1、第三章第三章 海洋藥物研究的關鍵技術海洋藥物研究的關鍵技術第一節第一節 生物活性篩選技術生物活性篩選技術一、什么是生物活性篩選技術？ 通過活性評價模型，判斷化合物作用的原理和方法相結合的手段生物活性bioactivity是指能引起細胞正常機理發生改變的能力生物活性化合物，是來自生物體內的對生命現象有影響的微量或少量物質。如：糖類、脂類、多肽類、甾醇類、生物堿、甙類、大環內脂等。二、為什么利用生物活性篩選技術？ 發現生物活性化合物 新藥發現的導向和指針 體現著藥學和生命科學的最新研究成果三、生物活性篩選技術有哪些特點？ 體現著生理學、病理學和藥理學的研究進展 同一種疾病的治療藥物可以通過多種生物

2、活性篩 選方法進行探索 生物活性篩選是多層次和多靶點的 如膽固醇的合成及其相關酶 乙酰基（C2）異戊二烯（C5）鯊烯（C30）膽固醇（C27）A. 乙酰CoA合成異戊烯焦磷酸（IPP） 2分子乙酰CoA經硫解酶催化縮合成乙酰乙酰CoA，由HMG- CoA合成酶催化結合1分子乙酰CoA，生成-羥基-甲基戊二酸單酰CoA（HMG- CoA）， HMG- CoA還原酶（限速酶）催化其生成甲羥戊酸（MVA），消耗2分子NADPH。甲羥戊酸經磷酸化、脫羧三步酶促反應生成活潑的異戊烯焦磷酸（IPP）。B.鯊烯的合成 一種異構酶催化異戊烯焦磷酸轉換成二甲烯丙基焦磷酸（DPP）。然后它按照頭對尾方式與另一分子

3、異戊烯焦磷酸縮合成10C牻牛兒焦磷酸。再按頭對尾方式與另一分子異戊烯焦磷酸縮合成15C焦磷酸法尼酯（FPP），2分子FPP由鯊烯合成酶催化，仍然按頭對尾方式縮合成30C的鯊烯。C.鯊烯轉換為膽固醇 鯊烯轉換為膽固醇的過程很復雜，一個中間產物是羊毛固醇，涉及加氧、環化，形成由四個環組成的膽固醇核的反應。而由羊毛固醇到膽固醇還要經過甲基的轉移、氧化、脫羧等約20步反應。膽甾-5-烯-3-醇膽固醇四、生物活性篩選類型Bioactivity Screening 動物水平 細胞水平 分子水平模型特點應用特點常見方法疾病模型動物疾病模型動物天天然或誘導然或誘導預測臨床療效預測臨床療效和藥用前景和藥用前景腫

4、瘤、血栓、動脈硬化。神經系統疾病動物模型、循環系統疾病動物模型、呼吸系統疾病動物模型、消化系統疾病動物模型。常見人類疾病動物模型的制備方法，北京大學醫學出版社環節動物、海膽、海蝦、水螅、金魚、斑馬魚腫瘤細胞腫瘤細胞 細菌細菌腫瘤藥物篩選腫瘤藥物篩選抗生物質篩選抗生物質篩選HelaHela細胞、細胞、P388P388細胞細胞稻瘟病菌稻瘟病菌酶激動劑或抑制劑酶激動劑或抑制劑受體激動劑或抑制劑受體激動劑或抑制劑抗原抗體反應抗原抗體反應抗腫瘤、抗血栓、抗抗腫瘤、抗血栓、抗糖尿病、抗病毒、抗糖尿病、抗病毒、抗炎、降血壓、降血脂炎、降血壓、降血脂DNADNA拓撲異構酶、蛋拓撲異構酶、蛋白激酶、乙酰膽堿酯白

5、激酶、乙酰膽堿酯酶等近酶等近800800種種五、典型生物活性篩選方法五、典型生物活性篩選方法含麥角甾醇含麥角甾醇瓊脂板瓊脂板無麥角甾無麥角甾醇醇瓊脂板瓊脂板白念珠菌白念珠菌Monilia albican 1.1.瓊脂板擴散法瓊脂板擴散法海洋生物提取物海洋生物提取物海綿海綿3 3種海綿抗真菌種海綿抗真菌不受麥角甾醇影響不受麥角甾醇影響3 3種海綿減弱種海綿減弱1010種海綿抗真菌種海綿抗真菌(22E,24R)-麥角甾烷-5,7,22-三烯-3-醇2. 2. 抗腫瘤藥物篩選方法抗腫瘤藥物篩選方法圖3-1六、高通量和高內涵篩選六、高通量和高內涵篩選1.什么是高通量篩選？高通量篩選(High thro

6、ughput screening，HTS)技術是指以分子水平和細胞水平的實驗方法為基礎，以微板形式作為實驗工具載體，以自動化操作系統執行試驗過程，以靈敏快速的檢測儀器采集實驗結果數據，以計算機分析處理實驗數據，在同一時間檢測數以千萬的樣品，并以得到的相應數據庫支持運轉的技術體系。它具有微量、快速、靈敏和準確等特點。簡言之就是可以通過一次實驗獲得大量的信息，并從中找到有價值的信息。FLIPR (fluorometricimagingreadet)熒光檢測法熒光檢測法Alpha (Amplified Luminescence Proximity Homogeneous Assay) Screen檢

7、測法檢測法2. 什么是高內涵篩選技術？高內涵篩選（High Content Screening，HCS）是在保持細胞結構和功能完整性的前提下，同時檢測被篩樣品對細胞形態、生長、分化、遷移、凋亡、代謝途徑及信號轉導各個環節的影響，在單一實驗中獲取大量相關信息，確定其生物活性和潛在毒性。從技術層面而言，高內涵篩選是一種應用高分辨率的熒光數碼影像系統，在細胞水平上檢測多個指標的多元化、功能性篩選技術，旨在獲得被篩樣品對細胞產生的多維立體和實時快速的生物效應信息。3. 高通量篩選技術和高內涵篩選技術的差別？高通量篩選技術高通量篩選技術 高內涵篩選技術高內涵篩選技術檢測檢測范圍范圍化合物活性化合物活性靶點激活、細胞凋亡、分裂指數、靶點激活、細胞凋亡、分裂指數、蛋白轉位、細胞活力、細胞遷移、蛋白轉位、細胞活力、細胞遷移、受體內化、細胞毒性、細胞周期和受體內化、細胞毒性、細胞周期和信號轉導等信號轉導等檢測檢測特性特性數據平均性數據平均性細胞和分子細胞和分子數據豐富性，立體性，多樣性數據豐富性，立體性，多樣性細胞細胞檢測檢測特性特性檢測分析儀器檢測分析儀器熒光顯微系統、熒光圖像獲取系統、熒光顯微系統、熒光圖像獲取系統、檢測分析儀器、圖像處理分析軟件、檢測分析儀器、圖像處理分析軟件、接管分析和數據管理系統接管分析和數據管理系統第二節第二節 分離純化技術分離純化技