1、PCRPCR實驗室實驗室檢測技術檢測技術寧 夏 動 物 疾 病 預 防 控 制 中 心寧 夏 動 物 疾 病 預 防 控 制 中 心2019.08.042019.08.04PCR檢測技術 一、一、 PCRPCR技術原理技術原理 DNA DNA在細胞中的復制是在細胞中的復制是個比較個比較復雜的過程。參與復制的基本因復雜的過程。參與復制的基本因素有：素有：DNADNA聚合酶、聚合酶、DNADNA連接酶、連接酶、DNADNA模板、由引發酶合成的模板、由引發酶合成的RNARNA引引物、核苷酸原料、無機離子、合物、核苷酸原料、無機離子、合適的適的pHpH、以及解開、以及解開DNADNA的超螺旋及的超螺旋

2、及雙螺旋等結構的若干酶與蛋白質雙螺旋等結構的若干酶與蛋白質因子等。因子等。 PCR PCR是在試管中進行是在試管中進行DNADNA復制反應，基本原復制反應，基本原理與體內相似，不同之處是耐熱的理與體內相似，不同之處是耐熱的TaqTaq酶取代酶取代DNADNA聚合酶，用合成的聚合酶，用合成的DNADNA引物替代引物替代RNARNA引物，引物，用加熱用加熱( (變性變性) )、冷卻、冷卻( (退火退火) )、保溫、保溫( (延伸延伸) )等改等改變溫度的辦法使變溫度的辦法使DNADNA得以復制，反復進行變性、得以復制，反復進行變性、退火、延伸循環，就可使退火、延伸循環，就可使DNADNA無限擴增。

3、將擴無限擴增。將擴增產物進行電泳，經溴化乙錠染色，在紫外燈增產物進行電泳，經溴化乙錠染色，在紫外燈照射下一般都可見到照射下一般都可見到DNADNA的特異擴增條帶。的特異擴增條帶。二、二、PCRPCR技術工作流程及注意事項技術工作流程及注意事項 （一（一PCRPCR實驗室的布局實驗室的布局 PCRPCR只需幾個只需幾個DNADNA分子作模板就可大量擴增，應注意防止反應體系被痕量分子作模板就可大量擴增，應注意防止反應體系被痕量DNADNA模板污染和交叉污染，這也是最容易造成假陽性原因之一。實驗室布局模板污染和交叉污染，這也是最容易造成假陽性原因之一。實驗室布局應重點考慮避免這種污染。因此用于應重點

4、考慮避免這種污染。因此用于PCRPCR檢測的實驗室要進行功能區域劃分，從對環境要求的嚴格程度和功能上可將檢測的實驗室要進行功能區域劃分，從對環境要求的嚴格程度和功能上可將PCRPCR整個實驗流程劃分為四個區域：整個實驗流程劃分為四個區域： 1.1.配液區準備區）配液區準備區） 2.2.模板提取區模板提取區 3.PCR3.PCR擴增區擴增區 4.4.電泳區電泳區 （二各區操作注意事項（二各區操作注意事項下述操作在該區進行：下述操作在該區進行： 儲存試劑的制備、試劑的分裝和主反應混儲存試劑的制備、試劑的分裝和主反應混合液的制備。合液的制備。在本區的實驗操作過程中，必須戴手套并經常更在本區的實驗操作

5、過程中，必須戴手套并經常更換。換。操作中使用一次性帽子也是一個有效地防止污染操作中使用一次性帽子也是一個有效地防止污染的措施。的措施。工作結束后必須立即對工作區進行清潔。工作結束后必須立即對工作區進行清潔。實驗室及其設備的使用必須有日常記錄。實驗室及其設備的使用必須有日常記錄。 2. 2. 模板制備區模板制備區 下述操作在該區進行：下述操作在該區進行： 標本保存、核酸標本保存、核酸RNARNA、DNADNA提取、貯存提取、貯存及其加入至擴增反應管和測定及其加入至擴增反應管和測定RNARNA時時cDNAcDNA的合成。的合成。為避免樣本間的交叉污染，加入待測核酸后，必須為避免樣本間的交叉污染，加

6、入待測核酸后，必須蓋好含反應混合液的反應管。蓋好含反應混合液的反應管。對具有潛在傳染危險性的材料，必須有明確的樣本對具有潛在傳染危險性的材料，必須有明確的樣本處理和滅活程序。處理和滅活程序。樣本處理對核酸擴增有很大影響，必須使用有效的樣本處理對核酸擴增有很大影響，必須使用有效的核酸提取方法。核酸提取方法。3. 3. 擴增區擴增區下述操作在該區進行：下述操作在該區進行：DNADNA或或RNARNA擴增。擴增。不能從本區再進入任何不能從本區再進入任何“上游上游區域，可降低區域，可降低本區的氣壓以避免氣溶膠從本區漏出。本區的氣壓以避免氣溶膠從本區漏出。為避免氣溶膠所致的污染，盡量減少在本區的為避免氣

7、溶膠所致的污染，盡量減少在本區的走動。走動。4.4.電泳區電泳區 下述操作在本區內進行：擴增片段的測定。下述操作在本區內進行：擴增片段的測定。本區是最主要的擴增產物污染來源，因此必須注意本區是最主要的擴增產物污染來源，因此必須注意避免通過本區的物品及工作服將擴增產物帶出。避免通過本區的物品及工作服將擴增產物帶出。本區有可能會用到某些可致基因突變和有毒物質如本區有可能會用到某些可致基因突變和有毒物質如溴化乙錠、丙稀酰胺、甲醛或同位素等，應注意實溴化乙錠、丙稀酰胺、甲醛或同位素等，應注意實驗人員的安全防護。驗人員的安全防護。本區如采用負壓或減壓情況下可減少擴增產物從本本區如采用負壓或減壓情況下可減

8、少擴增產物從本區擴散至前面區域的可能性。區擴散至前面區域的可能性。 （三） PCR實驗室設置的原則 注意：唯一流向制度問題 ：要求物流、人流均應嚴格遵守1 2 3 4路線，嚴禁倒流。 物品的專用與移動問題 ：移液器、吸頭和離心管等為PCR專用，各區之間勿串用三、PCR操作程序n一是一是PCRPCR擴增模板的制備，也就是病原微擴增模板的制備，也就是病原微生物基因組提取生物基因組提取n二是二是PCRPCR擴增，即目的基因特異擴增過程擴增，即目的基因特異擴增過程n三是瓊脂糖凝膠電泳分析，在紫外燈下三是瓊脂糖凝膠電泳分析，在紫外燈下檢測基因片段檢測基因片段*PCR模板的提取（一樣品的采集及前處理（一樣

9、品的采集及前處理活禽，建議取咽喉拭子和泄殖腔拭子：取咽喉拭活禽，建議取咽喉拭子和泄殖腔拭子：取咽喉拭子時將拭子深入喉頭口來回刮幾次取咽喉分泌子時將拭子深入喉頭口來回刮幾次取咽喉分泌液，取泄殖腔拭子時將拭子深入瀉殖腔轉一圈液，取泄殖腔拭子時將拭子深入瀉殖腔轉一圈沾取糞便。然后將拭子一起放入盛有沾取糞便。然后將拭子一起放入盛有2ml PBS2ml PBS含抗菌素的試管，充分洗滌拭子，然后在含抗菌素的試管，充分洗滌拭子，然后在管壁擠干液體，轉入無菌離心管中備用。管壁擠干液體，轉入無菌離心管中備用。組織臟器，取待檢樣品組織臟器，取待檢樣品0.05g0.05g于已洗凈、滅菌并烘于已洗凈、滅菌并烘干的研缽

10、中充分研磨，加干的研缽中充分研磨，加2ml PBS2ml PBS混勻，取上清混勻，取上清轉入無菌離心管中備用。轉入無菌離心管中備用。血清、血漿、乳汁、精液或組織滲出液，則直接血清、血漿、乳汁、精液或組織滲出液，則直接取用。取用。 （二提取模板（二提取模板n提取病原微生物基因組是提取病原微生物基因組是PCRPCR操作成功關操作成功關鍵的一步，特別是病原鍵的一步，特別是病原RNARNA的提取顯得非的提取顯得非常重要。一般分為兩步：常重要。一般分為兩步：n 1.1.裂解病原微生物，使病原基因組裂解病原微生物，使病原基因組從病原體溢出。從病原體溢出。n 2.2.純化病原基因組，去除蛋白質和純化病原基因

11、組，去除蛋白質和一些鹽類。一些鹽類。（三病原微生物基因組提取注意事項（三病原微生物基因組提取注意事項1.RNA1.RNA提取應注意提取應注意RNARNA酶酶RNaseRNase污染問題，污染問題，RNaseRNase是一種不怕熱和不易降解的蛋白質，是一種不怕熱和不易降解的蛋白質，而且廣泛存在于我們工作環境中，對于此而且廣泛存在于我們工作環境中，對于此酶污染的防治辦法主要有兩方面：酶污染的防治辦法主要有兩方面：在提在提取取RANRAN試劑中加入一些試劑中加入一些RNase RNase 抑制劑抑制劑 操操作過程中保持環境干凈、密閉、戴口罩手作過程中保持環境干凈、密閉、戴口罩手套操作等。套操作等。2

12、.在病原微生物基因組提取時，由于是微量，幾乎看不見。所以當離心機離心沉淀RNA和DNA時要記住離心管方向，加入乙醇洗沉淀時要緩慢加入，避免沖掉已提取出來的模板。溶解沉淀時要沿著沉淀部位進行溶解。3.在病原微生物基因組提取時，應注意實驗室環境污染和操作人員安全防護。（四實驗器材必須使用PCR專用吸頭試劑盒的運輸和貯存試劑盒的運輸和貯存nPCRPCR試劑盒在適當的貯存溫度下的有效期試劑盒在適當的貯存溫度下的有效期一般為一般為6 6個月個月n核酸擴增部分的試劑一般要貯存于核酸擴增部分的試劑一般要貯存于-20-20產物檢測部分試劑則貯存于產物檢測部分試劑則貯存于2 288。*PCR擴增（一PCR反應體

13、系組成 PCR緩沖液(含Mg2) 模板 4種dNTP 引物 Taq酶（二PCR擴增程序： 擴增程序實際上是一個3種不同溫度的熱循環程序。包括高溫變性：將病原微生物基因模板94 條件下，使得雙鏈DNA分子變成單鏈DNA。有利于下一步的引物結合。低溫退火：在40至60 條件下，使引物與單鏈DNA結合的過程。便于下一步新DNA鏈形成 適溫延伸：在72條件下，沿引物合成新的DNA鏈。 在這3個溫度條件下循環30至35次，可將病原微生物特定的DNA片段放大百萬倍。（三PCR擴增注意事項n試劑：盡量分裝，不要原瓶多次取用。試劑：盡量分裝，不要原瓶多次取用。n加入模板切忌噴霧污染，在吸取液體時，加入模板切忌

14、噴霧污染，在吸取液體時，盡量避免用力過快吸取。避免反應成分或盡量避免用力過快吸取。避免反應成分或模板噴到移液器上，污染移液器和環境。模板噴到移液器上，污染移液器和環境。所有非即用管都應蓋嚴。加模板所有非即用管都應蓋嚴。加模板DNADNA后應后應更換手套。更換手套。*瓊脂糖凝膠電泳分析n擴增基因片段需要進行瓊脂糖凝膠電泳分析，依據擴擴增基因片段需要進行瓊脂糖凝膠電泳分析，依據擴增增DNADNA片段在電泳中遷移的距離判定其大小，與已知擴片段在電泳中遷移的距離判定其大小，與已知擴增基因片段相比較來判定增基因片段相比較來判定PCRPCR擴增效果。擴增效果。n在進行瓊脂糖凝膠電泳分析時，一般情況下先在凝

15、膠在進行瓊脂糖凝膠電泳分析時，一般情況下先在凝膠中加中加1%1%溴化乙錠溴化乙錠EB)(EB)(每每100ml100ml加加10ul)10ul)然后將已經制然后將已經制備好的備好的1%-2%1%-2%瓊脂糖凝膠用電泳緩沖液配制放入電瓊脂糖凝膠用電泳緩沖液配制放入電泳槽內，加入待檢樣品，同時用分子量標準品作標記。泳槽內，加入待檢樣品，同時用分子量標準品作標記。待檢樣品進入凝膠內溴酚藍遷移待檢樣品進入凝膠內溴酚藍遷移2-3cm2-3cm后，切斷電源，后，切斷電源，取出凝膠在紫外燈下觀察結果。取出凝膠在紫外燈下觀察結果。n由于由于EBEB可與雙鏈可與雙鏈DNADNA形成結合物，在紫外燈下能發射熒形成

16、結合物，在紫外燈下能發射熒光，使光，使EBEB的熒光強度增強的熒光強度增強80-10080-100倍，所以，電泳后凝倍，所以，電泳后凝膠在紫外燈下可直接觀察。膠在紫外燈下可直接觀察。電泳所需試劑n瓊脂糖瓊脂糖n溴化乙錠溴化乙錠n電泳緩沖液電泳緩沖液n上樣緩沖液上樣緩沖液nMackerMacker電泳槽電泳儀 凝膠成像系統PCR結果。1、對照(無模板)；26、PCR產物5ul樣品）瓊脂糖凝膠電泳分析注意事項n電泳上樣時避免電泳上樣時避免PCRPCR產物漂移到其他孔而產物漂移到其他孔而影響結果判定。影響結果判定。n用電泳緩沖液制備瓊脂糖凝膠。用電泳緩沖液制備瓊脂糖凝膠。n溴化乙錠溴化乙錠EBEB為

17、強致癌物質，必須戴為強致癌物質，必須戴手套謹慎操作，搖動時不要外濺。手套謹慎操作，搖動時不要外濺。四、PCR檢測常見問題與解決途徑 n利用利用PCRPCR方法檢測時，經常出現假陽性、假陰方法檢測時，經常出現假陽性、假陰性、非特異性擴增和涂抹帶。尤其是假陽性和性、非特異性擴增和涂抹帶。尤其是假陽性和假陰性可使檢測結果得出錯誤結論，有時可造假陰性可使檢測結果得出錯誤結論，有時可造成嚴重后果。為了提高檢測的準確性和可靠性，成嚴重后果。為了提高檢測的準確性和可靠性，PCRPCR檢測應盡量減少假陽性、假陰性、非特異檢測應盡量減少假陽性、假陰性、非特異性擴增和涂抹帶現象的發生。一個好的性擴增和涂抹帶現象的

18、發生。一個好的PCRPCR方方法不但要求特異性好、靈敏度高、還要求具有法不但要求特異性好、靈敏度高、還要求具有高的可重復性、重現性，盡量減少假陽性、假高的可重復性、重現性，盡量減少假陽性、假陰性和非特異性擴增。陰性和非特異性擴增。（一假陽性： 造成假陽性的原因1. 樣品間交叉污染：樣本污染主要有收集樣本的容器被污染，或樣本放置時，由于密封不嚴溢于容器外，或容器外粘有樣本而造成相互間交叉污染；樣本核酸模板在提取過程中，由于吸樣槍污染導致標本間污染；2. PCR試劑的污染：主要是由于在PCR試劑配制過程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。3. PCR擴增產物污染：這是PCR

19、反應中最主要最常見的污染問題。因為PCR產物拷貝量大(一般為1013拷貝/ml)，遠遠高于PCR檢測數個拷貝的極限，所以極微量的PCR產物污染，就可形成假陽性。 4. 氣溶膠污染：在空氣與液體面摩 擦時就可形成氣溶膠，在操作時比較劇烈地搖動反應管，開蓋時、吸樣時及污染進樣槍的反復吸樣都可形成氣溶膠而污染。據計算一個氣溶膠顆粒可含48000拷貝，因而由其造成的污染是一個值得特別重視的問題。假陽性問題的試驗控制在每次PCR檢測時，一定設立陰性對照樣品和陽性對照樣品。陰性對照樣品檢測為陰性時，表明試驗全部過程的試劑沒有受到污染；陽性對照樣品檢測為陽性時，表明DNA提取RNA提取、RNA反轉錄）、DNA擴增和電泳鑒定工作體系正常。在陰性對照樣品和陽性對照樣品檢測結果成立的前提下，才能對檢測樣品進行判定。只有設立試驗全程的對照，才能證明試驗結果成立。（二假陰性n 如果實驗中設置的陽性對照未能擴增成陽性結果，提示本次實驗中可能有假陰性結果。但這里應注意，