1、分析補充酶類藥物 酶類藥物 二、微生物酶制劑高產(chǎn)菌株的選育菌種是工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)酶制劑的重要條件。優(yōu)良菌種不僅可以提高酶制劑產(chǎn)量和發(fā)酵原料的利用率，而且還與增加品種，縮短生產(chǎn)周期，改進發(fā)酵和提煉工藝條件等密切相關(guān)。優(yōu)良菌種獲得的三種途徑：（1）從自然界分離篩選。（2）用物理或化學(xué)的方法處理，誘變。（3）用基因重組與細(xì)胞融合技術(shù)。三、微生物酶制劑生產(chǎn)的發(fā)酵技術(shù)（一）培養(yǎng)基1.碳源 （甘薯、玉米、麩皮、米糠）2.氮源 （豆餅、花生餅、菜籽餅、硫酸銨、尿素）3.無機鹽4.生長因子和產(chǎn)酶促進劑（二）培養(yǎng)方法1.固體培養(yǎng)法固體培養(yǎng)法也稱麩曲培養(yǎng)法，該法是利用麩皮或米糠為主要原料，另外視需要添加其它谷糠、豆餅

2、等，加水拌成含水適度的半固態(tài)物料作為培養(yǎng)基。2.液體培養(yǎng)法液體培養(yǎng)法是利用液體培養(yǎng)進行微生物的生長繁殖和產(chǎn)酶。根據(jù)通氣方法的不同，又分為液體表面培養(yǎng)和液體深層培養(yǎng)。深層通氣培養(yǎng)是目前應(yīng)用最廣的方法。3.影響酶產(chǎn)生的一些因素除培養(yǎng)基，發(fā)酵工藝參數(shù)對產(chǎn)酶的影響也十分明顯。（1）溫度（2）pH（3）通氣（4）攪拌（5）泡沫發(fā)酵過程中，由于發(fā)酵液受到強烈的通氣攪拌，培養(yǎng)基中某些成分的變化及代謝中產(chǎn)生氣體，會形成較多的泡沫，而且氣泡不易消失，是由于培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)分子排在氣泡表面形成一層吸附膜，聚集成泡沫層之故。消泡劑：天然油類，醇類，脂肪酸類，胺類，酰胺類，磷酸酯類，金屬皂類，聚硅氧烷等。（6）添加誘導(dǎo)

3、劑和抑制劑誘導(dǎo)酶抑制劑（表面活性劑）第二節(jié) 酶類藥物的提取和純化一、生物材料的預(yù)處理（一）動物材料的預(yù)處理1.機械處理2.反復(fù)凍融3.丙酮粉組織經(jīng)過丙酮迅速脫水干燥制成丙酮粉，不僅可以減少酶的變性，同時因細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分的破碎使得蛋白質(zhì)與脂質(zhì)結(jié)合的某些化學(xué)鍵打開，促使某些結(jié)合酶釋放到溶液中。（二）微生物的預(yù)處理要是胞外酶，則除去菌體后再直接從發(fā)酵液中吸附提取酶。但對胞內(nèi)酶則需要將菌體細(xì)胞破壁，制成無細(xì)胞的懸浮液后再行提取。1.干燥法（1）空氣干燥（2）真空干燥（3）冷凍干燥2.機械法（1）研磨法（2）組織勻漿法（3）超聲波法（4）高壓勻漿法3.酶法處理二、酶的提取1.水溶液法常用稀鹽溶液或緩沖液提

4、取。經(jīng)過預(yù)處理的原料，包括組織糜，勻漿，細(xì)胞顆粒以及丙酮粉等，都可以用水溶液抽提。許多酶再蒸餾水中不溶解，而在低鹽濃度下易溶解，所以提取時加入少量鹽可提高酶的溶解度。2.有機溶劑法某些結(jié)合酶如微粒體和線粒體膜的酶，由于和脂質(zhì)牢固結(jié)合，用水很難提取，為此必須除去結(jié)合的脂質(zhì)，且不能使酶變性，最常用的有機溶劑是丁醇。丁醇具有以下特點： （1）親脂性強，特別是親磷脂的能力； （2)兼具親水性，在0在水中的溶解度為10.5%；（3）在脂與水分子間能起類似去垢劑的橋梁作用。3.表面活性劑法三、酶制劑的工業(yè)提取法(一)發(fā)酵液的預(yù)處理及過濾絮凝劑（二）酶液的脫色0.11.5%活性炭（三）鹽析法（四）有機溶劑法

5、（五）噴霧干燥直接制備粉末酶制劑四、酶的純化酶比活，總活力回收（一）雜質(zhì)的除去酶提取液中，除所需酶外，還含有大量雜蛋白，多糖，脂類和核酸等，需要除去。（1）pH和加熱沉淀法利用蛋白質(zhì)酸堿變性性質(zhì)的差異可以通過調(diào)pH和等電點除去某些雜蛋白，也可以利用不同蛋白質(zhì)對熱穩(wěn)定性的差異。（SOD酶）（2）蛋白質(zhì)表面變性法利用蛋白質(zhì)表面變性性質(zhì)的差別，也可以除去雜蛋白。制備過氧化氫酶，加入氯仿除雜蛋白。（3）選擇性變性法利用蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的不同，除去雜蛋白。（4）核酸沉淀劑法在微生物制備酶時，常含有較多核酸，可用核酸酶降解，離心分離，用核酸沉淀劑如三甲基十六烷基溴化銨，硫酸鏈霉素等。（5）將酶與底物結(jié)合，用加

6、熱法除去雜蛋白。近來發(fā)現(xiàn)，酶和底物結(jié)合或競爭性抑制劑結(jié)合后，穩(wěn)定性大大提高，這樣可以用加熱法除去雜蛋白。（二）脫鹽和濃縮1.脫鹽（1）透析玻璃紙袋（2）凝膠過濾 Sephadex G102.濃縮（1）冷凍干燥法（2）離子交換法（3）超濾法（4）凝膠吸水（三）酶的結(jié)晶把酶提純到一定純度以后，可使其結(jié)晶。蛋白質(zhì)分子多數(shù)處于含水的環(huán)境中，蛋白質(zhì)分子與水分子結(jié)晶形成穩(wěn)定的水合物。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的濃度非常高的時候，溶液中沒有足夠可以與蛋白質(zhì)結(jié)合的水分子用于形成水合物，在蛋白質(zhì)分子之間也沒有足夠的水分子可以將它們充分隔開，于是蛋白質(zhì)就以無定形沉淀或結(jié)晶的形式從溶液中析出。1.酶的結(jié)晶方法（1）鹽析法在適當(dāng)?shù)膒H

7、、溫度等條件下，保持酶的穩(wěn)定性，慢慢改變鹽濃度進行結(jié)晶。結(jié)晶時采用的鹽有硫酸銨，檸檬酸鈉，乙酸銨，硫酸鎂等。利用硫酸銨結(jié)晶時一般是把鹽加入到一個比較濃的酶溶液中，并使溶液微呈渾濁為止。然后放置，并且非常緩慢地增加鹽濃度。操作要在低溫下進行，緩沖液pH要接近酶的等電點。（2）有機溶劑法酶液中滴加有機溶劑，有時也能使酶形成結(jié)晶。結(jié)晶用溶劑有：乙醇，丙醇，丁醇，乙腈，異丙醇，二惡烷，二甲亞砜，二氧雜環(huán)已烷。（3）復(fù)合結(jié)晶法有時可以利用某些酶與有機化合物或金屬離子形成復(fù)合物或成鹽的性質(zhì)來結(jié)晶。（4）透析平衡利用透析平衡進行結(jié)晶也是常用方法之一。（5）等電點法2.結(jié)晶條件的選擇（1）酶的純度酶只有達(dá)到相

8、當(dāng)純度后才能結(jié)晶。酶的純度越高，結(jié)晶越容易，長成大的結(jié)晶可能性也越大。（2）酶的濃度結(jié)晶母液盡可能保持高的濃度。酶的濃度越高越有利于溶液中溶質(zhì)分子間的相互碰撞聚合，形成結(jié)晶的機會也越大。（3）溫度（4）時間（5）pH有時相差0.2pH，只能達(dá)到沉淀，而不能達(dá)到晶體。（6）金屬離子許多金屬離子能引起或有助于酶的結(jié)晶。（7）晶種（8）結(jié)晶器皿處理。（四）酶分離和純化工作中的注意事項1.防止酶蛋白變性2.防止輔因子的流失3.防止酶被蛋白水解酶降解第三節(jié) 酶類藥物一、藥用酶類的概述早期酶制劑主要用于治療消化道疾病，燒傷及感染引起的炎癥。（一）促進消化酶類（二）消炎酶（三）與纖維蛋白溶解作用相關(guān)的酶類（

9、四）抗腫瘤的酶（五）其它藥用酶二、重要的酶類藥物（一）胃蛋白酶胃蛋白酶廣泛存在于哺乳動物的胃液中。1.組成（結(jié)構(gòu)）、性質(zhì)藥用胃蛋白酶是胃液中多種蛋白水解酶的化合物，含有胃蛋白酶，組織蛋白酶，膠原酶等，為粗制的酶制劑。性狀：外觀為淡黃色粉末，等等臨床上主要用于因食蛋白過多，引起的消化不良及病后恢復(fù)期消化機能減退等。2.生產(chǎn)工藝（1）工藝路線豬胃粘膜自溶液上清液成品自溶，過濾H2O, HCl氯仿脫脂濃縮干燥（2）工藝過程自溶、過濾在夾層鍋內(nèi)預(yù)先加水100L及鹽酸，加熱至50時，加入200kg豬胃粘膜，快速攪拌使酸度均勻，保持4548,消化34小時。用紗布濾去未消化的組織蛋白，收集濾液。脫脂、去雜質(zhì)

10、將濾液降溫至30以下，靜防2448h，使雜質(zhì)沉淀除去，得到脫脂酶液。濃縮干燥取脫脂酶液，在40以下濃縮到原體積的1/4，真空干燥，球磨，得到產(chǎn)品。（四）尿激酶尿激酶是一種堿性蛋白酶，由腎臟產(chǎn)生，主要存在于人和哺乳動物的尿中。人尿平均含有56U/ml。1.組成性質(zhì)（1）尿激酶有多種分子量形式，主要有31300、54700兩種。尿中的尿胃蛋白酶原在酸性條件下可以激活生成尿胃蛋白酶，后者可以把分子量54700的天然尿激酶降解為分子量為31300尿激酶。（2）尿激酶是專一性很強的蛋白水解酶，血纖維蛋白溶酶原是它唯一的天然蛋白質(zhì)底物，它作用于精氨酸纈氨酸鍵使得纖溶酶原轉(zhuǎn)為纖溶酶。（3）尿激酶的pI為pH

11、8-9.臨床上，尿激酶已經(jīng)廣泛應(yīng)用于治療各種新血栓形成或血栓梗塞疾病。2.生產(chǎn)工藝（1)工藝路線：男性尿10pH8.5上清尿液沉淀pH55.5酸化酸化尿硅藻土吸附硅藻土吸附物洗滌硅藻土柱洗脫洗脫液去熱源，去色素pH8.0流出液CMC柱洗脫液透析液產(chǎn)品（2）工藝過程收尿 收集男性尿沉淀處理 尿液冷至10以下，用NaOH調(diào)pH至8.5,靜置1h，虹吸上清液。用鹽酸調(diào)至pH5.05.5。硅藻土吸附 處理好的尿液加入1%尿量的硅藻土，于5C下攪拌吸附1h。洗脫 硅藻土吸附物洗滌裝柱，先用0.02%氨水加0.1mol/L氯化鈉洗脫，當(dāng)洗脫液油清變混時開始收集除熱源、去色素CMC濃縮透析除鹽（九）超氧化物

12、歧化酶（SOD）超氧化物歧化酶是一種重要的氧自由基清除劑，作為藥用酶在美國、德國、澳大利亞等國已有產(chǎn)品。由于SOD能專一性去除超氧陰離子自由基，故引起國內(nèi)外生化界和醫(yī)藥界的極大關(guān)注。目前臨床上應(yīng)用集中在自身免疫性疾病上如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，紅斑性狼瘡，皮肌炎等1.組成性質(zhì)SOD屬金屬酶，其性質(zhì)不僅取決于蛋白質(zhì)部分，還取決于活性中心金屬離子的存在。按照金屬離子的不同，SOD有Cu，ZnSOD，MnSOD和FeSOD。SOD是一種金屬蛋白，因此它對熱，pH及在某些性質(zhì)上表現(xiàn)出異常的穩(wěn)定性。對熱穩(wěn)定性 SOD對熱穩(wěn)定，天然牛血SOD在75C下加熱數(shù)分鐘，其酶活性喪失很小。但SOD對熱穩(wěn)定性與溶液的離子強度

13、有關(guān)。pH對SOD的影響 SOD在pH5.310.5范圍穩(wěn)定。吸收光譜金屬輔基與酶活性含金屬配基Cu與Zn，Zn僅與酶分子結(jié)構(gòu)有關(guān)，而與催化活性無關(guān)，而Cu與催化活性有關(guān)，透析法除去Cu則酶活全部喪失，一旦重新加入Cu，酶活性又可恢復(fù)。2.生產(chǎn)工藝分離純化SOD常根據(jù)原料，種類和性質(zhì)的差異而有所不同。（1）牛紅細(xì)胞提取Cu，ZnSOD的生產(chǎn)工藝：新鮮牛血收集除血漿離心紅細(xì)胞浮選2NaCl干凈紅細(xì)胞溶血溶血液去血紅蛋白乙醇、氯仿上清分級沉淀丙酮沉淀物熱變性SOD粗酶液超濾濃縮液柱層析精制濃縮液冷凍干燥凍干粉（2）工藝過程1）收集、浮選 取新鮮牛血，離心除去血漿。2）溶血、去血紅蛋白：干凈紅細(xì)胞加水溶血30min，然后加入0.25倍體積的乙醇和0.15倍體積的氯仿，攪拌15min，離心去血紅蛋白，收集上清液。3）沉淀、熱變性：將上述清液