1、實驗五 人類淋巴細胞株培養一、細胞培養準備工作（清洗、消毒、滅菌）二、培養基的配制三、細胞傳代培養四、死活細胞的鑒別五、細胞生長曲線的測定1一、實驗目的能獨立地進行用于細胞培養的個中器皿的清洗與消毒，掌握干熱滅菌法、濕熱滅菌法和濾過除菌法的操作，了解化學消毒法的使用方法。2二、實驗原理清洗與消毒是組織培養實驗的第一步，是組織培養中工作量最大，也是最基本的步驟。體外培養細胞所使用的各種玻璃或塑料器皿對清潔和無菌操作的要求程度很高。細胞培養不好與清洗不徹底有很大關系。滅菌手段的選擇也十分重要，對不同的物品需采用不同的滅菌方法。假如選用的方法不對，即使達到了無菌卻使被滅菌藥品喪失了營養價值、生物學特

2、性或其他使用價值也不行。3四、儀器、材料和試劑（一）儀器超凈工作臺、干燥箱、高壓鍋、過濾器（二）材料微孔濾膜（直徑25mm）：孔徑為0.22um(三）試劑75%酒精、重鉻酸鉀、濃硫酸、NaOH、 HCl等4五、實驗步驟（一）清洗1.新玻璃器皿的清洗 先用自來水刷洗，再浸泡5%稀鹽酸中和玻璃表面的堿性物質和有害物質。2.使用過的玻璃器皿的清洗（1）立即進入清水，避免干涸難洗；（2）用洗滌劑清洗玻璃器皿，自來水清洗數遍，倒置自然干燥；（3）浸酸性洗液過夜；（4）從洗液撈出自來水沖洗1015次去除酸性洗液，蒸餾水刷洗10次，倒置烘干；（5）包裝（牛皮紙或不透水紙）；（6）高壓（15磅20min)或干

3、熱（160度2h)滅菌；（7）備用。5（二）膠塞處理（1）新膠塞應先用清水清洗之后再用0.2%NaOH煮沸1020min。（2）自來水清洗10次（3）用1%稀鹽酸浸泡30min。（4）自來水清洗10次，蒸餾水刷洗10次。晾干（5）舊膠塞不必用酸堿處理可直接用洗滌劑煮沸清洗數次，過蒸餾水，晾干，包裝高壓滅菌，可使用。6（三）塑料制品的清洗（1）用洗滌劑清洗，自來水沖洗數遍（2）強（次強）酸洗液浸泡26h.（3）自來水沖洗10次以上，蒸餾水刷洗10次（4）浸泡在70%乙醇0.51h,備用。（5）用前從乙醇中取出，在超凈工作臺內紫外線照射1h。7（四）Tip和Tube的清洗（1）新的國產Tip和Tu

4、be如用于非RNA提取時可用蒸餾水刷洗，晾干，高壓滅菌后使用。（2）用于RNA提取時，用蒸餾水刷洗后再用DEPC水（抑制RNA酶）浸泡過夜晾干，高壓滅菌后使用。（3）使用過的Tip和Tube用后浸泡在0.2mol/L NaOH或0.2mol/L HCl溶液中，清水洗過，自來水清洗10次晾干，進洗液224h。晾干，放入飯盒高壓滅菌，備用。8（五）洗液的配制常用的洗液是硫酸-重鉻酸鉀溶液。洗液可根據需要配制不同的濃度成分強酸洗液次強酸洗液重鉻酸鉀63g3150g120g6000g濃硫酸1 000ml50 000ml200ml10 000ml蒸餾水200ml10 000ml1 000ml50 000

5、ml9配制方法：（1）將重鉻酸鉀放入大燒杯中，加入蒸餾水放在石棉網上加熱至沸騰并攪拌，使重鉻酸鉀充分溶解。（2）將重鉻酸鉀倒入酸缸中，然后緩慢加入濃硫酸并用一長玻璃棒不斷攪拌，充分溶解。注意：操作時注意安全，穿戴好耐酸手套和圍裙，防止洗液飛濺到衣物皮膚上，不慎飛濺到皮膚應立即用大量清水沖洗。10（六）消毒和滅菌（1）射線消毒滅菌主要使用X、60Co進行消毒滅菌，用于牛血清或塑料制品。（2）紫外線消毒一般用無臭氧型紫外燈。一般20min，71%細菌消滅；40min后79%細菌消滅，60min后86%細菌消滅。紫外線照射時間照射再長也不能100%滅菌，最多只能達到90%。11（3）干熱滅菌主要用于玻璃器皿的滅菌。將用于細胞培養的器皿放入干燥箱內，加熱至160度，保溫90120min。用于RNA提取實驗的用品則需要180度，保溫58h.（4）濕熱滅菌也稱高壓蒸汽滅菌，是最有效的一種滅菌方法。主要應用布類、橡膠、金屬器械、玻璃器皿、塑料以及加熱后不發生沉淀的無機溶液。（5）濾過滅菌用于培養用液和各種不能高壓滅菌的溶液。12（七）化學消毒法（1）70%（75%）酒精消毒（2）0.1%新潔爾