1、 實驗十誘導表達蛋白的SDS電泳檢測【實驗目的】學習和掌握SDS電泳原理掌握SDS電泳檢測誘導表達蛋白的方法【實驗原理】帶電顆粒在電場中泳動的速度與電場強度和帶電顆粒的凈電荷量成正比,而與顆粒半徑(分子量和結構)和介質粘度成反比若樣品為混合的蛋白質溶液時,由于不同蛋白質的等電點和分子量是不同的,因此經電泳后,就形成了泳動度不同的區帶結構因素蛋白質的變性消除 (1)強陰離子去污劑:十二烷基磺酸鈉(SDS) (2)還原劑:二硫蘇糖醇(DTT) (3)物理作用:加熱電荷因素SDS結合消除 (1)變性的多肽與SDS結合因而帶負電荷 (2)多肽與SDS結合的量與多肽的分子量成正比 (3) SDS多肽復合

2、物的遷移率只與分子量相關分子篩作用分子量大的蛋白質泳動的速度慢,分子量小的蛋白質泳動的速度快SDS電泳丙烯酰胺濃度/%線性分離范圍/kDa1512107.55.010-4312-6020-8036-9457-212SDS的有效分離范圍濃縮膠分離膠誘導表達產物(自己上次實驗制備)SDS系統(北京六一) 電泳儀中分子量蛋白質Marker【實驗材料】【實驗步驟】凝膠板的制備點樣及電泳蛋白質的染色和脫色密封條梳子平,凹玻板斜楔板電泳槽凝膠板的制備1234SDSSDS 分離膠(下) 濃縮膠(上)配膠 成分水 3.3 ml 4.1 ml30%(聚)丙烯酰胺溶液 4.0 ml 1.0 ml0.5mol/L

3、Tris(pH6.8) 750 l1.5mol/L Tris(pH8.8) 2.5 ml 10%SDS 100 l 60 lTEMED 10 l 8 l 10%過硫酸銨 100 l 60 l總體積 10 ml 6 ml2人配一組溶液,2人配一塊膠灌制分離膠按照上表配制分離膠溶液取4.5ml分離膠溶液立即灌入兩玻璃板的間隙,梳子前沿1cm處緩慢覆蓋400l水(200l/邊)37放置20-30分鐘凝固好后,傾出水.用濾紙條吸去多余的水分灌制濃縮膠按照上表配制濃縮膠溶液取濃縮膠約2.5ml立即灌入兩玻璃板的間隙立即插入梳子(注意,梳子有正反). 避免產生氣泡.室溫放置約30分鐘.凝固好后,拔出梳子。

4、待積層膠聚合完全后,小心的拔出梳子(垂直向上)取出制膠板,拿掉硅膠密封圈后,短板向內放回電泳槽(壓緊)將電泳槽與電泳儀連接好(注意正負極),加入Tris-甘氨酸電泳緩沖液,負極一側要超過短板頂部,正極一側加至離長板頂部1cm處2.點樣及電泳9個樣品10000rpm離心3分鐘(注意對稱)按預定順序加樣(每個樣品15L)每一塊膠上一個蛋白質Marker(20L)80V進膠,120V電泳.當染料指示到達分離膠底部時,關閉電源停止電泳(約1.5小時)0 40 80 120 M點樣順序0 40 80 120 A1或B1A2或B23.蛋白質的染色和脫色將Tris-甘氨酸電泳緩沖液回收到指定的地方取出膠板,撬開玻璃板(刀片),將凝膠移入大平皿向平皿中加入考馬斯亮藍染液,覆蓋凝膠即可,染色過夜,按老師指定的位置放置將染液回收到指定的地方,加入適量脫色液,脫色1