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1、5/5/20221第三章第三章 核核 酸酸 三三 生物分子之二生物分子之二六、核酸堿基順序的測定2六 、核酸堿基順序的測定1、DNA堿基順序測定方法堿基順序測定方法根本步驟：A、DNA片段的制備片段的制備利用限制性內切酶技術選擇性地在某些特定位點將DNA鏈切斷，產生可以用于測定的較小片段。B、DNA片段的堿基順序測定片段的堿基順序測定Maxam-Gilbert法化學降解法Sanger法末端終止法獲得DNA小片段的方法31Maxam-Gilbert化學降解法原理：選擇性地切斷某種特定核苷酸所構成磷酸二酯鍵，原理：選擇性地切斷某種特定核苷酸所構成磷酸二酯鍵，得到不同鏈長的得到不同鏈長的DNA小片段

2、小片段, 然后進展電泳分析和堿基順然后進展電泳分析和堿基順序推測。序推測。DNA小片段制備單鏈DNA4留意：1選擇性水解后，水解位點上的含氮堿基都消逝了；2水解反響都是不完全的，得到的是不同長度的DNA片段混合物567硫酸二甲酯G： *ACTTCG*ACTTCGACAG甲酸A： *A*ACTTCG *ACTTCGA *ACTTCGACA*ACTTCGACAG肼/NaClC： *AC *ACTTC*ACTTCGA C*ACTTCGACAG 肼T： *AC *ACT *ACT T *ACTTC*ACTTCGAC*ACTTCGACAG32P *ACTTCGACAG待測樣品需分為四份8將這個DNA單鏈

3、片段的5端進展標志用4種特異性化學試劑進展不同步斷裂電泳分別各產物放射自顯影直讀DNA序列總結化學降解法總結化學降解法端位堿基不能直接讀出，需求特殊端基分析方法確定，例如控制合成互補鏈的方法！92Sanger法末端終止法法末端終止法英國 Sanger1955 確定牛胰島素構造， 1958 獲諾貝爾化學獎1975 設計出DNA測序法， 1980 獲諾貝爾化學獎合成一段與待測DNA序列互補的DNA片段群10dNTP: dATP, dGTP, dCTP,dTTP1112DNA互補鏈的合成引物13DNA互補鏈的合成14dNTP作放射性標志153DNA序列分析儀：序列分析儀：四色熒光基團標志的四色熒光基團標志的dNTP以熒光標志物替代同位素標志162、RNA堿基順序測定方法在DNA測序方法根底上開展的R

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