1、實驗方法大全建立一個良好的、具有示范意義的實驗室規(guī)范是建立一個優(yōu)秀實驗室的最為基本的、必要的、關鍵的前題。正文目錄正文目錄i表格目錄ii信息準備1基本鑒定神經(jīng)活性因子所需項目1冰凍切片1cRNA探針標記1PCR Dig Probe Synthesis2Dig Easy Hyb雜交方案2原位分子雜交(ISH)3RACE實驗方案5Northern Blot & Dot Blot6Northern Blot雜交-mRNA膜雜交6隨機引物標記DNA探針(試劑盒:Promega, U1100)7DNA純化柱制作8RNA Master Blot放射性探針雜交檢測8多組織Northern Blot放射性探針

2、雜交檢測8細菌培養(yǎng)9液體細菌培養(yǎng)9固體細菌培養(yǎng)10菌種的保存10感受態(tài)細胞的制備和保存10感受態(tài)細胞的制備10感受態(tài)細胞的凍存11質(zhì)粒的提取和純化11質(zhì)粒DNA的小量提取和純化11限制酶酶切反應12質(zhì)粒的酶切，小量酶解反應12DNA的重組12T-載體連接(T/A cloning)12粘端連接法13平端連接法14平-粘端連接法(定向連接反應)15重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化15重組質(zhì)粒的鑒定17a-互補17插入失活17菌落原位雜交18限制酶酶切分析19瓊脂糖凝膠電泳19從凝膠中回收DNA19PCR技術20細胞培養(yǎng)21無菌操作21試劑及材料21細胞的復蘇22培養(yǎng)細胞換液22培養(yǎng)細胞的傳代23細胞的凍存23細胞計

3、數(shù)23細胞轉(zhuǎn)染24轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的制備24脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染系統(tǒng)24新生大鼠皮層神經(jīng)元分離與培養(yǎng)24Western Blot(Immunoblotting)26蛋白質(zhì)樣品的準備26細胞胞漿樣品準備26細胞培養(yǎng)上清樣品準備26細菌培養(yǎng)菌體蛋白樣品準備26SDS凝膠電泳26SDS凝膠電泳26SDS凝膠的考馬斯亮藍染色28SDS凝膠的銀染29SDS-聚丙烯酰胺凝膠的干燥29轉(zhuǎn)膜30免疫反應30顯 色31DAB顯色31ECL顯色31表格目錄表格 1、信息準備1表格 2、RNA探針標記體系1表格 3、PCR法Dig探針標記體系2表格 4、PCR法Dig探針反應參數(shù)2表格 5、抗體稀釋液3表格 6、0.2mol/L N

4、aH2PO43表格 7、0.2mol/L Na2HPO43表格 8、0.2mol/LPB(pH7.2)(Method I)3表格 9、0.2mol/LPB(pH7.2)(Method II)3表格 10、RACE之PCR反應體系5表格 116表格 126表格 13、隨機引物標記DNA探針反應體系7表格 14、RNA Master Blot雜交檢測反應體系8表格15、LB液體培養(yǎng)基9表格16、LB固體培養(yǎng)基10表格 17、0.1mol/L CaCl2溶液11表格 18、TE buffer配制方案11表格 19、雙酶切反應體系12表格 20、pGEM-T連接體系13表格 21、單次連接反應中PCR

5、產(chǎn)物最低濃度要求13表格22、平端PCR產(chǎn)物加尾體系13表格 2314表格 2414表格 2514表格 2615表格 27、LB液體培養(yǎng)基配方16表格 28、LB固體培養(yǎng)基配方16表格 29、SOC培養(yǎng)基配方16表格 30、Mg2+ stock(2M)16表格 3119表格 3220表格33、0.25% Trypsin-0.04% EDTA消化液:500ml22表格34、細胞凍存液23表格35、DMEM培養(yǎng)基24表格 36、30%凝膠貯備液26表格 37、10%SDS27表格 38、5電泳緩沖液27表格 39、10%過硫酸胺27表格 40、1.5mol/L Tris-Cl(pH8.8)27表格

6、 41、1.0mol/L Tris-Cl27表格 42、2Sample Buffer27表格 43、凝膠(分離膠)濃度的選擇27表格 44、分離膠的制備28表格 45、配制Tris-甘氨酸SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳5%濃縮膠所用溶液28表格 46、脫色液28表格 46、考馬斯亮藍(Commassise blue R250)染液29表格 47、TBS配方(Western Blot用)30表格 48、TBST配方(Western Blot用)31表格 49、Blocking buffer配方(Western Blot用)31信息準備表格 1、信息準備基本鑒定神經(jīng)活性因子所需項目范明:118呼256

7、0；孫煥東:118呼7728基因序列分析；表達產(chǎn)物純化分析；測活系統(tǒng)；分布/表達譜；發(fā)育變化；作用類型(何種神經(jīng)元)；與其他因子比較(活性)；轉(zhuǎn)染后測活。冰凍切片器材:尖鑷子、DEPC水(替代防凍液)、玻璃吸管(加液體)、單面刀片(修整組織塊)、衛(wèi)生紙(擦拭冷凍臺等)。切片最佳溫度:-1520，如果組織塊表面過冷，切片將變?yōu)榉勰畈豢捎茫藭r可戴乳膠手套用大拇指給組織塊表面提高溫度。此種處理可對后續(xù)的35張切片有效。切片時如果防卷板工作不正常，可用左手食指按壓協(xié)助。cRNA探針標記試劑:Roche/BM公司產(chǎn)品Dig BA Labeling Kit(SP6/T7), Cat #1175025,

8、 Kit for 210 labeling/transcription reactions。常規(guī)下，1ug DNA?10ug NA。DEPC水，0.2M EDTA, 4M LiCl, 預冷的100%乙醇，預冷的70%乙醇流程:在置于冰上、無RNase的滅菌1.5ml Epp管中建立以下反應體系:表格 2、RNA探針標記體系模板DNA1ugNTP labeling mixture(vial 7)2ultranscription buffer(vial 8)2ulRNase inhibitor(vial 10)1ulDEPC水調(diào)整體積?18ulSP6 or T7 RNA polymerase(vi

9、al 11 or 12)2ul總體積20ul用槍頭混勻，離心。37孵育2h；(可選)加入2ul無RNase的DNase(vial 9)，37孵育15min以去除模板DNA；加入2ul EDTA終止反應；向管中加入2.5ul 4M LiCl(1/10體積)和75ul(2.5倍體積)預冷的無水乙醇；離心，12,000rpm15 min(如果標記理想，可見沉淀片);加入預冷的70%乙醇100ul洗濟沉淀片15min，可更換一次，棄上清；真空干燥或者室溫自然干燥，以使乙醇揮發(fā)完全；用100ul DEPC水溶解沉淀，分裝為5ul/管，保存于-70備用。此時可用雜交液保存?zhèn)溆?按照1:200濃度，即每管加

10、入1ml雜交液)使用濃度:建議1:2001:1000調(diào)試進行。PCR Dig Probe Synthesis試劑:Roche/RM產(chǎn)品，PCR Dig Probe Synthesis Kit, Cat #1636090, Kit fot 25 polymerase chain eaction(50ul).流程:冰上操作，向PCR管中加入反應體系:表格 3、PCR法Dig探針標記體系試劑加入量Control/ Taq DNA poly-merase, Takara product滅菌重蒸水36.25ul15.25ul10PCR buffer with MgCl2(vial 3)5ul10 Buf

11、fer: 2.5ul10PCR Dig mix(vial 2)5uldNTP: 4ulPrimer 11ul1ulPrimer 21ul1ulEnzyme mix, ExpandHigh Fidelity(vial 1)0.75ulTaq DNA polymerase, Takara product: 0.25ul模板DNA(/質(zhì)粒DNA作為模板時無需純化)1ul1ul總體積50ul25ul槍頭混勻，稍離心使液體沉底；滴加適量液體石蠟油；啟動PCR反應，參考反應條件如下:表格 4、PCR法Dig探針反應參數(shù)File #801952min?File #7910(9510sec?6030sec?7

12、22min)?File #7820(9510sec?6030sec?722min+5sec)?File #971727min?File #96100min(產(chǎn)物保護)電泳檢測并半定量；使用前需經(jīng)95100變性5min，然后置冰浴中直至加入雜交液使用。使用推薦劑量:2ul/ml雜交液。Dig Easy Hyb雜交方案試劑:Roche/RM產(chǎn)品，Dig Easy Hyb, , Cat #1603558, 500ml, Hybridization solution for nucleic acid blots with digoxigenin-labeld probes.流程(for DNA:RNA

13、 hybridization):將適量雜交液預熱到合適的雜交溫度；用此雜交液孵育雜交膜30min，并輕輕攪動；Dig探針(525ng/ml for DNA-probes, 100ng/ml for RNA-probes)煮沸變性，并快速置于冰上冷卻；將探針加入到預熱的雜交液中并混勻，防止氣泡形成；倒掉預雜交液，馬上加入含有探針的雜交液；孵育至少6h，并輕輕晃動。原位分子雜交(ISH)實驗器材:搪瓷盆，木制動物固定臺(1)，圖釘，大剪刀，小剪刀，鑷子，止血鉗，輸液架，輸液瓶及網(wǎng)兜，輸液器及針頭，以及試劑配制:DEPC水(1)，1000ml: DEPC液1ml +ddH2O1000ml。振蕩過夜，

14、次日高壓生理鹽水(8.5%)，1000ml: NaCl8.5g+ddH2O1000ml30%蔗糖溶液(100ml):蔗糖30g + 0.1mol/L PB(RNase free)80ml，4保存?？贵w稀釋液(10ml): 表格 5、抗體稀釋液10% BSA0.2ul3% Triton1ml0.01mol/L PBS8.8ml總體積10ml0.2mol/L NaH2PO4:表格 6、0.2mol/L NaH2PO4NaH2PO42H2O31.2g蒸餾水?1000ml微波爐加熱助溶0.2mol/L Na2HPO4:表格 7、0.2mol/L Na2HPO4Na2HPO412H2O71.632g蒸餾

15、水?1000ml微波爐加熱助溶0.2mol/LPB(pH7.2)表格 8、0.2mol/LPB(pH7.2)(Method I)試劑加入量0.2mol/L NaH2PO419ml0.2mol/L Na2HPO481ml室溫保存表格 9、0.2mol/LPB(pH7.2)(Method II)試劑加入量Na2HPO4.12H2O58.02gNaH2PO4.2H2O5.928gddH2O(Rnase free，if needed)調(diào)節(jié)體積?1000ml0.1mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH7.2,高壓0.1mol/L PBS(RNase free):用0.2mol/L PB稀釋計算0.1mol/L甘氨

16、酸/0.1mol/L PBS(RNase free): 自行計算0.3% Triton X-100/0.1mol/L PBS(RNase free): 自行計算10mg/ml蛋白酶K(RNase free): 100mg蛋白酶K溶于10ml DEPC水中，分成小份，-20保存。使用濃度:2ug/ml(儲存液稀釋5000倍)4%多聚甲醛 /0.1mol/L PB: 自行計算20SSC :1mol/L Tris-HCl(1)pH7.5Tris(三羥甲基氨基甲烷)60.5gddH2O400ml濃鹽酸37.5ml調(diào)節(jié)pH值至7.5, 補足至500ml(2)pH8.0、pH9.0配方同上，用濃鹽酸調(diào)pH

17、值至8.0和9.0，最后將總體積補足至500ml。5mol/L NaCl: 自行計算1mol/L MgCl2:自行計算TSM1(1000ml):0.1mol/L Tris-HCl, pH8.0100ml5 mol/L NaCl20ml1mol/L MgCl210mlddH2O870ml用Tris/HCl調(diào)節(jié)至pH8.0TSM2(1000ml)0.1 mol/L Tris-HCl, pH9.5100ml5 mol/L, NaCl20ml1 mol/L, MgCl250mlddH2O830ml用Tris/HCl調(diào)節(jié)至pH9.5操作流程:注:下面所用的PBS為0.1M，pH7.3；Tris-HCl為

18、0.1M。陰性對照:(1)雜交液中不加探針；(2)雜交前用RNase消化組織。(1)大鼠麻醉: 1%戊巴比妥鈉腹腔注射(1ml/200g體重)(2)生理鹽水灌注: 250ml/200g體重(3)4%多聚甲醛灌注: 250ml/200g體重(4)4%多聚甲醛后固定: 6h或過夜(5)30%蔗糖，4，過夜，至組織塊沉降(6)冰凍切片: 1530um(7)0.1M PBS(pH7.2, 無RNase)， 53次 從此處到進入雜交液以前約需。(8)0.1M 甘氨酸/0.1M PBS(無RNase)， 5(9)0.3% Triton X-100/0.1M PBS(無RNase), 25蛋白酶無，溶解于(

19、11)4%多聚甲醛/0.1M PB， 5(12)0.1M PBS(無RNase)， 53次(13)0.1M Tris-HCl，10(新配, pH8.0, 含0.25%乙酸酐)(14)2SSC(無RNase)，10(15)加雜交液，422024h10ul20ul/切片，稀釋比例:1:100(0.5ug/ml)蓋玻片應經(jīng)DEPC水處理(16)4SSC，15從此處到進入抗體以前約需。(17)2SSC，3730(含RNase A, 20ug/ml)(18)1SSC，3710(19)0.5SSC，3710(20)0.05M PBS，103次(21)加抗體，3734h, 2030ul/切片Anti-Dig

20、-AP，稀釋:1:1000抗體稀釋液成份:0.05M PBS(pH7.2)， 1% BSA，0.4% Triton X-100(22)0.05M PBS，103次從此處到進入顯色液以前約需。(23)TSM1，103次(24)TSM2，103次(25)加顯色液，室溫，避光顯色，13h，10起間斷觀察NBT/BCIP，稀釋比例:1:50(用TSM2)(25)蒸餾水沖洗，室溫干燥, 無水乙醇脫水, 二甲苯透明,封片RACE實驗方案試劑:ClonTech試劑盒或Roche/BM RACE試劑盒，流程:引物設計，實驗Primer Premier完成，要求GC%=50%60%，Tm70；于冰上制作反應體系

21、:表格 10、RACE之PCR反應體系電泳檢測；內(nèi)引物對核實；片段放大；重組并測序。Northern Blot & Dot BlotNorthern Blot雜交-mRNA膜雜交試劑及材料1、隨機引物標記cDNA探針試劑盒:Nuclease-free Water5Lebelling BufferdNTPs:dATP、dTTP、dGTPNuclease-free BSADNA Polymerase I, Large Fragment(Klenow)2、DNA模板3、-32P-cCTP4、染料:5、TEN:表格 111TEN終濃度貯存液用量用量TrisCl10mM,pH8.01M,pH8.010m

22、l5mlEDTA1mM,pH8.00.5M,pH8.02ml1mlNaCl100mM5M20ml10ml加水至1000ml500ml室溫貯存。 6、雜交液:ExpressHyb Hybredization Solution(通用)7、10mg/ml剪切的鮭精DNA:8、20SSC表格 123M NaCl175.3g0.3M Na3Citrate2H2O88.2g用1M HCl調(diào)pH7.0加水至1000ml 室溫貯存。9、10% SDSSDS100g蒸餾水1000ml 加熱65，助溶。室溫貯存。10、洗液1(Array & dot通用)配方貯存液用量用量2SSC20SSC100ml50ml1%

23、SDS10% SDS100ml50ml加水至1000ml500ml 室溫貯存。11、洗液2(Array & dot通用)配方貯存液用量用量0.1SSC20SSC5ml2.5ml0.5% SDS10% SDS50ml25ml加水至1000ml500ml 室溫貯存。12、洗液1(Northern通用)配方貯存液用量用量2SSC20SSC100ml50ml0.05% SDS10% SDS5ml2.5ml加水至1000ml500ml 室溫貯存。13、洗液2(Northern通用)配方貯存液用量用量0.1SSC20SSC5ml2.5ml0.1% SDS10% SDS10ml5ml加水至1000ml500

24、ml 室溫貯存。14、0.5% SDS配方貯存液用量用量0.5% SDS10% SDS50ml25ml加水至1000ml500ml15、顯影液16、定影液17、雜交膜隨機引物標記DNA探針(試劑盒:Promega, U1100)器材及試劑:準備沸水(電爐、微波爐等)，制冰，DNA純化柱，Sephidex G-50，TEN洗注液，20個Epp管流程:將標記試劑盒中的Klenow大片段置于-20冰盒中，其余試劑置于冰上融解；DNA模板變性:95100，2min后快速冰上冷卻；在1.5ml離心管中依次加入以下試劑:表格 13、隨機引物標記DNA探針反應體系試劑終濃度用量加入量Nuclease-fre

25、e Water29ulLabeling 5Buffer110ul10ulMixture of the unlabelled dNTPs2ul0.7ul3Denatured DNA Template500ng/ml25ng1ulNuclease-free BSA400ug/ml2ul2ula-32P-dCTP(進入同位素室后加入)333nM5ul5ulDNA Polymerase I, Large Fragment(Klenow) (進入同位素室后加入)100u/ml1ul(5U)1ul總體積50ul50ul注:Water+Template的體積應為30ul。輕輕混勻，室溫反應至少1h；終止反應

26、:951002min，快速冰上冷卻。純化探針:50ul體系10ul染料，用100ul Tips全部滴加到純化柱中(上層液體已流完)。緩慢滴加TEN。待液體流出10滴左右起用1.5ml離心管收集，4滴/管。收集1020管。隨后計數(shù)各管的CPM值。一般采用第1、2、3連續(xù)高峰合并得到400ul600ul探針，取100ul使用。不用時置于鉛盒中，-20保存。DNA純化柱制作器材及試劑:純化柱，Sephidex G-50，蒸餾水流程:取適量Sephidex G-50用水膨脹，洗；填柱，如不均，用細藥勺勾兌；RNA Master Blot放射性探針雜交檢測試劑:雜交液，洗液I，洗液II流程:準備預雜交液

27、: 15ml雜交液預熱5060；150ul(1.5mg)鮭精DNA，951005min；快速冰上冷卻； 將變性的鮭精DNA同預熱的雜交液混合。預雜交:將膜放入10ml預雜交液中，雜交爐中6530min，不停搖動。準備探針:在離心管中加入下列試劑表格 14、RNA Master Blot雜交檢測反應體系試劑用量加入量放射性標記的DNA探針20ug, 10-20106 CPM150ulC0t-1 DNA30ug-鮭精DNA150ug15ul20SSC50ul總體積215ul951005min?6530min加入已預熱的剩余的5ml預雜交液中，充分混合。雜交:倒出預雜交液，加入含有探針的雜交液。于雜

28、交爐中656h或過夜，不停搖動。洗膜:小心地倒出雜交液，棄入廢液缸。預熱洗液1:200ml，6520min4，不停搖動；預熱洗液2:200ml，5520min2，不停搖動。取膜:用鑷子從取出膜，抖去多余的洗液，立即將潮濕的膜包入保鮮膜中。檢測放射量:背景500，則過夜即可。如CPM在100左右，則3天或更多。洗片:顯影13min，定影10min，流水沖洗30min。洗膜:從膜上洗去cDNA探針，以便再次使用。150200ml 0.5%SDS，煮沸10min；冷卻10min；取出膜，檢測CPM值，如果仍可查出放射性(CPM20)，則重復洗膜；將膜放入雜交管，進行下一輪實驗或包裝于保鮮膜中-20儲

29、存?zhèn)溆谩６嘟M織Northern Blot放射性探針雜交檢測試劑:雜交液，洗液I，洗液II流程:預熱雜交液: 雜交液預熱68；搖動至沉淀完全溶解。預雜交:將膜放入至少5ml雜交液中，68，30min，不停搖動。探針變性:放射性標記的探針，95100，25min，迅速冰浴。加探針:加100ul200ul探針到預熱的5ml新鮮雜交液中，充分混合。雜交:倒出預雜交液或回收，加入含有探針的雜交液。68，1h，不停搖動。洗膜:小心地倒出雜交液，棄入適當?shù)膹U液缸。洗液1，室溫，20min3，不停搖動；洗液2，50，20min2，不停搖動。取膜:用鑷子從管中取出膜，瀝去多余的洗液。將潮濕的膜包入保鮮膜中。計數(shù)

30、檢測放射性，若未洗干凈，用洗液2加洗一次。放射自顯影:壓片，將膜用膠帶在增感屏上，一般壓3張，-70，一般3天后檢測。洗片:顯影13min，定影10min，流水沖洗30min。洗膜:從膜上洗去cDNA探針，以便再次使用。150200ml 0.5%SDS，煮沸10min；冷卻10min；取出膜，檢測CPM值，如果仍可查出放射性(CPM20)，則重復洗膜；將膜放入雜交管，進行下一輪實驗或包裝于保鮮膜中-20儲存?zhèn)溆谩＜毦囵B(yǎng)液體細菌培養(yǎng)試劑及材料:1、 LB液體培養(yǎng)基:表格15、LB液體培養(yǎng)基胰蛋白胨(bacto-tryptone)10.0g5.0g酵母提取物(yeastextract)5.0g2

31、.5gNaCl10.0g5.0g去離子水定容至1000ml500ml 用5M NaOH調(diào)pH7.0。(進口試劑不必調(diào))高壓滅菌。2、50mg/ml氨芐青霉素: 氨芐青酶素鈉溶于水中；過濾；分裝貯存在-20。 使用濃度:50ug/ml。3、 16或18ml培養(yǎng)管；脫脂棉；槍頭；吸管；(高壓滅菌)。4、 鑷子；試管架；酒精燈；加樣器；三角燒瓶；搖床。小量培養(yǎng)操作程序:取滅菌的16或18ml的培養(yǎng)管，加入35ml LB培養(yǎng)基。再加入50mg/ml氨芐青霉素35ul，(如培養(yǎng)宿主菌則不加抗生素)，也可將抗生素先加入LB培養(yǎng)基中。用無菌牙簽(或槍頭)調(diào)取單菌落，送入培養(yǎng)液，(或取菌液100ul，加入培養(yǎng)

32、液中)，用無菌棉球封好管口。37，搖床培養(yǎng)，100200 r/min，至生長飽和，約612 h，可過夜培養(yǎng)。大量培養(yǎng)操作程序:在培養(yǎng)瓶中加入LB液體培養(yǎng)基100200ml，高壓滅菌。每ml LB加氨芐(50mg/ml)1ul(終濃度50ug/ml)。每ml培養(yǎng)基加菌液510ul(終濃度0.51%)。100200r/min 37搖床培養(yǎng)至OD值0.60.8。固體細菌培養(yǎng)試劑及材料1、 LB固體培養(yǎng)基 普通培養(yǎng)基:在液體培養(yǎng)基中加入1.5%瓊脂制成。表格16、LB固體培養(yǎng)基胰蛋白胨(bacto-tryptone)10.0g5.0g酵母提取物(yeast extract)5.0g2.5gNaCl 1

33、0.0g5.0g瓊脂粉15.0g7.5g去離子水定容至 1000ml500ml 高壓滅菌20min；取出后在無菌狀態(tài)下鋪板。 選擇性培養(yǎng)基: 將消毒的固體培養(yǎng)基置室溫下，冷卻至50時加入抗生素或其它必需的添加成份。 如氨芐青霉素50ug/ml，即每ml培養(yǎng)基中加氨卞貯存液(50mg/ml)1ul。 搖勻后，無菌狀態(tài)下，倒入滅菌的平皿中，培養(yǎng)基厚23mm，室溫放置23h或37放置半小時，使其固化。4保存待用。操作程序采用劃痕法接種:菌種的保存菌種保存液:甘油溶液(80%或100%皆可):高壓滅菌DMSO溶液操作程序:1、 取1.5ml離心管，加入0.3ml保存液(100%甘油)。2、 加入0.7

34、ml菌液，混勻后，貯存于-70。感受態(tài)細胞的制備和保存感受態(tài)細胞的制備試劑及材料:LB液體培養(yǎng)基:不含抗菌素。0.1mol/L CaCl2溶液:表格 17、0.1mol/L CaCl2溶液無水CaCl2 1.1g5.5g雙蒸去離子水?100ml500ml0.22um濾器過濾除菌；置于滅菌試劑瓶中，4保存。E. coli單菌落或凍存菌種(如JM109)。流程:取菌種(JM109)100ul接種至含3ml LB的玻璃試管中/菌種復蘇；200rpm250rpm37振搖過夜/12h16h；次日取菌液100ul至含10ml LB的試管中(1:100)；37劇烈振搖23h；待OD600值達到0.30.4時

35、，取出，立即置冰浴1015min；/自本步起需無菌操作；將細菌移到預冷的10ml塑料離心管中；離心:4 4,000g 10min；棄培養(yǎng)液，將管倒置于濾紙上1min/可用無菌槍頭吸去殘留培養(yǎng)液；加預冷的0.1mol/L CaCl2 2ml重懸菌體；置冰浴30min；離心:44,000g10min；棄上清液，倒置于濾紙上1min/可用無菌槍頭吸去殘留培養(yǎng)液；再加400ul預冷的0.1mol/L CaCl2重懸菌體(操作要輕)，分裝為200ul/管或者50ul/管；置4冰箱1224小時，即可用于轉(zhuǎn)化，或者加甘油凍存于-70備用。注：上述試劑用量為制備10ml菌液的量；若制備200ml菌液，則在上述

36、基礎上乘以20。感受態(tài)細胞的凍存將感受態(tài)細胞分裝成200ul/管；每份加30%體積(80ul)的甘油保存液。置-70，可保存3個月之久。質(zhì)粒的提取和純化質(zhì)粒DNA的小量提取和純化采用Wizarda Plus Minipreps DNA Purification systerm, 100preps。Promega Cat. #A7500。常規(guī)產(chǎn)量:81.5mlDH5a16hovernight?3.0ug質(zhì)粒；33.0mlDH5a16hovernight?5.0ug質(zhì)粒一、每Kit所含的試劑及物品:Cell Resuspension Solution(A711B)，內(nèi)含RNase A:；Cell

37、Lysis Solution(A712B)，內(nèi)含NaOH和SDS，為堿裂解法；Neutralization Solution(A713D)，為醋酸鉀；Wizard Minipreps DNA Purification Resin(A767B)Column Wash Solution(A810B)，內(nèi)含55%乙醇及TE: Wizard Minicolumn(A129A): Syring Barrels(809B):二、 自備試劑和物品:真空泵或2.5ml或者5ml注射器。無菌蒸餾水或TE緩沖液。表格 18、TE buffer配制方案試劑終濃度Tris-HCl, pH7.510mMEDTA1mM9

38、5%酒精。三、用前，用95%乙醇稀釋Column Wash Solution四、流程:將5 ml 培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入5ml離心管或者10ml離心管中，離心，10,000g10min；細胞重懸:加入300ul Cell Resuspension Solution , 重懸細胞沉淀。細胞裂解:加入300ul Cell Lysis Solution , 顛倒4次混勻。蛋白沉淀:加入300ul(如果為endA陽性，則用量加倍)Neutralization Solution, 顛倒4次混合。將細菌溶解產(chǎn)物離心，10,000g10 min，室溫。此時可吸取20ul電泳鑒定質(zhì)粒大?。?樹脂用前需要強力振蕩混勻。f、

39、g可先將樹脂吸入注射器中，然后用此注射器吸取細胞的裂解上清。將上清液吸至1.5ml離心管，加入DNA純化樹脂1ml。用注射器取混合液，混勻，將混合液推入Minicolumn中。取2.5ml洗柱液，推入Minicolumn中，液體流入廢液缸。將柱裝在離心管上，室溫離心，12,000rpm2 min。將柱移至新的離心管上，加入50ul水或TE，等1分鐘；離心，12,000g30sec，洗脫質(zhì)粒。棄去Minicolumn，將管中的質(zhì)粒貯存在4或-20。限制酶酶切反應質(zhì)粒的酶切，小量酶解反應主要用于質(zhì)粒的酶切鑒定，20ul體積中含0.21ug DNA。流程:在新的滅菌的0.5 ml離心管中依次加入下列

40、試劑:表格 19、雙酶切反應體系質(zhì)粒DNA(+水)?16ul10Buffer K(兼容體系)2ul限制酶: EcoR 1ul BamH1ul總體積20ul稍離心，混合。37水浴或溫箱，11.5 h。取出后電泳分析鑒定是否酶解。 DNA的重組T-載體連接(T/A cloning)(一)、試劑:外源片段DNA；pGEM-T載體，Promega: A1360, A180, A3600 and A3610/TM042；(二)、流程:將pGEM-T離心至管底；建立以下連接體系(每次使用前切記將2Buffer振蕩混勻):表格 20、pGEM-T連接體系成份10ul體系20ul體系2Rapid Ligati

41、on, T4 DNA Ligase需要按照每次用量分裝，避免多次凍融。5ul10ulpGEM-T1ul1ulPCR product(含有粘性A末端)3ul(Maximum)8ul(Maximum)T4 DNA Ligase(3 Weiss units/ul)1ul1ul用Tip吹打混勻，室溫1h或4過夜說明:A、單次連接反應中PCR產(chǎn)物最低濃度要求:表格 21、單次連接反應中PCR產(chǎn)物最低濃度要求PCR產(chǎn)物大小反應體系最低含量要求每ul含量0.5kb125ng8.5ng41.5ng1kb250ng17ng83ng2kb500ng34ng166ngB、平端PCR產(chǎn)物加尾體系(for effici

42、ent T/A cloning):表格22、平端PCR產(chǎn)物加尾體系成份加入量實用量參考純化的無A末端的PCR產(chǎn)物17ul7ulTaq DNA Polymerase 10Reaction Buffer with MgCl21ul1uldATP終濃度0.2mM0.2ul(from王升啟)Taq DNA Polymerase5units1ul(Takara產(chǎn)品)去離子水調(diào)整體積?10ul反應:701530min此步后可電泳回收，用10ul水溶解離心，吸取3ul(10ul體系)或者8ul(20ul體系)進行連接反應吸取12ul和pGEM-T載體建立連接反應可將10ul全部用于連接反應準備轉(zhuǎn)化JM109

43、宿主細胞，藍白斑篩選。粘端連接法試劑及材料:1、 含目的基因片段的DNA:如NDF1/pcDNA1。2、 載體DNA:如pcDNA3；pET22B；3、 10Buffer K:4、 限制性內(nèi)切酶:BamH I； EcoR I；5、 去離子雙蒸水6、 10連接buffer7、 T4DNA連接酶操作程序:1、 制備目的基因片段和載體:建立如下酶切反應:表格 23去離子雙蒸水6ul-DNA(13ug)10ul16ul10Buffer K2ul2ulBamH I1ul1ulEcoR I1ul1ul總體積20ul20ul 37，12h。2、瓊脂糖凝膠電泳回收目的基因片段和線性化載體。3、在1.5ml E

44、p管中建立連接反應:表格 24目的基因片段(0.4ug)13ul6ul載體DNA(0.1ug)4ul2ul10連接Buffer2ul1ulT4DNA連接酶1ul1ul去離子雙蒸水至總體積20ul10ul 16，1216h。4、將連接的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，根據(jù)不同用途選擇不同菌種制備感受態(tài)細胞。平端連接法試劑及材料1、 含目的基因片段的DNA:如NDF1/pcDNA1；2、 載體DNA:如pGEM-T Vector System(Promaga)3、 去離子雙蒸水4、 TE(pH8.0)5、 10連接buffer或2連接buffer6、 T4DNA連接酶操作程序1、制備目的基因片段和線性化載體

45、。 采用PCR技術從NDF1/pcDNA1中擴增出NDF1片段。 去5-P的線性化載體(pGEM-T):由試劑公司提供。 2、連接反應:表格 25、連接反應體系目的基因(平端)(0.5ug)7ul3ul載體(pGEM-T)(0.1ug)1ul1ul10連接Buffer1ul-2連接Buffer-5ulT4DNA連接酶1ul1ul去離子雙蒸水至10ul10ul 16，1624h。3、轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并進行克隆篩選鑒定。平-粘端連接法(定向連接反應)試劑及材料1、 含目的基因片段的DNA:2、 載體DNA3、 限制性內(nèi)切酶4、 T4DNA連接酶5、 Klenow大片段6、 2mM dNTP7、 10

46、Klenow buffer操作程序1、 制備目的基因片段和線性載體: 將載體雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳回收，使其兩端位點不同，防止連接時自身環(huán)化。 將含目的基因片段的DNA雙酶切，其中必需只有一種與載體酶切所有的酶相同；瓊脂糖凝膠電泳回收。2、 粘端連接: 目的基因片段和載體各有一匹配末端，先用T4DNA連接酶作用12h，將其連接起來； 而另一端不匹配，無法連接。此時即形成載體連接有目的基因的開環(huán)結(jié)構。3、 Klenow補平反應，將帶有目的基因載體兩端的粘性末端補平:表格 26、連接反應體系帶目的基因的載體(0.1ug)4ul10Klenow buffer2ulKlenow大片段1ul2mM d

47、NTP2ul去離子雙蒸水至總體積20ul 室溫2h后，酚、氯仿抽提，乙醇沉淀。 溶于10ul TE(pH8.0)。4、平端連接: 再用T4DNA連接酶作用1620h，使帶有目的基因片段的載體環(huán)化。5、將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞。6、克隆篩選鑒定重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化準備:感受態(tài)細胞；抗性平板；預熱SOC培養(yǎng)基；水浴42；制冰IPTG stock solution(0.1M): 1.2g IPTG(Cat. Promega#V3951)+50ml雙蒸去離子水，過濾除菌，4保存。X-Gal(2ml):100mg IPTG(Cat. Promega#V3941)溶解于2ml二甲酰胺(N,N-dime

48、thyl-formamide)中，鋁箔紙封口，-20保存。LB培養(yǎng)基:表格 27、LB液體培養(yǎng)基配方Bacto-tryptone10gBacto-yeast extract5gNaCl5g去離子水?1000ml用NaOH調(diào)節(jié)至pH7.0，高壓滅菌表格 28、LB固體培養(yǎng)基配方Bacto-tryptone10gBacto-yeast extract5gagar15gNaCl5g去離子水?1000ml用NaOH調(diào)節(jié)至pH7.0，高壓滅菌含有ampicillin的LB培養(yǎng)板:在1000ml LB培養(yǎng)基中加入15g agar(瓊脂)，高壓。冷卻至50左右時加入氨芐青霉素(Amp)至終濃度100ug/m

49、l。按照3035ml/85mm培養(yǎng)皿鋪板。凝固后置37中30min1h，4保存?zhèn)溆?。含有ampicillin/IPTG/X-Gal的LB培養(yǎng)板:按上述方法制作LB培養(yǎng)板，加入ampicillin,加入至0.5mM IPTG和80ug/ml X-Gal后倒板?；蛘呒尤?00ul 100mM IPTG和20ul 50mg/ml X-Gal至平板表面，3730min可完全吸收后使用。SOC培養(yǎng)基:表格 29、SOC培養(yǎng)基配方Bacto-tryptone2.0gBacto-yeast extract0.5gNaCl, 1mol/L1mlKCl, 1mol/L0.25ml雙蒸去離子水97ml攪拌助溶，高

50、壓，冷卻至室溫Mg2+ stock, 2M, 已過濾除菌(實際可高壓)1mlGlucose, 2M, 已過濾除菌1mlMg2+ stock(2M)表格 30、Mg2+ stock(2M)MgCl26H2O20.33gMgSO47H2O24.65g雙蒸去離子水?100ml過濾除菌/實際可高壓流程(根據(jù) pGEM-T說明書):準備LB/Amp/IPTG/X-Gal平板，使用前將平板預熱至室溫；離心連接反應管。吸2ul連接體系至置于冰上的滅菌1.5ml Epp離心管中；從-70中取出冰凍的感受態(tài)細胞(如JM109)，置冰浴中約5min至剛剛?cè)诨?。輕輕晃動使細胞混勻；吸取50ul細胞至上述連接反應管中

51、；/實際吸取200ul感受態(tài)細胞輕晃Epp管以混勻，至冰上20min；于準確調(diào)溫的42水浴中熱休克4550sec，切勿輕晃、震動；將Epp管返回冰上2min；加入950ul已經(jīng)預熱到室溫的SOC培養(yǎng)基至Epp管中；/實際加入750ulSOC培養(yǎng)基搖菌:371.5h(150rpm)；鋪板:將100ul轉(zhuǎn)化體系鋪板至準備好的LB/amp/IPTG/X-Gal平板；/實際此時才加入IPTG(4ul)+X-Gal(40ul) 或者其它篩選用抗生素，然后將1ml全部鋪板液體被吸收后倒置培養(yǎng)37過夜，后置4下以便藍白斑鑒定重組質(zhì)粒的鑒定a-互補原理:適用于含有b-半乳糖苷酶基因(LacZ)的載體，載體含有

52、LacZ的調(diào)控序列和頭146個氨基酸的編碼信息。材料及試劑1、 X-Gal(5-溴-4氯-3吲哚-b-D-半乳糖苷):20mg/ml:20mg X-Gal溶于1ml二甲基甲酰胺，-20避光保存。2、 IPTG(異丙基硫代-b-D-半乳糖苷)(200mg/ml):1g IPTG溶于4ml去離子雙蒸水，定容至5ml，0.22um過濾除菌，-20保存。操作程序:制備含相應抗菌素(如Ap+、Mana+)的瓊脂平板。于平板表面加X-Gal 40ul和IPTG 4ul，用無菌玻璃涂布器將試劑均勻涂布于整個平板表面。37，1h至所有液體消失。將200ul轉(zhuǎn)化的菌液涂布于平板表面，37，20min后，倒置平板

53、繼續(xù)培養(yǎng)1216h。/實際使用:在20ul連接體系中加入200ul感受態(tài)細胞，加入780ul SOC培養(yǎng)基，加入IPTG(+4ul)和X-Gal(+40ul)至所需濃度，將此1ml菌液全部鋪板，超靜臺中吹干約1h，轉(zhuǎn)入倒置培養(yǎng)基中培養(yǎng)812h(常規(guī)為過夜)，然后將平板置414h，觀察確定藍白斑。中止培養(yǎng)，將平板置414h，使藍色充分顯現(xiàn)。挑取白色菌落置35ml LB(含相應抗生素如Ap)液體培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)812h，提取質(zhì)粒，限制酶酶切分析進一步鑒定。插入失活原理:該法適用于有2個以上選擇標志的載體。試劑及材料1、 Ap2、 tet3、 轉(zhuǎn)化菌操作程序1、 制備LB瓊脂培養(yǎng)板分別含有Ap

54、和tet。2、 將200ul轉(zhuǎn)化的菌液均勻涂布于含Ap培養(yǎng)板表面，置3720min后倒置培養(yǎng)1216h。3、 挑取轉(zhuǎn)化菌落，分別接種于Ap培養(yǎng)板和tet培養(yǎng)板上相對應的位置，37培養(yǎng)810h。4、 如重組體的外源DNA克隆在tet基因中，應挑選在Ap培養(yǎng)板生長而在tet培養(yǎng)板不能生長的菌落，并將其接種于含Ap的LB液體培養(yǎng)基5ml中培養(yǎng)812h。5、 小量制備質(zhì)粒，限制酶酶切分析進一步鑒定。 菌落原位雜交原理:采用放射性標記的探針與含有質(zhì)粒的細菌菌落雜交的方法。待檢菌落從主平板移到硝酸纖維素濾膜上與標記探針雜交，通過放射自顯影查出陽性菌落，再從主平板上回收這些陽性菌落。試劑及材料1、 10%S

55、DS2、 變性液:0.5M NaOH，1.5M NaCl3、 中和液:0.5M Tris-Cl(pH7.4)，1.5M NaCl4、 2SSC5、 預雜交液: 50%甲酰胺 6SSC0. 1%SDS1Denhart100ug/ml變性鮭精DNA6、-32P標記的雙鏈DNA探針7、 硝酸纖維素濾膜(NC膜)8、 雜交袋9、 保鮮膜10、 暗盒11、 X光片操作程序1、 菌落轉(zhuǎn)移 用鉛筆在NC膜上劃好約5mm見方的小格(直徑60mm劃64小格，直徑80mm劃100小格)，將膜夾在兩層普通濾紙之間高壓滅菌備用。 將濾膜平鋪于合適的瓊脂培養(yǎng)皿上，膜與瓊脂之間不要有氣泡。 用滅菌牙簽挑取待檢菌落順序涂到

56、濾膜小格子中間，同時涂一個僅含載體質(zhì)粒的菌落作為陽性對照。 將兩種平皿37倒置培養(yǎng)1014h，無濾膜的平板置4保存待用。取下濾膜繼續(xù)處理。 2、 膜處理 使長有菌落的膜面向上，將膜放到浸有10%SDS的普通濾紙上，勿使膜與紙間有氣泡，室溫3min。 將膜移至用變性液浸透的濾紙上，室溫5min。 將膜移至中和液浸透的濾紙上，室溫5min。 將膜移至2SSC浸透的濾紙上，室溫5min。 將膜置80烤箱干烤12h。 3、 雜交將膜放入雜交袋中，加入預雜交液，封口。42搖床輕搖4h。將標記好的-32P雙鏈DNA探針置100變性5min，迅速冰浴冷卻，加入預雜交袋中，混勻，封口。42水浴搖床雜交過夜。將

57、膜移至2SSC，0.5%SDS中室溫漂洗5min，棄洗液。加入0.1SSC，0.1%SDS，置4215min，棄洗液。重復第二洗液洗膜2次。將膜移到干的濾紙上，室溫晾干或37烘干。用保鮮膜將膜包好，置暗盒中，在暗室中壓片。-20顯影2472h。顯影后，根據(jù)X光片黑色顯印斑點位置判斷保留的培養(yǎng)皿中所對應的菌落。將其挑出，進一步擴增，制備質(zhì)粒，酶切鑒定。限制酶酶切分析原理:經(jīng)上述三種方法篩選出的菌落需進一步酶切鑒定，尤其對鑒定外源基因的插入方向更為重要。操作程序:1、 挑選轉(zhuǎn)化菌落，培養(yǎng)。2、 小規(guī)模制備質(zhì)粒。3、 瓊脂糖凝膠電泳初篩。挑選出比對照質(zhì)粒(原始質(zhì)粒)大的重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒插入有目的基因

58、。4、 將挑選出的質(zhì)粒選擇合適的酶切位點 進行限制酶酶切分析。 瓊脂糖凝膠電泳一、 試劑及材料:1、 瓊脂糖2、 電泳緩沖液:50TAE ; 1TAE。表格 31、瓊脂糖凝膠電泳緩沖液配方50TAE1000mlTris242gEDTA-Na22H2O37.2冰乙酸57.13、 10 mg/ml溴化乙錠4、 上樣緩沖液:0.25溴酚藍 0.25%二甲苯青FF 30%甘油 4保存。5、 穩(wěn)壓電泳儀和水平凝膠電泳槽；橡皮膏。6、 透射紫外線燈；照相機；微波爐。二、 操作程序:1、 根據(jù)所需濃度(1%)稱取瓊脂糖(1g)，加入100 ml 1TAE。2、 微波爐(3分鐘)或沸水浴使瓊脂糖溶解，用三角瓶

59、，1/3液體。3、 溶液冷至60，加入溴化乙錠，終濃度0.5ug/ml。(100ml加5ul 10mg/ml的EB)。帶手套操作。4、 用橡皮膏將電泳凝膠床的兩端封好，成一膠模。5、 將瓊脂糖倒入模具，凝膠厚度35 mm，插上梳子。6、 室溫3045 min后，凝膠完全凝固，小心取出梳子和橡皮膏，將凝膠放入電泳槽。 可同時制作幾塊凝膠，固化后用保鮮膜包住，4保存，在數(shù)日內(nèi)可用。7、 加入電泳緩沖液(1TAE),液面高出膠面12 mm。8、 DNA樣品中加入1/6的上樣緩沖液(20ul:3ul)，混勻。9、 用移液器將DNA樣品(15ul)加入樣品孔。10、 蓋上電泳槽通電，正極為紅色，樣品向正

60、極泳動。60v(60100v)恒壓電泳。11、 根據(jù)指示劑遷移的位置，判斷是否終止電泳。12、 切斷電源，取出凝膠，在透射紫外線燈下觀察。13、 用加紅光濾色鏡的相機，光圈放到最大，曝光15-30s，拍照留底。 從凝膠中回收DNA一、 試劑及材料1、樹脂(Wizard PCR Preps DNA Purification Resin)2、 一次性注射器3、 柱Minicolumn4、 80%異丙醇5、 去離子雙蒸水二、操作程序切膠:將切下的膠條放入1.5ml離心管中。加入0.51ml樹脂(Wizard PCR Preps DNA Purification Resin)。65，5min，至膠熔化