按原癌基因的結構、產物的功能、所在的位置分為下列四類： 1. 蛋白激酶類 2. 信息傳遞蛋白類 3. 生長因子及其受體類 4. 核內蛋白類細胞癌基因與致癌癌基因在生物進化中具高度保守性正常細胞中的癌基因和腫瘤細胞中的癌基因的核苷酸順序十分相似，后者可使NIH 3T3

3、細胞惡性轉化，前者需經激活后才具有轉化能力說明：在正常情況下細胞癌基因不致癌，生理條件下內外環境中的某些刺激可激活癌基因，從而調節細胞的生長、分化和信息傳遞通常認為：癌基因并不是腫瘤所特有 是細胞的正常基因 能誘導正常細胞發生轉化，并使正常細胞獲得一個或多個新的生物特性的基因只有在被激活后發生異常表達時，才會導致細胞發生惡性轉化細胞癌基因的生理功能主要表現為： 調節細胞生長 參與細胞分化和發育過程具有正常生理功能的同時又具有潛在致癌能力的原癌基因，其致癌潛能的發揮，首先需要被激活常見的激活因素：病毒 化學物質 輻射原癌基因的激活機理 1. DNA重排 2. 基因放大 3. 點突變 4. 其它調

4、控的異常DNA 重排插入具有高活性的啟動子或增強子，使原癌基因持久、過量地表達負調控區的失活或丟失DNA 重排1 插入具有高活性的啟動子或增強子，使原癌基因持久、過量地表達插入的啟動子或增強子來自細胞外（外源性）如：雞B淋巴細胞瘤由于ALV的LTR插入 c-myc 的旁側（5或3端），使c-myc過量表達插入的啟動子或增強子來自細胞內（內源性）如：內源性逆轉錄病毒的LTR染色體易位是原癌基因DNA重排的典型例子人B淋巴瘤中免疫球蛋白基因與c-myc的重排，使c-myc激活c-myc基因定位于8q24， Ig 、Ig 、Ig 鏈的基因位點分別定位在14q32、2p13和22q11c-myc易位到

5、Ig位點的高活性轉錄區，從而組成一個高轉活性的重排基因，啟動c-myc轉錄，使 c-myc表達增強，促進細胞惡變，最后導致腫瘤的發生DNA 重排1 插入具有高活性的啟動子或增強子，使原癌基因持 久、過量地表達DNA 重排2 負調控區的失活或丟失小鼠c-myc，c-fos，c-mos等原癌基因在旁側順序具有抑制轉錄啟動的負調控區人c-myc的負調控區在5端428-1188bp處，而在B淋巴瘤中，該區有多點突變或部分丟失Duesberg 提出：1號外顯子被切斷時，ras基因即被激活雖然這一結論還有待更多實驗證實；但是，原癌基因上游或下游旁側順序存在負調控區（并不是個別現象），因而使原癌基因被激活的

6、可能性大為減少點突變在 ras 基因族，在人體腫瘤中已從膀胱、小細胞肺癌（Ha-ras，Kit-ras），胃（N-ras），乳腺（Ha-ras）等證明在12或61號編碼子出現點突變所導致一個氨基酸的置換突變（一個氨基酸置換）可使其編碼產物蛋白p21的 GTPase 活性明顯下降，從而影響p21的生物學活性基因放大基因擴增，可導致基因過量表達基因放大一般被認為與惡性演進有關，未必是惡性早期的改變在人體腫瘤中，如：人肝癌中出現 N-ras 重排及其基因放大小細胞肺癌中 c-myc 及 L-myc 基因放大與癌轉移可能有關神經母細胞瘤中 N-myc 基因放大明顯與病程發展有關其它調控的異常反式（Tr

7、ans）調控系統轉錄后的調控異常反式（Trans）調控系統已證明某些基因產物可影響其它基因的轉錄，如：病毒HTLV-，中TAT（LOR）區SV40中的某些片段RSV的gag區原癌基因很可能會接受其它基因（包括病毒的基因產物）的控制或影響值得注意的是： v-myc 進入細胞后，可關閉細胞本身c-myc的表達，同時，c-myc激活后亦可使另一個正常表達的 c-myc 等位基因關閉，提示：myc 產物或由myc 誘導產生的物質對c-myc的轉錄發生Trans的負控制轉錄后的調控異常成纖維細胞經生長因子處理后，結果：c-myc 的mRNA量增高轉錄水平并不改變說明：mRNA轉錄后加工或穩定性的改變基因

8、的轉錄后調控：當前了解甚少，原癌基因的轉錄后調控的異常了解的更少抑癌基因 tumor suppressor gene腫瘤抑制基因（抗癌基因）最早由A.Knudson Jr.提出細胞內一類抑制腫瘤發生、生長的基因，最近又發展為指能對抗癌基因作用的基因在生物體內與癌基因功能相抵抗，共同保持生物體內正負信號相互作用的相對穩定腫瘤抑制基因的失活和癌基因的激活都是癌化過程的一部分抗癌基因主要功能(1) 誘導終末分化(2) 維持基因穩定 (3) 觸發衰老，誘導細胞程序性死亡 (4) 調節細胞生長 (5) 抑制蛋白激酶活性 (6) 改變DNA甲基化酶活性 (7) 調節組織蛋白酶活性 (8) 調節血管形成 (

9、9) 促進細胞間聯系腫瘤細胞轉移基因與轉移抑制基因腫瘤細胞轉移基因的激活和/或轉移抑制基因失活均可誘發腫瘤細胞轉移表型而導致轉移的發生原發部位腫瘤組織中具有轉移潛性的細胞群是腫瘤轉移的細胞生物學基礎目前發現：癌基因 有100多個抗癌基因 有7個轉移基因（metastasis gene）有一些?直接促進轉移發生的關鍵基因，其存在或表達增強會引起侵襲轉移的發生轉移相關基因（ metastasis-asscciated gene ） 有一些?只涉及轉移的某個階段，并非參與整個轉移過程目前發現：轉移抑制基因（metastasis suppressor gene）有一些？Soble認為：凡是能抑制腫瘤轉

10、移的基因均可命名為轉移抑制基因抑制腫瘤細胞的轉移表型研究表明，腫瘤的轉移與轉移基因激活或轉移抑制基因失活有關，是多種轉移相關基因及轉移抑制相關基因綜合作用的結果腫瘤相關基因的發現和深入研究的意義： 提高了人們的認識細胞增殖與分化的調控機制惡性腫瘤的發生，發展規律腫瘤浸潤轉移機制 為腫瘤的診斷提供了嶄新的途徑 腫瘤的發生、轉移與某些特定的癌基因密切相關，對這些癌基因及其產物的檢測，為腫瘤的臨床診斷提供了一條嶄新的途徑，必將受到臨床實驗室技術人員和腫瘤工作者的重視ras 癌基因 參與人類腫瘤的發生發展最初在急性轉化性逆轉錄病毒實驗中，從Harvey、Kirsten兩株大鼠肉瘤病毒中克隆出的轉化基因

11、自82年 Weinberg 等人發現人膀胱癌細胞系中有活化的H-ras基因后，對ras在人類腫瘤發生發展中所起的作用引起了極大關注目前研究認為：ras癌基因 參與細胞生長和分化的調控 參與多種腫瘤的形成與發展ras 基因家族家族中與人類腫瘤相關的特征性基因有： H-ras 定位于11號染色體 是大鼠肉瘤病毒的轉化基因 K-ras 定位于12號染色體 是大鼠肉瘤病毒的轉化基因 N-ras 定位于 1號染色體 人神經母細胞瘤中分離得到ras 基因家族ras家族的基因所共有的特征為： 1. 基因組中有5個外顯子：4個編碼的外顯子和1個5端非編碼外顯子 2. 外顯子所編碼的蛋白為188-189 個氨基

12、酸殘基，分子量為21kD（p21蛋白），此蛋白具有高度特異性和同源性，尤其在氨基酸序列的前80個氨基酸殘基中，幾乎無種屬間差別，具有高度保守性正常ras蛋白具有以下特點：p21（ras蛋白）位于細胞膜的內側面，以軟脂酸共價鍵形式固定于脂質雙層膜的內表面對GTP和GDP具有高度親和力，并具有同源性GTP酶的活性 ras 蛋白ras蛋白的生化性質與G蛋白非常類似G蛋白具有從膜結合受體到腺苷酸環化過程的信號傳導作用，提示：ras蛋白可能也具有信號傳導通路的作用目前，尚未發現ras蛋白作用的特異受體和靶細胞G蛋白G蛋白ras 蛋白有人推測：在哺乳動物細胞中 ras蛋白作用的靶分子：很可能是磷脂酶C磷脂

13、酶C 信號傳遞途徑的一個重要成份被激活后的磷脂酶CPIP2 IP3 + DGIP3和DG是促進細胞增殖的第二信使現已證實，在ras癌基因轉化的細胞中IP3 ，DG和PIP2的含量均明顯多于未轉化的細胞ras基因激活機制：原癌基因的激活過程稱為活化活化后的ras基因能使NIH 3T3細胞系轉化為腫瘤細胞ras基因活化的主要方式有：(1) 編碼區內的突變(2) 插入激活突變激活 ras 基因家族的主要激活方式在實體瘤中占1015%目前較公認：ras基因突變點位于三種 ras 基因的第12、13、59或61位氨基酸密碼子Seeburg等采用定點突變技術，對H-ras基因第12位密碼子甘氨酸的所有置換

14、氨基酸的可能性進行了分析，結果表明，此位點上，除置換氨基酸為脯氨酸外，其余的置換氨基酸均具有轉化潛能，但有程度差異到目前為止，在腫瘤中尚未發現二個或三個位點同時突變插入激活ras 基因附近插入一個強啟動子（promoter）或增強子（enhaner）可使 ras 基因表達增強基因擴增，堿基缺失正常基因的擴增或非編碼外顯子的缺失也能使 ras 基因呈高表達但這兩種方式在 ras 基因激活中較少見ras蛋白目前認為：兩種形式活化非活化通常情況下，細胞內的ras蛋白分子處于非活化狀態非活化狀態下的ras蛋白特征:具有GTP酶活性能夠與GDP結合當ras蛋白受到信號傳遞通道上游某一外界因子的刺激時，使

15、GDP磷酸化變成GTP，隨后ras蛋白發生構象改變，成為活化狀態活化的ras蛋白與效應分子相互作用，實現生長信號的傳遞，而且這種作用發生，活化的ras蛋白會迅速失活，轉變為與GDP結合的非活化形式此過程主要是ras蛋白自身的GTP酶作用，它能催化GTP水解，使活化ras蛋白能立即轉變成為非活化狀態的ras蛋白活化的ras蛋白的生化性質ras基因的任何突變使正常的ras蛋白轉變為能夠使NIH 3T3 細胞轉化的蛋白，從生化角度上講，這種突變激活可分為二種(1)突變失去內在的GTP酶活性(2)突變改變了對GDP和GTP的親和力ras 蛋白功能取決于編碼蛋白的基因序列和與之密切相關的結構域突變激活的

16、常見位點多集中在GTP、GDP結合的domain附近結構的改變導致了ras蛋白的功能異常ras 基因的突變ras基因的突變：擾亂正常狀態下活化與非活化ras蛋白的這種平衡機制，使正常非活化的ras蛋白轉變成活化形式實際上，ras基因的12、13、61位密碼子的活化突變，并不影響p21蛋白與GDP和GTP的結合，但卻降低了p21蛋白自身GTP酶活性，使其水解GTP的速效大為降低，從而使ras蛋白維持于活化狀態，不斷激活靶分子，引起信號傳導的持續效應，導致細胞大量增殖，而發生惡性轉化理論上ras 蛋白維持于活化狀態有三種可能機制(1)ras蛋白自身GTP酶活性降低，使GTP水解減少(2)GDP與G

17、TP間的交換增加(3)誘導了不需與鳥苷酸結合的ras蛋白的活化構象有人推測：ras蛋白的調節機制可能與其本身所具有的一種“開放”、“關閉”構型有關，構型處于“開放”時，能活躍地傳導特定的生長信號；而“關閉”時則不能傳導。如關鍵位點（12、13或61位密碼子）發生了點突變，則使這種構型的開關不能再回轉到閉合狀態，使活化的 ras 蛋白持續傳導一種不適當的生長信號ras 基因與人類腫瘤82年以來，在膀胱癌、乳腺癌、結腸癌、腎癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、及造血系腫統瘤中，均檢出了ras癌基因的異常Pulciani等人研究表明，被檢腫瘤DNA中所含活化ras基因僅占1020%（似乎ras癌基因在人類

18、腫瘤發生發展中并非起主要作用）事實上，ras癌基因參與多種腫瘤的發生發展，只不過突變率相差很大ras 基因與人類腫瘤不同腫瘤類型，ras基因的突變率相差明顯，如：最高的是在胰腺癌中（90%） ，其次是甲狀腺癌（53%）和結腸癌（47%）突變ras基因的種類與某些腫病類型密切相關，即有優勢激活現象。如胰腺癌、結腸癌、肺癌等以K-ras突變為主，造血系統腫瘤多發現N-ras的突變，泌尿系腫瘤則以H-ras突變為主ras 基因與人類腫瘤目前的資料表明H-ras和K-ras的表達不僅與膀胱癌、腎盂癌、肺癌、結腸癌有密切的關系，而且也與膽囊癌、胰腺癌、腎母細胞癌、慢性淋巴細胞白血病、黑色素瘤形成密切相關

19、N-ras 表達水平上升主要發生在造血系統的惡性腫瘤中，如APL、AML、BL，但在神經母細胞瘤、纖維肉瘤，橫紋肌肉瘤中的表達也有一定的上升，并認為是這些腫瘤形成的主要原因檢測ras突變對了解腫瘤的發生發展，以及監測惡性腫瘤的治療效果具有重大意義c-myc 癌基因c-myc基因是myc基因家族的重要成員之一c-myc基因是一種可易位基因是一種多種物質調節的可調節基因是一種可使細胞無限增殖，促進細胞分裂的基因myc基因參與細胞凋亡，c-myc基因與多種腫瘤發生發展有關人c-myc基因：定位于8q24Ig、Ig、Ig鏈的基因位點分別定位在14q32、2p13和22q11c-myc易位到Ig位點的高

20、活性轉錄區，從而組成一個高轉活性的重排基因，啟動c-myc轉錄，使 c-myc表達增強，促進細胞惡變，最后導致腫瘤的發生c-myc 癌基因結構c-myc與禽類髓細胞病毒（AMN）MC-29的v-myc同源c-myc基因由3個外顯子及2個內含子組成第一個外顯子不編碼，只起調節作用只有外顯子2和3與v-myc相對應，編碼一個439個氨基酸的蛋白質c-myc 癌基因結構c-myc基因由啟動子P1或P2起始轉錄，并在第一內含子中有一個潛在啟動子P，當第一個內含子發生斷裂時，P可被激活而成為一個異常轉錄起始點，但蛋白合成起始位點不變，并與正常c-myc基因產物相同不同的動物中，c-myc基因的第2、3外

21、顯子具有高度保守性，而第1外顯子則有較大的差異小鼠和人的外顯子1 有70%的同源性c-myc 癌基因的表達c-myc基因的表達與細胞的生長狀態有關：生長因子刺激成纖維細胞，c-myc表達增強相反，在細胞分化時c-myc表達降低在細胞培養過程中，用c-myc表達結構或反義寡脫氧核酸進行研究，發現c-myc在細胞G0期到S期的過程中也起作用表明c-myc表達的變化與細胞的增殖及分化狀態有關，其表達產物在調節細胞生長、分化或惡性轉化中發揮作用c-myc 基因表達產物的結構與功能c-myc基因的產物為磷酸化蛋白p62分子量為：62kD由c-myc基因的外顯子2和3共同編碼由439個氨基酸組成的蛋白質c

22、-myc基因屬核蛋白基因，定位細胞核內，產物為核蛋白c-myc 基因表達產物的結構與功能具有轉化細胞的能力具有與染色體DNA結合的特性在調節細胞生長、分化及惡性轉化中發揮作用c-myc蛋白在結構上可分為：轉錄激活區，非特異DNA結合區，核靶序列，堿性區，螺旋-環-螺旋（HLH）及亮氨酸拉鏈區螺旋-環-螺旋（HLH）亮氨酸拉鏈（leu zipper）c-myc 基因表達產物的結構與功能在 c-myc 蛋白中，螺旋-環-螺旋緊隨著堿性區，揭示其以特異性序列方式和DNA相互作用在以原核生物為實驗對象的研究表明：堿性區以一個自由環存在，當以特殊方式結合到DNA上時，則變成螺旋，該區是c-myc蛋白與D

23、NA特異序列的結合部位c-myc 基因表達產物的結構與功能c-myc中：還存在著與抑制細胞分化、自身抑制有關的區域腫瘤轉化所必需的區域Smith等研究了c-myc的亮氨酸拉鏈區，該區介導各種轉錄因子的二聚作用在亮氨酸重復部位的突變能顯著降低c-myc抑制鼠紅白血病（MEL）細胞分化能力此區的插入突變能消除c-myc的轉化活性認為：正是這些c-myc結構成分的表達阻止了細胞進入細胞周期，從而抑制許多細胞系的分化c-myc 基因表達產物的結構與功能Cronch等對c-myc亮氨酸拉鏈區的亮氨酸進行致突變研究發現：突變導致失去自身抑制說明：亮氨酸拉鏈區在自身抑制中具有重要作用c-myc 基因表達產物

24、的結構與功能Stone等研究認為：c-myc 分子的中間1/3以及N-端，C-端是腫瘤轉化所必需的，是c-myc基因與腫瘤轉化有關的區段（功能區域） c-myc功能區域，促使 c-myc在胞漿內合成后，與其它蛋白形成寡聚體，再轉移到核內，并結合到特異性的DNA序列上，從而激活和抑制許多靶基因的轉錄，引起細胞生長和分化的改變，發揮其生理調節功能及惡性轉化作用myc 蛋白參與誘導細胞凋亡細胞凋亡（Programmed Cell death，PCD）研究的深入，發現myc蛋白參與誘導細胞凋亡c-myc基因表達的失調是多種細胞凋亡的主要誘因細胞發生凋亡的速度及其對誘導因素的敏感性均依賴于c-myc蛋白

25、的含量尚未成熟胸腺細胞中：myc基因的高表達是胚胎胸腺細胞凋亡的誘因，而且在凋亡細胞的死亡階段，也觀察到c-myc基因的高水平表達，如果用反義寡核苷酸阻斷c-myc基因的表達，則細胞凋亡受到嚴重干擾myc 蛋白參與誘導細胞凋亡Evan發現，c-myc表達的失調也會啟動去除生長因子后培養細胞的成熟前凋亡觀察了小鼠IL-3依賴性髓樣細胞株32D，發現在洗去IL-3后，可立即觀察到c-myc基因表達下調，結果使培養細胞停止于G1期將攜帶c-myc基因載體轉染32D細胞，獲得穩定表達c-myc基因的32D細胞克隆，結果這種細胞去除IL-3后，不停止于G1期，而是啟動以凋亡為特征的程序性細胞死亡結果揭示

26、細胞凋亡是清除固定突變及細胞周期調控失衡的細胞的重要機制，一旦細胞發生障礙，c-myc基因會啟動凋亡程序，相反，則導致腫瘤形成myc 癌基因與人類腫瘤myc基因定位于染色體8q24Ig 、Ig、Ig鏈的基因位點分別在14q32、2p13和22q11在BL中：c-myc基因位點與Ig基因位點之間的易位，即c-myc易位到Ig位點的高活性轉錄區，從而組成一個高轉活性的重排基因，啟動c-myc轉錄，使 c-myc表達增強，促進細胞惡變，最后導致腫瘤的發生myc 癌基因與人類腫瘤在不同的人體腫瘤細胞系中，已發現c-myc或c-myc相關序列的擴增粒細胞性白血病細胞系視網膜母細胞瘤細胞系某些神經母細胞瘤

27、細胞系乳腺癌細胞系某些肺癌細胞系腸癌細胞系成骨肉瘤、軟骨肉瘤、脊索瘤、脂肪肉瘤、橫紋肌肉瘤myc 癌基因與人類腫瘤c-myc過量表達與腫瘤的早期復發有關在致瘤中，已發現ras與myc、sis與myc、myc與fos偶聯激活，協同致瘤等許多資料表明c-myc位點在所有受檢的B細胞腫瘤中有重排myc 癌基因與人類腫瘤Casares等：發現定位在8號染色體上的c-myc與定位在14號染色體上的Ig重鏈基因有同樣的的EcoR酶切片段，因而認為發生了814易位814易位可能是何杰氏淋巴瘤的一個標志N-myc在人神經母細胞瘤、視網膜母細胞瘤和小細胞肺癌中有擴增，擴增的程度與腫瘤的發病進程有關Schwab等

28、報告20%的神經母細胞瘤有N-myc擴增，其中大多數是侵襲性腫瘤myc 癌基因與人類腫瘤Seeger等報告，myc基因拷貝數的多少預示疾病的進程c-myc與小細胞肺癌30%的病例c-myc擴增，復發病人中myc擴增者的生存期短于沒有擴增的病例接受化療的腫瘤病人易引起myc擴增myc基因擴增與其它腫瘤的關系也有許多報道目前認為胃癌、乳腺癌、結腸癌、宮頸癌、何杰金氏病及頭部腫瘤等都有myc基因的擴增或過度表達nm23 基因nm23基因是腫瘤轉移抑制基因nm23編碼的產物具有抑制腫瘤轉移的功能nm23在分化良好的腫瘤中呈高水平表達，且nm23基因表達與淋巴結轉移呈負相關，與無病生存期，整個生存期呈正

29、相關檢測nm23基因的表達高低，可以作為判斷腫瘤有無轉移的一個重要指標nm23 基因及表達nm23基因：Steeg（美國國立癌癥研究所，1988）等，從7個轉移潛力不同的K-1735鼠黑色素瘤細胞株中用消減雜交分離克隆獲得nm23基因：在低轉移細胞株中的表達強度是高轉移細胞株內的10倍，表明nm23基因在高轉移腫瘤中表達降低人基因組中存在著兩個nm23基因，即nm23-H1，和nm23-H2，定位于、3nm23 基因及表達nm23-H1 mRNA 、nm23-H2 mRNA：由兩個完全不同的基因轉錄nm23-H1、nm23-H2：受兩個獨立的調控系統調節nm23-H1的mRNA的水平與癌細胞轉

30、移關系更密切 nm23 基因及表達nm23-H2基因與myc基因之間功能性連接nm23蛋白：轉錄因子Postel等研究：多肽PUF ，是myc轉錄的重要調節物， PUF可與c-myc啟動子特異區域相結合Postel等，從Hela細胞克隆了PUF cDNA，發現它的核苷酸序列實際上與人nm23-H2序列一致一系列的生化及免疫學研究證明：PUF與nm23-H2蛋白的一致性，該蛋白通過與啟動子序列特異地結合使myc DNA序列在體外轉錄nm23 基因及表達目前認為，nm23 雖然不一定是myc的轉錄刺激物，但至少是myc的一個重要調節基因細胞死亡時，nm23可以誘導myc的表達nm23-H1喪失，有

31、助于細胞永生化nm23 表達產物及功能nm23-H1和nm23-H2基因：編碼由152個氨基酸所組成的17kD蛋白，nm23-H1和nm23-H2的氨基酸序列同源性達88%其氨基酸序列在疏水性和電荷性上高度保守，有94%的氨基酸組成是相同的nm23蛋白（p17）與核苷二磷酸激酶（NDPK）的氨基酸序列高度同源nm23-H1蛋白 與NDPK的同源性達89%nm23-H2蛋白 與NDPK的同源性達97%NDPK是一類廣泛存在的酶將5NTP的一個磷酸基團轉移到5NDP上，使蛋白變為活性狀態功能：在腫瘤的發生和發育上，至少參與兩個重要作用NDPK 功能之一：微管的聚合一方面可能使微管聚合異常而引起減數

32、分裂時紡綞體的異常，從而導致癌細胞染色體非整倍體的形成，進而促進腫瘤的發展另一方面它可能通過影響細胞骨架而引起細胞運動，從而參與浸潤轉移過程和發育過程NDPK 功能之二： G蛋白介導的信號傳導在信號轉導過程中，使GDP還原為GTP，從而使G蛋白激活Nm23蛋白以這種方式能調節大量的G蛋白介導的細胞信號傳導反應，進而參與發育和腫瘤的發展nm23基因與腫瘤轉移Steeg PS，等 nm23基因表達與乳原癌轉移和預后的關系17份腫瘤標本，原位雜交技術檢測nm 23 mRNA含量結果：瘤細胞（來自有淋巴結轉移的病人）：均含有低水平的nm23 mRNA瘤細胞（來自無淋巴結轉移的病人）：含有較高水平的nm

33、23 mRNAnm23基因與腫瘤轉移進一步，對71例原發性乳腺癌患者進行研究 （nm23基因的表達）方法Northern blot 免疫細胞化學的方法結果表明：nm23在分化良好的腫瘤呈高水平表達，nm23表達與淋巴轉移呈負相關，與無病生存期，整個生存期呈正相關目前認為nm23基因產物，在抑制表型中起重要作用nm23基因與腫瘤轉移nm23低表達與人胃癌的轉移密切相關到目前為止，nm23已在胃癌、骨肉瘤、膀胱癌、乳腺癌、腸癌等具有轉移潛能的腫瘤細胞中呈低表達在大腸癌中nm23在低表達與腫瘤狀態和遠距離轉移緊密相關檢測nm23表達程度可以判斷腫瘤有無轉移，對臨床治療具有普遍意義，國外已在91年開展

34、這項常見檢查。國內？mdm2 癌基因1992年，從一個含有雙微體（murine double mimut，DM）的自發轉化的BALB 3T3DM細胞中克隆出來的一個高度擴增的基因位于小鼠的第10號染色體的C1-C3區已在多種腫瘤中發現其突變與擴增，而且mdm2突變與p53突變不共存mdm2擴增與腫瘤轉移密切相關目前研究表明，mdm2參與細胞基本生理過程。因此，mdm2癌基因的變化對闡明腫瘤發病機理以及轉移機理具有重大意義，對臨床也具有指導意義mdm2 癌基因mdm2基因在進化上比較保守，在許多動物細胞的染色體上都有同源序列核苷酸序列己測定，由2372個堿基組成，在3 端和5端各有數百個堿基組成

35、的非編碼區起始密碼AUG 從第311個堿基處開始，編碼區全長 1473個堿基，編碼一個長度為491個氨基酸的蛋白質 mdm2 基因1992年，Momand等人，首次分離和證明了大鼠的mdm2基因產物是一種分子為90 kD的蛋白質同年Baraby等人測定的分子量約95kD該蛋白質的分子量是90kD或95kD，故稱為p90或p95p90是一種高度酸性的蛋白質，等電點非常低p90結構：一級結構己根據 mdm2 基因的核苷酸序列推測出來，高級結構的研究目前尚未見報道氨基酸序列分析發現：具有1個核定位信號和2個鋅指蛋白，提示著它是一種DNA結合蛋白，可能具有轉錄調節作用人 mdm2 基因Oliner等人

36、，對人mdm2基因進行了克隆，并定位于12q13-4正常情況下，人體許多器官都有mdm2 mRNA （）的表達，以骨胳肌最高在小鼠的許多器官組織中也有mdm2 mRNA的表達，以睪丸、胸腺和腦中最高mdm2在哺乳動物中有如此廣泛的表達，說明它在細胞的基本生理過程中有一定作用，根據對mdm2癌基因產物分析也提示： mdm2 癌基因在控制細胞生長上有一定作用mdm2 癌基因的成瘤性研究mdm2 癌基因在自發轉化的 BALB/3T3DM細胞系有高度擴增，其擴增程度是正常的50倍以上，而且這些轉化的細胞在軟瓊脂上可以生長，并在裸鼠皮下可以成瘤，成瘤速度非常快，在 1-2 周內就可以出現一個快速生長的腫

37、瘤mdm2 癌基因的成瘤性研究用mdm2基因，轉染NIH3T3細胞和大鼠的Rat細胞，可以使轉染細胞的mdm2 mRNA水平增高10-15倍過度表達的程度與mdm2在這些細胞內的擴增程度有直接關系將轉染的細胞接種到16只裸鼠皮下，裸鼠均發生了腫瘤，但出現腫瘤的時間要晚于3T3DM細胞，這可能與3T3DM細胞的mdm2的表達程度較高有關動物實驗說明：mdm2癌基因，可以使細胞轉化和具有成瘤性，并可以促進移植瘤的快速出現mdm2癌基因在人類腫瘤的擴增和表達1992年Oliner等首次報道mdm2癌基因在人體的軟組織和骨的肉瘤中有擴增47例肉瘤中有17例擴增（7例脂肪肉瘤、7例惡性纖組織細胞瘤、3例

38、骨肉瘤）擴增程度從5-50倍不等，在有高度擴增的肉瘤細胞中有高水平的mdm2癌基因產物p90的表達mdm2癌基因在人類腫瘤的擴增和表達Ladanyi等人，研究了28例骨肉瘤（16例原發、11例轉移、1例局部復發）的mdm2癌基因的擴增情況，結果：4例（3例轉移和1例復發）有mdm2 癌基因擴增在原發性骨肉瘤中未見有mdm2癌基因的擴增Ladanyi認為mdm2 癌基因的擴增可能與骨肉瘤的發展和轉移有關mdm2癌基因在人類腫瘤的擴增和表達Reifenferger等，最近發現：mdm2癌基因在人腦腫瘤中有擴增對157例人腦腫瘤檢測發現：8-10%的膠質母細胞瘤和變型星型細胞瘤有 mdm2 癌基因擴

39、增擴增程度從8-70倍不等mdm2癌基因在人類腫瘤的擴增和表達Sheikh等發現：在雌激素受體陽性的乳腺癌細胞系中，mdm2 mRNA表達水平是雌激素受體陰性細胞系的30倍在良性軟組織腫瘤（脂肪瘤）和結腸、直腸、腎、宮頸癌中未發現有mdm2癌基因的擴增mdm2 癌基因研究的展望mdm2癌基因的研究才剛剛起步，初步的研究結果己顯出來，在膠質瘤、骨肉瘤和軟組織肉瘤中有一定關系在骨肉瘤中檢測mdm2的擴增有可能成為一個估計預后的指標mdm2在乳腺癌細胞系中的擴增，但在胃腸道和宮頸癌中未發現有擴增在其它腫瘤的表達情況及與臨床病理學特征的關系有待進一步探討mdm2 癌基因研究的展望mdm2癌基因表達產物

40、在人類為p90p90可以與p53蛋白形成復合物（p90-p53），使p53失活mdm2的精確功能尚不清楚，因此它的過度表達是否可以通過其它機理，而不是通過滅活p53而促進腫瘤生長?對其表達產物的氨基酸序列分析發現，具有與DNA結合特定模序mdm2 癌基因研究的展望mdm2 基因位于12q，在這個區域還有其它兩個基因sas和gil，這兩個基因在一些惡腫瘤中也有擴增在膠質瘤、軟組織和骨肉瘤中位于染色體同一區域的mdm2、sas和gil會不會同時擴增，擴增程度等仍是值得探討的問題p16 基因1994年（美國冷泉實驗室 Kamb等）新發現的抗癌基因又叫MTS（multiple tumor suppre

41、ssor 1）基因是一種細胞周期中的基本基因，直接參與細胞周期的調控，負調節細胞增殖及分裂在人類50%腫瘤細胞株中發現有純合子缺失，突變，認為p16是比p53更重要的一種新型抗癌基因有人把它比作細胞周期中的剎車裝置，一旦失靈則會導致細胞惡性增殖，導致惡性腫瘤發生p16 基因在肺癌、乳腺癌、腦腫瘤、骨腫瘤、皮膚癌、膀胱癌、腎癌、卵巢癌和淋巴瘤、黑色素瘤中發現：p16基因純合子缺失，無義、錯義移碼突變，表明p16基因以缺失，突變方式廣泛參與腫瘤形成檢測p16基因有無改變對判斷患者腫瘤的易感性以及預測腫瘤的預后，具有十分重要的臨床意義p16基因結構及表達p16基因定位于人染色體9p21，由2個內含子

42、及3個外顯子組成第1外顯子由126bp組成第2外顯子由307bp組成第3外顯子由 bp組成p16基因是細胞周期中的一種基本基因，其表達產物直接參與細胞增殖的負調節p16基因如何調整起始轉錄？其相關調節因子有哪些？如何調節？尚不清楚p16基因的表達產物及功能p16基因編碼產物是p16蛋白，定位于細胞核內David Beach等證明：p16蛋白是作用于細胞分裂周期（cell division cycle，cdc）的關鍵酶之一是CDK（cyclin-dependent kinase）的抑制因子p16基因的表達產物及功能cdc基因編碼產物是蛋白激酶，參與調控G1-S，G2-M的關鍵點轉換控制細胞分化的

43、機制涉及到多種組成成分，最重要的是細胞周期素（cyclin）Cyclin：周期性累積與分解對細胞周期時程的調控作用CDK與cyclin復合體分別在細胞周期的不同時相發揮作用，啟動DNA復制及誘發有絲分裂CDK可能是調控細胞周期裝置的核心，通過對一系列關鍵底物磷酸化作用來調節細胞周期Cell cyclep16基因的表達產物及功能CDK與cyclin復合體參與G1-S轉換的調控p16蛋白抑制CDK活性，最終阻止細胞進入S期p16基因（因缺失，突變等原因）功能缺失，則不能抑制CDK，最終導致細胞進入惡性增殖，加速腫瘤發生p16基因的表達產物及功能CDK-cyclin可作用于多種癌基因產物，如：pp6

44、0c-syc，c-abl產物，對其進行磷酸化修飾調節， CDK-cyclin亦可作用于某些抗癌基因產物，如：Rb蛋白磷酸化后則生長抑制功能喪失，在G1/S交界處，CDK-G1 cyclin，使Rb磷酸化而失活，細胞從靜止態進入增殖態可見，p16基因是一種非常重要的抗癌基因， p16基因失活，則會引起細胞惡性增殖p16 基因與腫瘤Gianic等：定量PCR檢測了32例惡性神經膠質瘤的p16外顯子2發現：59%惡性神經膠質瘤中，p16基因的量有改變，根據光密度掃描，24% 的病人是因p16基因純合子缺失所致p16 基因與腫瘤JenJ，等：PCR技術檢測 57例腦腫瘤p16基因發現26例出現純合子缺

45、失p16 基因與腫瘤Kamb等從肺癌、乳腺癌、囊腫瘤、骨腫瘤、皮膚癌、膀胱癌、腎癌、卵巢癌、淋巴瘤等中檢測出50%以上的p16基因純合子缺失在黑色素瘤中，還檢出無義錯義，移碼突變研究表明：p16基因參與了各種組織的腫瘤形成檢測p16基因的突變與缺失，是判斷腫瘤的性質及預后的一項重要指標p16 基因與腫瘤p16基因體積小，只有p53的1/10p16基因用于基因診療、更易操作，對臨床腫瘤治療更具有現實意義研究p16基因正是目前及今后一段時期的熱點抗腫瘤基因的實驗證據 1遺傳性腫瘤中某些基因的丟失早在70年代已經證明：某些遺傳性腫瘤中染色體的某些位點可發生專一的丟失視網膜母細胞瘤的40屬先天性這些遺

46、傳性病例（大多為雙側性）的患兒，約5可見13q14的一個等位基因位點的缺失，而且腫瘤發生時，腫瘤細胞中另一個等位基因也發生了缺失，成為純合體提示：第一次的缺陷屬先天性，第二次屬體細胞突變（ ，提出了“兩次突變”學說）只有兩個等位基因同時缺失時才發生視網膜母細胞瘤，因此這種抗視網膜母細胞瘤的原癌基因（Rb基因）具有顯著性的意義根據酯酶D的測定和與染色體13有關的限制性內切片段長并多態性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）證明：至少50的視網膜母細胞瘤細胞中存在純合體的13q14、20缺失經治療后痊愈的兒童，以后易患肉瘤，而這種瘤細胞中也發

47、現了13號染色體標志位點的缺失另一個相似的例子是腎母細胞瘤（Wilm瘤），在腫瘤細胞中出現純合子的11q13的缺失11p標記位點的缺少還與肝母細胞瘤，小兒橫紋肌肉瘤、腎上腺皮須癌有關 抗腫瘤基因的實驗證據 2. 正常和惡性細胞雜交中正常染色體對惡性行為的抑制應用體細胞雜交技術，正常細胞與惡性細胞雜交后所形成的雜體細胞，其惡性程度降低，但隨著正常染色體被逐排斥，惡性度又恢復正常小鼠成纖維細胞和惡性轉化細胞雜交后，抑制惡性生長的基因位于小鼠染色體4正常人成纖維細胞與中國倉鼠或金倉鼠惡性轉化細胞雜交時，抑制惡性行為的基因分別位于染色體2或1正常人成纖維細胞和人HeLa細胞雜交時，這種“阻抑基因”位于

48、染色體11及14不同種屬，不同種類惡性細胞的抗腫瘤基因的種類不相同抗腫瘤基因的性質和生物學意義由于對抗腫瘤基因編碼的產物尚不了解，所以目前仍難以說明抗腫瘤基因的性質和確切的生物學功能推測：抗腫瘤基因的產物包括不少抑制細胞生長的物質，其中有抑素（chalone）生長抑制因子（GIF）細胞MHC-1 抗原（有助于機體免疫系統的有效識別）抗腫瘤基因可能包括：1編碼抑制細胞生長的一些物質2基因表達的調節控制序列，包括trans調 節或cis調節的負控制區3調控基因組穩定性的某些基因 以上僅僅是根據現有材料的一些推測，將有待于實驗的證實最近，有三方面的實驗室結果，比較直接提供存在抗瘤基因的證據Rb基因的

49、分離：美國哈佛大學麻省理工學院加州大學分別分離出Rb基因的cDNA及其DNA序列分析證據Friend.S.H.等人用一個定位于13q14、11，以前用于Rb基因限制性內切酶長度多態性研究的DNA片段H3-8為探針，從人胎盤cDNA文庫中篩選出一個的cDNA片段，并同時分離出相應的基因片段的克隆，用上述cDNA為探針，可在正常人的組織DNA中看到雜交信號，而在部分的視網膜母細胞瘤的DNA中則可看到信號的缺失證據如果用Nouthern吸印雜交的技術來檢測正常人某些組織及視網膜母細胞瘤的mRNA，可發現在前才有的信號，而在后者則此mRNA缺失目前該cDNA的全部DNA序列已經測出證據李文華（）等人，

50、利用酯酶D的基因，通過染色體移步（chromosomal walking）應用cDNA和單一順序DNA片段向兩側延伸，終于分離到Rb基因的cDNA及基因片段此cDNA長，涉及到的基因大于100kb，由27個外顯子組成。從cDNA序列分析，預計可翻譯出816個氨基酸組成的多肽在視網膜母細胞瘤中，不僅可見基因的部分丟失，而且可看到mRNA轉錄物的缺失或異常另一方面，對Wilm瘤的研究也有所突破：Stambridge等人，應用微細胞雜交技術，首次證明了將11號染色體短臂片段導入Wilm瘤細胞，可使細胞喪失在軟瓊脂中生長的能力和在裸鼠體內的成瘤能力。但對瘤細胞的形態、c-myc、N-myc及c-sis

51、的表達均無影響用其它染色體片段如13號染色體對Wilm瘤的成瘤能力并無作用實驗結果表明，11號染色體上的抗瘤基因產物與腫瘤形成后期存在某種聯系對癌基因與抗癌基因的評論如果說癌基因是一個涵義混亂不確切的命名，抗癌基因是同樣的模糊不清所謂癌基因與抗癌基因都是一大類控制細胞生長和分化的基因，對其單個基因來說，它的產物所具有的功能因細胞種類甚至細胞發育階段而異1癌基因與抗癌基因的相對意義同一種癌基因及其產物，在不同細胞中可起完全相反的作用最典型的例子是ras基因及其產物p21。在成纖維細胞中已有充分證據說明，微量注入p21蛋白能使細胞迅速進入S期和開始分裂。人ras基因可使成纖維細胞和某些上皮細胞惡變

52、。但對點突變的嗜鉻細胞瘤pc12細胞，將ras基因引入或微量注射p21使惡性細胞停止分裂并開始分化。src基因對雞成纖維細胞中的致癌作用是確定無疑的，但在胚胎發育過程中，src基因的表達神經系統的分化密切相關，估計這樣的例子可能不盡是個別的從生物學意義上來說，ras基因對成纖維細胞來說是癌基因，對交感神經切來源的pc12來說是抗癌基因。同一基因的產物，是促進生長或抑制生長，是抗癌還是致癌，似乎不取決于該基因的本身，而決定于細胞類別的差異。同時提示不同細胞中以ras 基因產物的效應系統不同，因此最后的生物學功能也不同。2. 促進和抑制生長物質的雙重性顧名思義，應將生長因子列入癌基因的范疇，而生長

53、抑制因子則應屬抗癌基因之列。事實上，生長因子對不同細胞的作用差別很大，除了受體的因素外，生長因子既可促進細胞生長，也可抑制細胞生長。同樣，生長抑制因子既可抑制細胞生長，也可促進細胞生長。因此，不區別細胞的種類即判斷哪些基因是促進或抑制生長，顯然是不合理的3腫瘤是一種異常生長早在上一世紀，Virchow已提出腫瘤是一種異常生長的疾病。癌細胞是一種以自主的，帶有分化缺陷的持續生長的細胞癌基因與抗癌基因的研究，尤其是前者，從基因水平揭開了控制細胞生長和分化的物質基礎，應該既不受癌基因或抗癌基因的概念所束縛，同時也充分利用上述研究的大量材料，來揭示腫瘤發生評論：癌基因研究的戰略及具體技術目前癌基因的研

54、究，極需在概念和技術上有所突破概念問題現從戰略角度來討論目前癌基因研究技術路線的得與失，并提出當前需要發展的技術路線及其可行性問題傳統的研究技術路線1各實驗室用于分離癌基因的技術路線大體上有以下幾個方面： 1癌細胞的基因組DNA，通過DNA轉染后導入某些受體細胞。發生惡性轉化后，組建轉化細胞株的基因文庫，從中分離出癌基因的克隆具體分以下幾個環節：傳統的研究技術路線1環節之一：癌細胞的材料來源，文獻報道，多數直接癌的體外細胞株作為材料，其優點是材料易得而且單純，易于提取到較完整的高分子DNA。缺點是體外培養過程中，癌細胞的某些原癌基因可發生突變，新的原癌基因也可被激活，因此與體內原發性腫瘤的癌基

55、因譜不一定相同。所以，對某種特定的癌來說，材料來源奕以原發性腫瘤為主，可以癌細胞株的研究提供相互驗證。但原發性腫瘤的材料不均一，常伴有壞死，提取高分DNA有時會遇到一定困難，因此在提取DNA時應注意防止DNA的降解傳統的研究技術路線1環節之二：高分子DNA的提取用于DNA轉染的DNA，要求并不高。在轉染前，還將用針筒吸抽或其它機械方法將DNA分子撕裂至60kb左右，以利于導入細胞。由于這樣的處理，使用DNA轉染技術獲得的轉化基因一般在50kb以下。這是DNA轉染在技術上的限制傳統的研究技術路線1環節之三：受體細胞的選擇基因轉移的常用的受體細胞為小鼠NIH3T3細胞，大鼠RAT-1細胞，倉鼠CH

56、EF細胞。上述細胞都屬成纖維細胞。少數實驗已開始用小鼠腎上皮細胞。上述細胞中，NIH3T3對接受外源轉化基因而發生惡性極為敏感，但自發生轉化率高。過去不少作者提出責難：NIH3T3細胞為一種“非整倍體”細胞，已屬非正常細胞，所以應用NIH3T3作為受體細胞大多獲得的轉化基因仍多屬ras族。因此認為，為什么獲得上述結果，另有原因。這是由于DNA轉染技術本身的局限性傳統的研究技術路線1環節之四：DNA轉染目前最常用的基因轉移方法是DNA轉染，即將DNA直接放入培液，通過一定方式，使它進入受體細胞DNA導入的技術有1：磷酸鈣沉淀法原理：利用磷酸鈣形成細顆粒，DNA吸附于顆粒而被導入細胞優點：方法簡便

57、、易于重復缺點：轉移導入的效率低，均在10-6-10-7之間DNA導入的技術有2：電穿孔技術原理：利用高壓電場，對細胞進行脈沖式處理，使細胞表面通透性改變，有利于DNA分子進入細胞其效率一般比磷酸鈣方法提高二個數量級或更多DNA導入的技術有3： 抗藥基因的共轉染由于DNA導入的效率很低（最高僅10-3），因此如果共同導入抗藥基因，可通過藥物去除大量未被轉染的細胞，在具有抗藥性的細胞中選擇出惡性轉化細胞，而且會顯著降低自發轉化灶的背景數常用的抗藥基因為pSV2-neo。用G418進行篩選的缺點是G418價格昂貴傳統的研究技術路線1環節之五： 轉化細胞的篩選經典的方法是通過G418篩選后，在轉染后21在左右，收集轉化細胞灶，分別擴增。然后將轉化細胞通過軟瓊脂生長，推測其生長能力。若獲得細胞集落，將其收集后，再度擴增。達到一定細胞數后，按106-107細胞鼠