1、植物生物工程實驗植物生物工程實驗植物植物DNA提取、質量檢測提取、質量檢測及特定基因片段操作及特定基因片段操作綜合實驗二綜合實驗二郝大海郝大海實驗目的實驗目的l了解植物DNA提取方法，熟悉操作步驟l掌握植物大分子操作注意事項及試劑用具準備方法l掌握DNA質量紫外分光光度計檢測方法l了解PCR原理，熟悉操作步驟l掌握核酸的瓊脂糖電泳檢測方法l 保證保證DNA一級結構的完整性一級結構的完整性l 排除其它分子的污染排除其它分子的污染 RNA、蛋白質、多糖等、蛋白質、多糖等DNA提取的原則提取的原則實驗原理（實驗原理（DNA提?。┨崛。〥NA存在部位存在部位l主要存在于主要存在于細胞核中，細胞核中，線

2、粒體和葉線粒體和葉綠體中也少綠體中也少量存在量存在l基因組基因組DNA的提取的提取l CTAB法法l SDS法法l質粒質粒DNA的提取的提取l堿裂解法堿裂解法l煮沸法煮沸法l線粒體、葉綠體線粒體、葉綠體DNA的提取的提取l差速離心結合差速離心結合SDS裂解法裂解法DNA提取的方法提取的方法l在濃氯化鈉溶液在濃氯化鈉溶液(12mol/L)中中,DNA核蛋白的溶解核蛋白的溶解度很大度很大,RNA核蛋白的溶解度很小核蛋白的溶解度很小;而在稀氯化鈉溶而在稀氯化鈉溶液液(0.14mol/L)中中,DNA核蛋白的溶解度很小核蛋白的溶解度很小,RNA核核蛋白的溶解度很大蛋白的溶解度很大.因此因此,可利用不同

3、濃度的氯化鈉可利用不同濃度的氯化鈉溶液將溶液將DNA核蛋白和核蛋白和RNA核蛋白從樣品中分別抽提核蛋白從樣品中分別抽提出來出來.l分離得到核蛋白后分離得到核蛋白后,需進一步將蛋白等雜質除去需進一步將蛋白等雜質除去,常采用的去除蛋常采用的去除蛋白的方法有白的方法有3種種:用含辛醇或異戊醇的氯仿振蕩核蛋白溶液用含辛醇或異戊醇的氯仿振蕩核蛋白溶液,使其乳化使其乳化,然后離心然后離心除去變性蛋白質除去變性蛋白質,此時蛋白質凝膠停留在水相和氯仿相中間此時蛋白質凝膠停留在水相和氯仿相中間,而而DNA溶于上層水相溶于上層水相.用兩倍體積用兩倍體積95%乙醇溶液將乙醇溶液將DNA鈉鹽沉淀出鈉鹽沉淀出來來.如果

4、用酸性乙醇或冰乙酸來沉淀如果用酸性乙醇或冰乙酸來沉淀,得到的是游離的得到的是游離的DNA.用十二烷基硫酸鈉用十二烷基硫酸鈉(SDS)等去污劑使蛋白質變性等去污劑使蛋白質變性,與核酸分離與核酸分離,從而從材料中直接提取出從而從材料中直接提取出DNA.用苯酚處理用苯酚處理,然后離心分層然后離心分層,DNA或溶于上層水相或溶于上層水相,或存在于中間或存在于中間殘留物中殘留物中,蛋白變性后則停留在酚層內蛋白變性后則停留在酚層內.吸出上面水層吸出上面水層,將其注入兩將其注入兩倍體積的倍體積的95%乙醇溶液中乙醇溶液中,得到白色纖維狀得到白色纖維狀DNA沉淀沉淀CTAB法原理法原理CTABCTAB溶液在低

5、于溶液在低于15 15 時會形成沉淀析出，因此在將其加入冰冷時會形成沉淀析出，因此在將其加入冰冷的的植物材料之前必須預熱，且離心時溫度不要低于植物材料之前必須預熱，且離心時溫度不要低于1515。CTAB CTAB提取緩沖液的經典配方提取緩沖液的經典配方 組份組份 Tris-HCl （pH8.0）EDTA （pH8.0） NaCl CTAB-巰基乙醇巰基乙醇 終濃度終濃度 100 mM 20 mM 1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入使用前加入SDS法法l原理原理lSDS 陰離子去垢劑陰離子去垢劑 高溫（5565）裂解細胞，蛋白變性，染色體離析l高鹽高鹽(KAc或或NH4Ac) 或

6、降低溫度（冰?。┗蚪档蜏囟龋ū。?使蛋白質及多糖雜質沉淀l上清液中的上清液中的DNA用酚用酚/氯仿抽提氯仿抽提l乙醇沉淀水相中的DNASDS 組份組份 Tris-HCl （pH8.0）EDTA （pH8.0）NaCl SDS 終濃度終濃度 100mM 20 mM1.4M2%(W/V)SDS提取緩沖液的配方提取緩沖液的配方DNA提取基本步驟提取基本步驟 l多糖的去除：多糖的去除：l多糖水解酶多糖水解酶l蛋白質的去除：蛋白質的去除：l酚酚/氯仿抽提氯仿抽提l使用變性劑（使用變性劑（SDS、異硫氰酸胍、異硫氰酸胍等）等）l蛋白酶處理蛋白酶處理l多酚的去除：多酚的去除：l加入還原劑：加入還原劑：-巰

7、基乙醇、抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等巰基乙醇、抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等l加入易與酚類結合的試劑：如加入易與酚類結合的試劑：如PVP、PEG，可防止酚類與，可防止酚類與DNA的結合的結合l鹽離子的去除：鹽離子的去除：l70的乙醇洗滌的乙醇洗滌p 若長期儲存建議使用若長期儲存建議使用TE緩沖液溶解緩沖液溶解p pH值為值為8.0，可防止，可防止DNA發生酸解發生酸解DNA質量檢測質量檢測l紫外分光光度計檢測法紫外分光光度計檢測法嘌呤和嘧啶的母環含有共軛雙鍵，嘌呤和嘧啶的母環含有共軛雙鍵，因此也有紫外吸收現象，且在因此也有紫外吸收現象，且在260nm和和280nm處也存在吸收處也存在吸收

8、峰。蛋白質中含苯環的氨基酸在峰。蛋白質中含苯環的氨基酸在這兩個波長下也會發生光吸收。這兩個波長下也會發生光吸收。因此，通過因此，通過260nm和和280nm下下樣品的吸收值比率可判斷核酸純樣品的吸收值比率可判斷核酸純度度A：測：測DNA： 純的純的DNA樣品樣品OD260/OD280應為應為1.8，OD260mOD230應大于應大于2.0。1) OD260/OD280大于大于1.9時，表明有時，表明有RNA污染。污染。2) 小于小于1.6時，表明樣品中存在蛋白質或酚污染；時，表明樣品中存在蛋白質或酚污染；3) OD260/OD230小于小于2.0時，表明溶液中有殘存的鹽和小分時，表明溶液中有殘

9、存的鹽和小分子雜質，如核苷酸、氨基酸、酚等。子雜質，如核苷酸、氨基酸、酚等。注：注： 可能可能出現既含蛋白質又含出現既含蛋白質又含RNA的的DNA溶液比值為溶液比值為1.8的的情況。情況。 測定結果分析測定結果分析瓊脂糖電泳瓊脂糖電泳l瓊脂糖凝膠電泳是常用的用于分離、鑒定瓊脂糖凝膠電泳是常用的用于分離、鑒定DNA、RNA分子混合物的方法，這種電泳方分子混合物的方法，這種電泳方法以瓊脂凝膠作為支持物，利用法以瓊脂凝膠作為支持物，利用DNA分子在分子在泳動時的電荷效應和分子篩效應，達到分離混泳動時的電荷效應和分子篩效應，達到分離混合物的目的。合物的目的。DNA分子在高于其等電點的溶分子在高于其等電

10、點的溶液中帶負電，在電場中向陽極移動。在一定的液中帶負電，在電場中向陽極移動。在一定的電場強度下，電場強度下，DNA分子的遷移速度取決于分分子的遷移速度取決于分子篩效應，即分子本身的大小和構型是主要的子篩效應，即分子本身的大小和構型是主要的影響因素。影響因素。DNA分子的遷移速度與其相對分分子的遷移速度與其相對分子量成反比。子量成反比。lDNA、RNA在熒光染料溴乙錠在熒光染料溴乙錠(EB)嵌入堿基嵌入堿基平面之間后，平面之間后，DNA、RNA樣品在紫外光激發樣品在紫外光激發下，可發出紅色熒光，熒光強度與核酸含量下，可發出紅色熒光，熒光強度與核酸含量成正比。使用一系列已知的不同濃度成正比。使用

11、一系列已知的不同濃度DNA溶溶液作標準對照，可比較出被測液作標準對照，可比較出被測DNA溶液濃度。溶液濃度。l 注意：此法的比較主要基于目測，是估計水注意：此法的比較主要基于目測，是估計水平。平。l當用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙啶當用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色，在紫外光下染色，在紫外光下至少可以檢出至少可以檢出1-10ng的的DNA條帶，從而可以條帶，從而可以確定確定DNA片段在凝膠中的位置。此外，還可片段在凝膠中的位置。此外，還可以從電泳后的凝膠中回收特定的以從電泳后的凝膠中回收特定的DNA條帶，條帶，用于以后的克隆操作用于以后的克隆操作根據

12、根據OD260定量：定量：l測定260nm吸光值，OD=1.0代表值如下：la. ds DNA (double stranded DNA) = 50 mg/mllb. ss DNA (single stranded DNA) = 40 mg/mllc. oligonucleotide = 33 mg/mlPCR實驗原理實驗原理l聚合酶鏈式反應聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)，是一種在體外快速擴增特定，是一種在體外快速擴增特定基因或基因或DNA序列的方法，故又稱為基因的體序列的方法，故又稱為基因的體外擴增法。外擴增法。l在待擴增的在待擴增的DNA片斷兩

13、側和與其兩側互補的片斷兩側和與其兩側互補的兩個寡核苷酸引物，經變性、退火和延伸若干兩個寡核苷酸引物，經變性、退火和延伸若干個循環后，個循環后，DNA擴增擴增2n倍。倍。DNA復制（復制（replication）l起始起始 解旋解旋 引物酶結合引物酶結合l延伸延伸l連接連接l終止終止解鏈方向解鏈方向3 3 5 3 5 3 5 3 5 3 3 5 3 ParameterConcentrationTemplatepHdNTPsGelatinPrimersMg2+ oncentrationEnzymeTotal volume10 attomoles(1106 molecules)8.4（10mM Tr

14、is-Hcl）200 M(each one)100 g/ml (optional)0.5 M(each one);(0.11.0M)0.5mM 10mM1 unit25100l儀器藥品儀器藥品l1.5ml離心管；離心管；5ml離心管；研磨棒；離心管；研磨棒；5ml吸頭；吸頭；1000ul吸頭（盒）；吸頭（盒）；200ul吸頭（盒）；吸頭（盒）；10ul吸頭（盒）；吸頭（盒）；5ml移液器；移液器；1000ul移液器；移液器；200ul移液器；移液器；30ul移液器；移液器；2ul移液器；試劑移液器；試劑瓶；量筒瓶；量筒l恒溫水浴鍋；高速離心機；紫外分光光度計；恒溫水浴鍋；高速離心機；紫外分光光

15、度計；電泳儀；電泳槽；酸度計；電子天平；電泳儀；電泳槽；酸度計；電子天平；PCR儀儀lCTAB；NaCl；Tris；HCl；H3BO4；EDTA；NaOH；PVP；瓊脂糖；瓊脂糖；EB；引物；引物；dNTP；Taq酶；酶；EB實驗步驟實驗步驟l試劑配制試劑配制貯存液貯存液最終含量最終含量100mlTris（121.14）1 M12.114g1M Tris HCl, pH 8.0先用蒸餾水溶解加至先用蒸餾水溶解加至90ml左右，再用左右，再用HCl調整調整pH至至8.0，定容至，定容至100ml貯存液貯存液最終含量最終含量100mlEDTA（292.25）0.5 M14.613g0.5M EDT

16、A, pH 8.0先用蒸餾水，再加入先用蒸餾水，再加入NaOH（固體）調（固體）調pH至至8.0，定容至，定容至100ml貯存液貯存液最終含量最終含量100mlNaCl（58.44）5 M29.22g蒸餾水蒸餾水定容至定容至100ml5M NaCl貯存液貯存液最終含量最終含量100mlCTAB2%2g5M NaCl1.4M28ml0.5M EDTA20mM4ml1M Tris HCl pH8.0100mM10mlPVP1%1g蒸餾水蒸餾水定容至定容至100ml2CTAB貯存液貯存液最終含量（最終含量（10ml）3mlCTAB1g0.3g5M NaCl1.4ml0.42ml蒸餾水蒸餾水8.6ml

17、2.58ml10% CTAB貯存液貯存液最終含量最終含量100ml1M Tris HCl, pH 8.010 mM10 ml0.5 M EDTA, pH 8.01 mM2 ml蒸餾水蒸餾水定容至定容至1000 mlT10E1貯存液貯存液最終含量（最終含量（1000ml）100mlTris54g5.4gH3BO427.5g2.75g0.5 M EDTA, pH 8.020ml2 ml蒸餾水蒸餾水定容至定容至100 ml5TBE異丙醇；異丙醇；70%乙醇；乙醇；90%乙醇；乙醇；10mg/ml EB貯存液貯存液最終含量（最終含量（100ml）4.2ml異戊醇異戊醇4ml168ul氯仿氯仿96ml4

18、032ul抽提液抽提液1M Tris HCl；0.5M EDTA；5M NaCl；T10E1以及以及所有需使用的離心管，各種吸頭均需滅菌所有需使用的離心管，各種吸頭均需滅菌操作流程操作流程操作規程操作規程1. 稱取稱取100mg新鮮葉片，置于預冷新鮮葉片，置于預冷1.5ml離心管中，加離心管中，加入液氮，研為細粉。加入入液氮，研為細粉。加入350l新鮮新鮮2CTAB緩沖液，緩沖液，再仔細研磨。（再仔細研磨。（CTAB用于抽提用于抽提DNA）2. 用用350l新鮮新鮮2CTAB緩沖液，沖洗研磨棒，加入緩沖液，沖洗研磨棒，加入2l巰基乙醇，混勻。巰基乙醇，混勻。65水浴水浴45分鐘，每分鐘，每15

19、分分鐘搖動一次。冷卻至室溫，靜置鐘搖動一次。冷卻至室溫，靜置2分鐘。分鐘。3. 每支離心管加入每支離心管加入700l氯仿：異戊醇（氯仿：異戊醇（24：1）（）（672氯仿氯仿:28異戊醇）混合液。輕柔短暫地混和，避免異戊醇）混合液。輕柔短暫地混和，避免DNA斷裂。顛倒幾次。（氯仿、異戊醇、苯酚都用于斷裂。顛倒幾次。（氯仿、異戊醇、苯酚都用于沉淀蛋白質）沉淀蛋白質）4. 在微型離心機中，以在微型離心機中，以14，000rpm離心離心5分鐘。移取上分鐘。移取上層水層，置于新的、標識好的層水層，置于新的、標識好的1.5ml離心管中。注意離心管中。注意避免取到中層物質。將氯仿：異戊醇廢液倒入廢液缸。避

20、免取到中層物質。將氯仿：異戊醇廢液倒入廢液缸。5. 加入加入50l 10CTAB（溶于（溶于0.7M NaCl），輕柔混和，），輕柔混和，并保證混和完全。并保證混和完全。6. 重復第重復第3、第、第4步。步。7. 每支離心管中加入等體積異丙醇（每支離心管中加入等體積異丙醇（400500l）。）。上下顛倒幾次，上下顛倒幾次，4靜置靜置20分鐘（或分鐘（或20，15分分鐘）。（異丙醇用于沉淀鐘）。（異丙醇用于沉淀DNA）8. 14，000rpm離心離心20分鐘。小心倒出上清夜，避免分鐘。小心倒出上清夜，避免DNA顆粒丟失。倒置離心管，空氣干燥（顆粒丟失。倒置離心管，空氣干燥（12分分鐘）。鐘）。9

21、. 用用1ml70乙醇清洗乙醇清洗DNA（3分鐘），分鐘），14,000rpm離離心心30分鐘。小心倒出分鐘。小心倒出70%乙醇，用乙醇，用1ml 90乙醇清洗乙醇清洗DNA，14,000rpm離心離心30分鐘，小心地倒去乙醇。倒分鐘，小心地倒去乙醇。倒置離心管，空氣中干燥，或用真空泵干燥置離心管，空氣中干燥，或用真空泵干燥15分鐘。分鐘。（乙醇用于去除低分子量寡核苷酸和核苷三磷酸）（乙醇用于去除低分子量寡核苷酸和核苷三磷酸）10.以以150l T10E1或蒸餾水溶解或蒸餾水溶解DNA，加入，加入12l不含不含DNA酶的酶的RNA酶酶A（10mg/ml）。）。37反應反應1小小時。時。11.4

22、保存（保存（20長期保存）。長期保存）。冷卻至冷卻至室室 溫溫2l-巰基乙醇巰基乙醇100mg鮮葉鮮葉水水 浴浴1.5ml離心管離心管液液 N2研研 磨磨700l CTAB65，45離離 心心/15加入加入700l氯仿：異戊醇氯仿：異戊醇（672:28）靜置靜置2min渦旋混和，渦旋混和，加入加入50 l 10CTAB溫和溫和短時短時514,000 rpm上清夜上清夜短時短時溫和溫和輕柔混和輕柔混和加入等體積加入等體積異異 丙丙 醇醇循環循環一次一次離心離心靜置靜置304，20沉淀沉淀離心離心14,000 rpm20空氣干燥空氣干燥121 ml 70乙醇乙醇沉淀沉淀314,000 rpm沉淀沉

23、淀加入加入150l T10E11 ml 90乙醇乙醇離心離心14,000 rpm30空氣干燥空氣干燥12l RNAseA37，1h-20保存保存-20，15冷卻至冷卻至室室 溫溫瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳1.取取5TBE緩沖液緩沖液20mL加水至加水至100mL，配制成，配制成1TBE稀釋緩沖液，待用。稀釋緩沖液，待用。 2.膠液的制備：稱取膠液的制備：稱取0.4g瓊脂糖，置于瓊脂糖，置于200mL錐錐形瓶中，加入形瓶中，加入50mL 1TBE稀釋緩沖液，放入稀釋緩沖液，放入微波爐里加熱至瓊脂糖全部熔化，取出搖勻，微波爐里加熱至瓊脂糖全部熔化，取出搖勻，此為此為1瓊脂糖凝膠液。加熱過程中要不

24、時搖動，瓊脂糖凝膠液。加熱過程中要不時搖動，使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進入溶液。使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進入溶液。3. 膠板的制備：將有機玻璃膠槽兩端分別用膠板的制備：將有機玻璃膠槽兩端分別用橡皮膏緊密封住。將封好的膠槽置于水平支持物橡皮膏緊密封住。將封好的膠槽置于水平支持物上，插上樣品梳子，注意觀察梳子齒下緣應與膠上，插上樣品梳子，注意觀察梳子齒下緣應與膠槽底面保持槽底面保持1mm左右的間隙。左右的間隙。 向冷卻至向冷卻至50-60的瓊脂糖膠液中加入溴化乙錠的瓊脂糖膠液中加入溴化乙錠(EB)溶液使溶液使其終濃度為其終濃度為0.5g /mL。用移液器吸取少量融化。用移液器吸取少量融化的瓊脂糖凝膠

25、封橡皮膏內側，待瓊脂糖溶液凝固的瓊脂糖凝膠封橡皮膏內側，待瓊脂糖溶液凝固后將剩余的瓊脂糖小心地倒入膠槽內，使膠液形后將剩余的瓊脂糖小心地倒入膠槽內，使膠液形成均勻的膠層。待膠完全凝固后撥出梳子，注意成均勻的膠層。待膠完全凝固后撥出梳子，注意不要損傷梳底部的凝膠，然后向槽內加入不要損傷梳底部的凝膠，然后向槽內加入1TBE稀釋緩沖液至液面恰好沒過膠板上表面。稀釋緩沖液至液面恰好沒過膠板上表面。 4. 加樣：取加樣：取10L DNA樣品與樣品與2L 6上樣液混勻，用微量移液槍小心加上樣液混勻，用微量移液槍小心加入樣品槽中。若入樣品槽中。若DNA含量偏低，則可依上述比例增加上樣量，但總體含量偏低，則可

26、依上述比例增加上樣量，但總體積不可超過樣品槽容量。每加完一個樣品要更換積不可超過樣品槽容量。每加完一個樣品要更換tip頭，以防止互相污頭，以防止互相污染，注意上樣時要小心操作，避免損壞凝膠或將樣品槽底部凝膠刺穿。染，注意上樣時要小心操作，避免損壞凝膠或將樣品槽底部凝膠刺穿。 5. 電泳：加完樣后電泳：加完樣后,合上電泳槽蓋，立即接通電源?？刂齐妷罕３衷诤仙想娪静凵w，立即接通電源?？刂齐妷罕３衷?0-80V，電流在，電流在40mA以上。當溴酚藍條帶移動到距凝膠前沿約以上。當溴酚藍條帶移動到距凝膠前沿約2cm時，時，停止電泳。停止電泳。6. 染色：未加染色：未加EB的膠板在電泳完畢后移入的膠板在電泳完畢后移入0.5g/mL的的EB溶液中，室溫溶液中，室溫下染色下染色20-25min。 7. 觀察和拍照：在波長為觀察和拍照：在波長為