1、Contents of chapter 31、酶的提取與分離純化技術(shù)路線3、細(xì)胞破碎4、酶的提取5、酶的分離方法GoGoGoGo6、酶的濃縮、干燥與結(jié)晶Go7、純化方案的設(shè)計(jì)與評(píng)價(jià)Go2、發(fā)酵液的預(yù)處理Go酶 工 程Enzyme engineering緒論緒論第一章第一章 酶的基礎(chǔ)知識(shí)酶的基礎(chǔ)知識(shí)第二章第二章 酶的發(fā)酵生產(chǎn)酶的發(fā)酵生產(chǎn)第三章酶的分離純化第三章酶的分離純化第四章第四章 酶的分子修飾酶的分子修飾第五章第五章 酶和細(xì)胞的固定化酶和細(xì)胞的固定化第六章第六章 酶的非水相催化酶的非水相催化第七章第七章 酶的應(yīng)用酶的應(yīng)用第一篇第一篇 酶理論酶理論第二篇第二篇 酶工程酶工程Chapter 4

2、Modification of Enzyme Moleculen酶的分子修飾酶的分子修飾Contents of chapter 4酶的分子修飾酶的分子修飾1、什么是酶分子修飾2、酶分子修飾的基本要求和條件3、酶分子的修飾方法4、酶修飾后的性質(zhì)變化GoGoGoGo5、化學(xué)人工酶Go1.酶分子的化學(xué)修飾酶分子的化學(xué)修飾n穩(wěn)定性不夠，不能適應(yīng)大量生產(chǎn)條件的穩(wěn)定性不夠，不能適應(yīng)大量生產(chǎn)條件的需要。需要。n作用的最適條件不符。作用的最適條件不符。n酶的主要?jiǎng)恿W(xué)性質(zhì)的不適應(yīng)。酶的主要?jiǎng)恿W(xué)性質(zhì)的不適應(yīng)。n臨床應(yīng)用的特殊要求。臨床應(yīng)用的特殊要求。酶的在應(yīng)用中可能出現(xiàn)的問(wèn)題酶的在應(yīng)用中可能出現(xiàn)的問(wèn)題:酶分子

3、改造的方向酶分子改造的方向n核酸水平核酸水平：利用基因操作技術(shù)對(duì)利用基因操作技術(shù)對(duì)DNA 或或mRNA 進(jìn)行改進(jìn)行改造或修飾，以期獲得化學(xué)結(jié)構(gòu)（一級(jí)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)）造或修飾，以期獲得化學(xué)結(jié)構(gòu)（一級(jí)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)）更為合理的酶。更為合理的酶。生物酶工程生物酶工程內(nèi)容之一內(nèi)容之一n蛋白質(zhì)水平：人們用化學(xué)法或酶法對(duì)酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)蛋白質(zhì)水平：人們用化學(xué)法或酶法對(duì)酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，這包括酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)中氨基酸的置換，包括行改造，這包括酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)中氨基酸的置換，包括用酶將肽鏈切斷或部分切除，使酶的空間構(gòu)象變得更用酶將肽鏈切斷或部分切除，使酶的空間構(gòu)象變得更為穩(wěn)定。另一方面是對(duì)酶分子中氨基酸殘基的修飾。

4、為穩(wěn)定。另一方面是對(duì)酶分子中氨基酸殘基的修飾。即即酶的化學(xué)修飾酶的化學(xué)修飾。生物酶工程 生物酶工程指酶學(xué)與以基因重組技術(shù)為主的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物，主要包括：（1）用基因工程技術(shù)大量生產(chǎn)酶（克隆酶）； 策略： 先在特定的酶的結(jié)構(gòu)基因前加上高效的啟動(dòng)基因序列和必要的調(diào)控序列 將此片斷克隆到一定的載體 將帶有特定酶基因的雜交表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到適當(dāng)?shù)氖荏w（細(xì)菌或酵母）中，通過(guò)發(fā)酵方法大量生產(chǎn)所需要的酶（2）對(duì)酶基因進(jìn)行修飾，產(chǎn)生遺傳修飾酶（突變酶);通過(guò)定點(diǎn)誘變技術(shù)，改造編碼酶分子中的DNA順序，經(jīng)過(guò)寄主細(xì)胞的表達(dá)，能產(chǎn)生被改造的新酶。這種遺傳修飾，可改變酶的催化活性、底物專(zhuān)一性、最適PH;改

5、變含金屬酶的氧化還原能力；改變酶的別構(gòu)調(diào)節(jié)功能；改變酶對(duì)輔酶的要求；提高酶的穩(wěn)定性。（3）設(shè)計(jì)新的酶基因，合成自然界即不曾有的新酶。酶化學(xué)修飾的應(yīng)用領(lǐng)域酶化學(xué)修飾的應(yīng)用領(lǐng)域=在在基礎(chǔ)酶學(xué)研究基礎(chǔ)酶學(xué)研究上上4探測(cè)探測(cè)酶活性必需氨基酸酶活性必需氨基酸的性質(zhì)和數(shù)目的性質(zhì)和數(shù)目4酶酶蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定的測(cè)定4酶的作用機(jī)理與催化反應(yīng)歷程酶的作用機(jī)理與催化反應(yīng)歷程4酶的固定化技術(shù)酶的固定化技術(shù)研究活性中心的方法（1）酶的專(zhuān)一性研究（2）酶分子側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾法（3）X射線晶體衍射法（4）定點(diǎn)誘變法一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定步驟一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定步驟要點(diǎn)：要點(diǎn)：a a. .測(cè)定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目測(cè)定蛋白質(zhì)

6、分子中多肽鏈的數(shù)目b.b.多肽鏈的拆分多肽鏈的拆分（包括二硫鍵的斷裂）（包括二硫鍵的斷裂） c.c.多肽鏈斷裂成多個(gè)肽段多肽鏈斷裂成多個(gè)肽段 d.d.確定所得每一種小肽段的氨基酸順序確定所得每一種小肽段的氨基酸順序 e.e.鑒定多肽鏈的鑒定多肽鏈的N-N-末端和末端和C-C-末端殘基末端殘基 f.f.利用兩套肽段上的重疊部位，進(jìn)行核對(duì)拼接，排出整利用兩套肽段上的重疊部位，進(jìn)行核對(duì)拼接，排出整個(gè)肽鏈的氨基酸順序。個(gè)肽鏈的氨基酸順序。 g.g.確定確定二硫鍵的位置二硫鍵的位置基本戰(zhàn)略基本戰(zhàn)略：片段重疊法氨基酸順序直測(cè)法：片段重疊法氨基酸順序直測(cè)法多肽鏈的拆分多肽鏈的拆分（ 方法一方法一S SS S

7、S SS SS SS SHS-CHHS-CH2 2-CH-CH2 2-OH-OHSHSHSHSHSHSHSHSHSHSHSHSHSCHSCH2 2C00HC00H SCHSCH2 2C00HC00HSCHSCH2 2C00HC00HSCHSCH2 2C00HC00HSCHSCH2 2C00HC00HSCHSCH2 2C00HC00HICHICH2 2COOHCOOH多肽鏈的拆分多肽鏈的拆分（ 方法二：方法二： 8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下（解離多肽鏈之間的非共價(jià)力）；應(yīng)用過(guò)甲酸氧化法過(guò)甲酸氧化法拆分多肽鏈間的二硫鍵。s ss sHCOOOHHCOOOHSOSO3 3H HSOSO

8、3 3H H+ +- -+ +- -第二向第二向第一向第一向BrownBrown和和HartlayHartlay對(duì)角線電泳圖解對(duì)角線電泳圖解pH6.5pH6.5圖中紅色斑點(diǎn)是圖中紅色斑點(diǎn)是連二硫鍵的肽段連二硫鍵的肽段將所得的肽段利用將所得的肽段利用BrownBrown及及HartlayHartlay的的對(duì)角線電泳技術(shù)對(duì)角線電泳技術(shù)進(jìn)行分離進(jìn)行分離S SS SHCOOOHHCOOOHSOSO3 3H HSOSO3 3H H+ +- -+ +- -第二向第二向第一向第一向a ab bBrownBrown和和HartlayHartlay對(duì)角線電泳圖解對(duì)角線電泳圖解pH6.5pH6.5圖中圖中a a、

9、b b兩個(gè)斑點(diǎn)是兩個(gè)斑點(diǎn)是由一個(gè)二硫鍵斷裂由一個(gè)二硫鍵斷裂產(chǎn)生的肽段產(chǎn)生的肽段=在疾病治療上在疾病治療上4克服酶在體內(nèi)的不穩(wěn)定性克服酶在體內(nèi)的不穩(wěn)定性 4消除或降低酶的抗原性消除或降低酶的抗原性4有助于酶分子到達(dá)并集中于病灶細(xì)胞有助于酶分子到達(dá)并集中于病灶細(xì)胞=在工業(yè)上的應(yīng)用在工業(yè)上的應(yīng)用4酶穩(wěn)定性提高，使生產(chǎn)成本降低酶穩(wěn)定性提高，使生產(chǎn)成本降低4反應(yīng)條件的改善和酶壽命的延長(zhǎng)導(dǎo)致生反應(yīng)條件的改善和酶壽命的延長(zhǎng)導(dǎo)致生產(chǎn)工藝的技術(shù)革新和改進(jìn)。產(chǎn)工藝的技術(shù)革新和改進(jìn)。酶化學(xué)修飾的應(yīng)用領(lǐng)域酶化學(xué)修飾的應(yīng)用領(lǐng)域2. 酶化學(xué)修飾的基本要求和條件酶化學(xué)修飾的基本要求和條件（1）了解被修飾酶的性質(zhì)）了解被修飾

10、酶的性質(zhì)（2）選擇修飾反應(yīng)條件）選擇修飾反應(yīng)條件（1 1）了解了解被修飾酶的性質(zhì)被修飾酶的性質(zhì)酶的穩(wěn)定性：酶的穩(wěn)定性：包括熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性，作包括熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性，作用溫度以及用溫度以及pHpH，酶蛋白解離時(shí)的電化學(xué)性質(zhì)，抑，酶蛋白解離時(shí)的電化學(xué)性質(zhì)，抑制劑的性質(zhì)等。制劑的性質(zhì)等。酶活性中心的狀況：酶活性中心的狀況：包括酶分子活性中心的組包括酶分子活性中心的組成，如參與活性中心的氨基酸殘基、輔因子等。成，如參與活性中心的氨基酸殘基、輔因子等。酶分子的形狀、大小以及寡聚酶的亞基組成。酶分子的形狀、大小以及寡聚酶的亞基組成。2. 酶化學(xué)修飾的基本要求和條件酶化學(xué)修飾的基本要求和條件（1）了

11、解被修飾酶的性質(zhì)）了解被修飾酶的性質(zhì)（2）選擇修飾反應(yīng)條件）選擇修飾反應(yīng)條件（2）選擇修飾反應(yīng)條件：）選擇修飾反應(yīng)條件： 修飾反應(yīng)應(yīng)盡量在酶穩(wěn)定條件下進(jìn)行，并盡修飾反應(yīng)應(yīng)盡量在酶穩(wěn)定條件下進(jìn)行，并盡 量不破壞酶活性必需基團(tuán)，修飾率高，活力量不破壞酶活性必需基團(tuán)，修飾率高，活力回收要高。回收要高。（2）選擇修飾反應(yīng)條件）選擇修飾反應(yīng)條件pH與離子強(qiáng)度：與離子強(qiáng)度：pH決定了酶分子中反應(yīng)基團(tuán)的解離狀決定了酶分子中反應(yīng)基團(tuán)的解離狀態(tài)，態(tài)，酶的解離狀態(tài)不同酶的解離狀態(tài)不同，其，其反應(yīng)性能也不同反應(yīng)性能也不同；另一方面，；另一方面，有些修飾試劑在有些修飾試劑在不同不同pH下下，與同一種基團(tuán)反應(yīng)可以，與同

12、一種基團(tuán)反應(yīng)可以形成形成不同的產(chǎn)物不同的產(chǎn)物。離子強(qiáng)度對(duì)修飾反應(yīng)也有重要影響。離子強(qiáng)度對(duì)修飾反應(yīng)也有重要影響。修飾反應(yīng)的溫度與時(shí)間：修飾反應(yīng)的溫度與時(shí)間：嚴(yán)格控制反應(yīng)溫度和時(shí)間可嚴(yán)格控制反應(yīng)溫度和時(shí)間可以以減少或消除減少或消除一些非專(zhuān)一性的修飾反應(yīng)。一些非專(zhuān)一性的修飾反應(yīng)。反應(yīng)體系中酶與修飾劑的比例：反應(yīng)體系中酶與修飾劑的比例：酶與修飾試劑的比酶與修飾試劑的比例可以控制酶分子的修飾程度例可以控制酶分子的修飾程度。（1）酶的表面修飾）酶的表面修飾（2）酶分子的內(nèi)部修飾）酶分子的內(nèi)部修飾（3）與輔因子相關(guān)的修飾）與輔因子相關(guān)的修飾（4）金屬酶的金屬取代）金屬酶的金屬取代3. 酶分子的化學(xué)修飾方法酶

13、分子的化學(xué)修飾方法反相膠團(tuán)微囊化反相膠團(tuán)微囊化脂質(zhì)體包埋脂質(zhì)體包埋分子間交聯(lián)分子間交聯(lián)分子內(nèi)交聯(lián)分子內(nèi)交聯(lián)酶的大分子修飾作用酶的大分子修飾作用酶的小分子修飾作用酶的小分子修飾作用化學(xué)固定化化學(xué)固定化（1）酶的表面修飾）酶的表面修飾（1）酶的表面修飾）酶的表面修飾 化學(xué)固定化化學(xué)固定化：一般是直接通過(guò)酶表面的氨基一般是直接通過(guò)酶表面的氨基酸殘基將酶分子共價(jià)連接到酸殘基將酶分子共價(jià)連接到惰性載體惰性載體上；由于載體上；由于載體的引入，使酶所處的微環(huán)境發(fā)生改變，進(jìn)而改變了的引入，使酶所處的微環(huán)境發(fā)生改變，進(jìn)而改變了酶的性質(zhì)，特別是動(dòng)力學(xué)性質(zhì)發(fā)生了改變。酶的性質(zhì)，特別是動(dòng)力學(xué)性質(zhì)發(fā)生了改變。酶的小分子

14、修飾作用：酶的小分子修飾作用：主要是利用一些小主要是利用一些小分子修飾試劑，通過(guò)共價(jià)結(jié)合來(lái)修飾酶的一些分子修飾試劑，通過(guò)共價(jià)結(jié)合來(lái)修飾酶的一些基團(tuán)（如基團(tuán)（如-COO-、-NH3+、-SH、-OH、咪唑基、咪唑基等），提高酶的穩(wěn)定性。常用的小分子修飾試等），提高酶的穩(wěn)定性。常用的小分子修飾試劑有劑有乙基、糖基和甲基乙基、糖基和甲基等。等。酶的小分子修飾作用酶的小分子修飾作用 對(duì)巰基的化學(xué)修飾對(duì)巰基的化學(xué)修飾： 常用的修飾試劑有常用的修飾試劑有烷基化劑、酰化基、馬來(lái)酰亞胺烷基化劑、酰化基、馬來(lái)酰亞胺等。等。 氨基的化學(xué)修飾氨基的化學(xué)修飾： 常用的修飾試劑有乙酸酐、常用的修飾試劑有乙酸酐、2，4，

15、6-三硝基苯磺酸、三硝基苯磺酸、2，4-二二硝基氟苯、烷基化試劑、丹磺酰氯硝基氟苯、烷基化試劑、丹磺酰氯(DNS)和苯異硫氰酸酯和苯異硫氰酸酯（ PITC)等。等。 羧基的化學(xué)修飾羧基的化學(xué)修飾： 水溶性羰二亞胺或氨化反應(yīng)、硼氟化三甲鋅鹽反應(yīng)、甲醇水溶性羰二亞胺或氨化反應(yīng)、硼氟化三甲鋅鹽反應(yīng)、甲醇-鹽鹽酸酯化反應(yīng)等。酸酯化反應(yīng)等。 咪唑基的修飾反應(yīng)咪唑基的修飾反應(yīng)： 焦碳酸二乙酯反應(yīng)、碘代反應(yīng)、碘化反應(yīng)等。焦碳酸二乙酯反應(yīng)、碘代反應(yīng)、碘化反應(yīng)等。 吲哚基的化學(xué)修飾：吲哚基的化學(xué)修飾： 2-羥基羥基-5-硝基芐溴、光敏試劑、硝基芐溴、光敏試劑、4-硝基苯硫氯等。硝基苯硫氯等。 甲硫氨酸側(cè)鏈基團(tuán)的

16、化學(xué)修飾：甲硫氨酸側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾： H2O2、光敏試劑、碘代乙酰胺等、光敏試劑、碘代乙酰胺等 二硫鍵的化學(xué)修飾：二硫鍵的化學(xué)修飾： 2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇、過(guò)甲酸等巰基乙醇、二硫蘇糖醇、過(guò)甲酸等。 酚基的化學(xué)修飾：酚基的化學(xué)修飾： N-乙酰咪唑、碘化反應(yīng)、四硝基甲烷、偶氮化試乙酰咪唑、碘化反應(yīng)、四硝基甲烷、偶氮化試劑、二異丙基氟磷酸劑、二異丙基氟磷酸。 胍基的化學(xué)修飾胍基的化學(xué)修飾： 丁二酮、丁二酮、1，2-環(huán)己二酮、苯乙二醛等。環(huán)己二酮、苯乙二醛等。巰基的化學(xué)修飾 n巰基具有很強(qiáng)的親核性，采用巰基化學(xué)修飾 劑與酶蛋白側(cè)鏈上的巰基結(jié)合，使巰基發(fā)生改變，從而改變酶的空間構(gòu)象、特性和功能。n

17、常用：烷基化劑、酰化基、馬來(lái)酰亞胺巰基的化學(xué)修飾 E E（1）DTNB：5，5-二硫代雙（二硫代雙（2-硝基苯甲酸）硝基苯甲酸）氨基的化學(xué)修飾 三硝基苯磺酸三硝基苯磺酸羧基的化學(xué)修飾 Zn+咪唑基的化學(xué)修飾 胍基的化學(xué)修飾 反相膠團(tuán)微囊化反相膠團(tuán)微囊化脂質(zhì)體包埋脂質(zhì)體包埋分子間交聯(lián)分子間交聯(lián)分子內(nèi)交聯(lián)分子內(nèi)交聯(lián)酶的大分子修飾作用酶的大分子修飾作用酶的小分子修飾作用酶的小分子修飾作用化學(xué)固定化化學(xué)固定化（1）酶的表面修飾）酶的表面修飾糖類(lèi)的修飾反應(yīng)：糖類(lèi)的修飾反應(yīng)：4右旋糖苷及右旋糖苷硫酸酯右旋糖苷及右旋糖苷硫酸酯修飾反應(yīng)：右旋糖苷是由修飾反應(yīng)：右旋糖苷是由 -葡葡萄糖通過(guò)萄糖通過(guò) -1，6-糖

18、苷鍵連接而成的高分子多糖，具有良好糖苷鍵連接而成的高分子多糖，具有良好的的生物相容性和水溶性生物相容性和水溶性，其雙羥基經(jīng)過(guò)活化后可與酶分子，其雙羥基經(jīng)過(guò)活化后可與酶分子上的游離氨基相結(jié)合。主要的修飾方法有：上的游離氨基相結(jié)合。主要的修飾方法有：溴化氰法溴化氰法、高高碘酸氧化法碘酸氧化法。4糖肽糖肽（ Glycopeptide)的修飾反應(yīng)的修飾反應(yīng): 糖肽是由人纖維蛋白或糖肽是由人纖維蛋白或 - 球蛋白經(jīng)蛋白酶水解后得到的產(chǎn)物，其分子上具有游離氨球蛋白經(jīng)蛋白酶水解后得到的產(chǎn)物，其分子上具有游離氨基，活化后可與酶分子上的氨基反應(yīng)。主要方法有：基，活化后可與酶分子上的氨基反應(yīng)。主要方法有：2，3-

19、 異氰酸甲苯活化法異氰酸甲苯活化法、戊二醛法戊二醛法。4聚乳糖聚乳糖修飾反應(yīng)：聚乳糖在一定溫度下，通過(guò)適當(dāng)?shù)倪€原修飾反應(yīng)：聚乳糖在一定溫度下，通過(guò)適當(dāng)?shù)倪€原劑可與酶分子上氨基反應(yīng)。劑可與酶分子上氨基反應(yīng)。酶的大分子修飾作用酶的大分子修飾作用合成大分子多聚物修飾酶合成大分子多聚物修飾酶4聚聚N - 乙烯吡硌烷酮乙烯吡硌烷酮 (PVP):用水溶性的分子量為用水溶性的分子量為10,000的的PVP,經(jīng)過(guò)開(kāi)環(huán)水解經(jīng)過(guò)開(kāi)環(huán)水解,活化后活化后,與酶結(jié)合。與酶結(jié)合。4聚乙烯醇聚乙烯醇(PVA):PVA與對(duì)硝基苯氧酰氯反應(yīng)，其硝基再用連二與對(duì)硝基苯氧酰氯反應(yīng)，其硝基再用連二亞硫酸鈉還原為氨基，與酶分子中的羧基

20、共價(jià)連接。亞硫酸鈉還原為氨基，與酶分子中的羧基共價(jià)連接。4聚丙烯醇聚丙烯醇(PAA):用分子量為用分子量為250，000的的PAA，經(jīng)過(guò)，經(jīng)過(guò)N - 羥基琥羥基琥珀酰亞胺活化后與酶的氨基反應(yīng)。珀酰亞胺活化后與酶的氨基反應(yīng)。4聚順丁烯二酸酐聚順丁烯二酸酐:用分子量為用分子量為98，000的聚順丁烯二酸酐，可以的聚順丁烯二酸酐，可以直接與酶分子的氨基發(fā)生反應(yīng)。直接與酶分子的氨基發(fā)生反應(yīng)。4聚氨基酸聚氨基酸：用分子量為：用分子量為5，700的聚賴(lài)氨酸做修飾劑時(shí)，其氨的聚賴(lài)氨酸做修飾劑時(shí)，其氨基與酶分子上的羧基通過(guò)羰二亞胺產(chǎn)生交聯(lián)。用丙氨酸的二基與酶分子上的羧基通過(guò)羰二亞胺產(chǎn)生交聯(lián)。用丙氨酸的二肽或三

21、肽做修飾劑時(shí)，其酸酐可以與酶發(fā)生反應(yīng)。肽或三肽做修飾劑時(shí)，其酸酐可以與酶發(fā)生反應(yīng)。天然大分子對(duì)酶的修飾反應(yīng)天然大分子對(duì)酶的修飾反應(yīng)4肝素肝素：肝素由氨基葡萄糖和兩種糖醛酸組成，平均分子量：肝素由氨基葡萄糖和兩種糖醛酸組成，平均分子量約為約為20，000，是一種含硫酸酯的黏多糖；經(jīng)過(guò)肝素修飾，是一種含硫酸酯的黏多糖；經(jīng)過(guò)肝素修飾的酶具有良好的穩(wěn)定性，不僅可以提高酶的療效，而且具的酶具有良好的穩(wěn)定性，不僅可以提高酶的療效，而且具有抗血凝、抗血栓、降血脂等活性。目前常用有抗血凝、抗血栓、降血脂等活性。目前常用羰二亞胺法羰二亞胺法、三氯均嗪法三氯均嗪法和溴化氰法活化肝素，對(duì)酶分子進(jìn)行修飾。和溴化氰法活

22、化肝素，對(duì)酶分子進(jìn)行修飾。4人血清蛋白人血清蛋白：常用：常用戊二醛法戊二醛法、羰二亞胺法羰二亞胺法和活性酯法對(duì)人和活性酯法對(duì)人血清蛋白進(jìn)行活化，然后對(duì)酶分子進(jìn)行修飾。血清蛋白進(jìn)行活化，然后對(duì)酶分子進(jìn)行修飾。活化酯法白蛋白修飾酶活化酯法白蛋白修飾酶是在多肽合成的原理上是在多肽合成的原理上發(fā)展而來(lái)的。發(fā)展而來(lái)的。主要過(guò)程：主要過(guò)程：白蛋白琥珀白蛋白琥珀化化、活性酯形成活性酯形成和和修飾修飾酶酶。主要特點(diǎn)是反應(yīng)條件溫主要特點(diǎn)是反應(yīng)條件溫和，從而避免了活潑的和，從而避免了活潑的雙功能團(tuán)交聯(lián)劑與酶接雙功能團(tuán)交聯(lián)劑與酶接觸可能引起酶失活，減觸可能引起酶失活，減少了修飾反應(yīng)中副反應(yīng)少了修飾反應(yīng)中副反應(yīng)的發(fā)生

23、，提高了修飾酶的發(fā)生，提高了修飾酶的活性回收率。的活性回收率。大分子聚乙二醇（大分子聚乙二醇（PEG）修飾：）修飾：利用一些可溶性大分子，通過(guò)共價(jià)鍵連接于酶分子的表面，利用一些可溶性大分子，通過(guò)共價(jià)鍵連接于酶分子的表面，形成一層覆蓋層，形成的可溶性酶具有許多有用的性質(zhì)。形成一層覆蓋層，形成的可溶性酶具有許多有用的性質(zhì)。聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）是線性大分子，具有良好的生物相容性和是線性大分子，具有良好的生物相容性和水溶性，在體內(nèi)無(wú)毒性、無(wú)殘留、無(wú)免疫原性，并可消除酶水溶性，在體內(nèi)無(wú)毒性、無(wú)殘留、無(wú)免疫原性，并可消除酶分子的抗原性，被廣泛用于酶的修飾。聚乙二醇末端活化后分子的抗原性，被廣泛用于

24、酶的修飾。聚乙二醇末端活化后可以與酶產(chǎn)生交聯(lián)，使酶分子被覆蓋上一層疏松的親水外殼，可以與酶產(chǎn)生交聯(lián)，使酶分子被覆蓋上一層疏松的親水外殼，導(dǎo)致動(dòng)力學(xué)發(fā)生改變，從而產(chǎn)生許多有用的性質(zhì)，如可以在導(dǎo)致動(dòng)力學(xué)發(fā)生改變，從而產(chǎn)生許多有用的性質(zhì)，如可以在廣泛的廣泛的pH范圍內(nèi)溶解范圍內(nèi)溶解等。等。例如用例如用聚乙二醇聚乙二醇共價(jià)修飾超氧化物歧化酶（共價(jià)修飾超氧化物歧化酶（SOD），不僅可），不僅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延長(zhǎng)了半衰期，從而提高了藥效。長(zhǎng)了半衰期，從而提高了藥效。反相膠團(tuán)微囊化反相膠團(tuán)微囊化脂質(zhì)體包埋脂質(zhì)體包埋分子間

25、交聯(lián)分子間交聯(lián)分子內(nèi)交聯(lián)分子內(nèi)交聯(lián)酶的大分子修飾作用酶的大分子修飾作用酶的小分子修飾作用酶的小分子修飾作用化學(xué)固定化化學(xué)固定化（1）酶的表面修飾）酶的表面修飾分子內(nèi)交聯(lián)：分子內(nèi)交聯(lián)： 增加酶分子表面的交聯(lián)鍵數(shù)目是提高酶穩(wěn)定性增加酶分子表面的交聯(lián)鍵數(shù)目是提高酶穩(wěn)定性的有效方法之一，例如的有效方法之一，例如胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶上的羧基上的羧基經(jīng)過(guò)經(jīng)過(guò)羰二亞胺羰二亞胺活化后，然后與酶分子上的氨基活化后，然后與酶分子上的氨基發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，使酶的穩(wěn)定性得到改善。發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，使酶的穩(wěn)定性得到改善。分子間交聯(lián)：分子間交聯(lián)： 利用一些雙功能或多功能試劑將不同的酶交聯(lián)在利用一些雙功能或多功能試劑將不同的酶

26、交聯(lián)在一起形成雜化酶。例如用一起形成雜化酶。例如用戊二醛戊二醛把胰蛋白酶和胰把胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶交聯(lián)在一起，可以降低胰凝乳蛋白酶凝乳蛋白酶交聯(lián)在一起，可以降低胰凝乳蛋白酶的自溶性。的自溶性。脂質(zhì)體包埋：脂質(zhì)體包埋：一些醫(yī)藥用酶，如一些醫(yī)藥用酶，如 SODSOD、溶菌、溶菌酶酶等，由于分子量較大，不易進(jìn)入人體細(xì)胞內(nèi)，等，由于分子量較大，不易進(jìn)入人體細(xì)胞內(nèi)，而且在體內(nèi)半衰期短，產(chǎn)生免疫原性反應(yīng)；用而且在體內(nèi)半衰期短，產(chǎn)生免疫原性反應(yīng)；用脂質(zhì)體包埋法紀(jì)可解決這些問(wèn)題。脂質(zhì)體包埋法紀(jì)可解決這些問(wèn)題。 脂質(zhì)體是天然脂類(lèi)或類(lèi)固醇組成的微球體，脂質(zhì)體是天然脂類(lèi)或類(lèi)固醇組成的微球體，酶分子包埋在其內(nèi)部，可

27、以通過(guò)與細(xì)胞的膜融酶分子包埋在其內(nèi)部，可以通過(guò)與細(xì)胞的膜融合或內(nèi)吞作用而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。合或內(nèi)吞作用而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。 加加H2O 疏水尾部疏水尾部 親水頭部親水頭部 加酶液加酶液 S PEEE 圖：反相膠團(tuán)的結(jié)構(gòu)和酶的分布圖：反相膠團(tuán)的結(jié)構(gòu)和酶的分布反相膠團(tuán)微囊化：反相膠團(tuán)微囊化：這是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的酶在這是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的酶在有機(jī)相中進(jìn)行催化的技術(shù)，反相膠團(tuán)中酶的穩(wěn)定性有機(jī)相中進(jìn)行催化的技術(shù)，反相膠團(tuán)中酶的穩(wěn)定性大大提高；一些表面活性劑溶解在非極性有機(jī)溶劑大大提高；一些表面活性劑溶解在非極性有機(jī)溶劑中時(shí)可自發(fā)地形成近似球狀的反相膠團(tuán)，反相膠團(tuán)中時(shí)可自發(fā)地形成近似球狀的反相膠團(tuán)，反相膠團(tuán)是表面活性劑

28、的疏水尾部朝外而極性頭部朝內(nèi)的微是表面活性劑的疏水尾部朝外而極性頭部朝內(nèi)的微膠團(tuán)，其內(nèi)部可容納一定量的水，酶溶解在其中避膠團(tuán)，其內(nèi)部可容納一定量的水，酶溶解在其中避免變性（見(jiàn)圖）。免變性（見(jiàn)圖）。反相膠團(tuán)微囊化反相膠團(tuán)微囊化脂質(zhì)體包埋脂質(zhì)體包埋分子間交聯(lián)分子間交聯(lián)分子內(nèi)交聯(lián)分子內(nèi)交聯(lián)酶的大分子修飾作用酶的大分子修飾作用酶的小分子修飾作用酶的小分子修飾作用化學(xué)固定化化學(xué)固定化（1）酶的表面修飾）酶的表面修飾（1）酶的表面修飾）酶的表面修飾（2）酶分子的內(nèi)部修飾）酶分子的內(nèi)部修飾（3）與輔因子相關(guān)的修飾）與輔因子相關(guān)的修飾（4）金屬酶的金屬取代）金屬酶的金屬取代3. 酶分子的化學(xué)修飾方法酶分子的化

29、學(xué)修飾方法（2） 酶分子的內(nèi)部修飾酶分子的內(nèi)部修飾非催化活性基團(tuán)的修飾：非催化活性基團(tuán)的修飾： 通過(guò)對(duì)通過(guò)對(duì)非催化殘基的修飾非催化殘基的修飾可以改變酶的可以改變酶的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，改變酶對(duì)特殊底物的親和改變酶對(duì)特殊底物的親和力力；通常可被修飾的氨基酸殘基既可以；通常可被修飾的氨基酸殘基既可以是親核的，也可以是親電子的，還可以是親核的，也可以是親電子的，還可以是可氧化殘基。是可氧化殘基。催化活性基團(tuán)的修飾：催化活性基團(tuán)的修飾：通過(guò)選擇性修飾催化活性氨通過(guò)選擇性修飾催化活性氨基酸的側(cè)鏈來(lái)實(shí)現(xiàn)氨基酸殘基的取代，使一種氨基基酸的側(cè)鏈來(lái)實(shí)現(xiàn)氨基酸殘基的取代，使一種氨基酸側(cè)鏈轉(zhuǎn)化為另一種氨基酸側(cè)鏈

30、，這種方法又稱(chēng)為酸側(cè)鏈轉(zhuǎn)化為另一種氨基酸側(cè)鏈，這種方法又稱(chēng)為化學(xué)突變法化學(xué)突變法。酶蛋白主鏈的修飾酶蛋白主鏈的修飾( (肽鏈有限水解修飾肽鏈有限水解修飾) ) ：主要是靠主要是靠酶法進(jìn)行修飾，用蛋白酶對(duì)主鏈進(jìn)行部分水解，可酶法進(jìn)行修飾，用蛋白酶對(duì)主鏈進(jìn)行部分水解，可以改變酶的催化特性。以改變酶的催化特性。肽鏈伸展后的修飾：肽鏈伸展后的修飾：酶蛋白經(jīng)過(guò)脲、鹽酸胍處理，酶蛋白經(jīng)過(guò)脲、鹽酸胍處理，使肽鏈充分伸展，對(duì)酶分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)進(jìn)行修使肽鏈充分伸展，對(duì)酶分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)進(jìn)行修飾，然后在適當(dāng)條件下，飾，然后在適當(dāng)條件下，重新進(jìn)行折疊重新進(jìn)行折疊。酶蛋白主鏈修飾酶蛋白主鏈修飾( (肽鏈有限水解修

31、飾肽鏈有限水解修飾) )n利用酶分子主鏈的切斷和連接，使酶分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其空間利用酶分子主鏈的切斷和連接，使酶分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的特性和功能的方法。結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的特性和功能的方法。n酶蛋白主鏈修飾主要是靠酶切酶蛋白主鏈修飾主要是靠酶切/ /酶原激活法。酶原激活法。a a、胃蛋白酶原的激活、胃蛋白酶原的激活 HCl胃胃蛋蛋白白酶酶原原pH1.52（從從N N端端失失去去4 44 4個(gè)個(gè)氨氨基基酸酸殘殘基基）自自身身激激活活胃胃蛋蛋白白酶酶b b、胰蛋白酶原（、胰蛋白酶原（trypsinogentrypsinogen）的激活）的激活 -S-S-X靜

32、電吸引靜電吸引力或氫鍵力或氫鍵-S-S-XSSSSc c、胰凝乳蛋白酶原（、胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogenchymotrypsinogen）的激活）的激活 （1）酶的表面修飾）酶的表面修飾（2）酶分子的內(nèi)部修飾）酶分子的內(nèi)部修飾（3）與輔因子相關(guān)的修飾）與輔因子相關(guān)的修飾（4）金屬酶的金屬取代）金屬酶的金屬取代3. 酶分子的化學(xué)修飾方法酶分子的化學(xué)修飾方法(3)(3)與輔因子相關(guān)的修飾與輔因子相關(guān)的修飾 對(duì)依賴(lài)輔因子的酶可用兩種方法進(jìn)行修飾：對(duì)依賴(lài)輔因子的酶可用兩種方法進(jìn)行修飾： 如果輔因子與酶是非共價(jià)結(jié)合的如果輔因子與酶是非共價(jià)結(jié)合的, ,可以將輔因子可以將輔因子共共價(jià)價(jià)結(jié)

33、合于酶分子上；結(jié)合于酶分子上； 引入新的具有引入新的具有更強(qiáng)反應(yīng)更強(qiáng)反應(yīng)的輔因子。的輔因子。（1）酶的表面修飾）酶的表面修飾（2）酶分子的內(nèi)部修飾）酶分子的內(nèi)部修飾（3）與輔因子相關(guān)的修飾）與輔因子相關(guān)的修飾（4）金屬酶的金屬取代）金屬酶的金屬取代3. 酶分子的化學(xué)修飾方法酶分子的化學(xué)修飾方法（4） 金屬酶的金屬取代：金屬酶的金屬取代： 酶分子中的金屬離子可以被其他金屬離子酶分子中的金屬離子可以被其他金屬離子取代，可以改變?nèi)〈梢愿淖兠傅膶?zhuān)一性、穩(wěn)定性酶的專(zhuān)一性、穩(wěn)定性等。等。（1）酶的表面修飾）酶的表面修飾（2）酶分子的內(nèi)部修飾）酶分子的內(nèi)部修飾（3）與輔因子相關(guān)的修飾）與輔因子相關(guān)的修飾

34、（4）金屬酶的金屬取代）金屬酶的金屬取代3. 酶分子的化學(xué)修飾方法酶分子的化學(xué)修飾方法4.酶修飾后的性質(zhì)變化酶修飾后的性質(zhì)變化（）熱穩(wěn)定性（）熱穩(wěn)定性：一般來(lái)說(shuō)，經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾的一般來(lái)說(shuō)，經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾的酶，熱穩(wěn)定性有較大的提高。主要是由于修酶，熱穩(wěn)定性有較大的提高。主要是由于修飾試劑的多個(gè)功能基團(tuán)與酶分子的多個(gè)功能飾試劑的多個(gè)功能基團(tuán)與酶分子的多個(gè)功能基團(tuán)相互交聯(lián)增加了酶分子構(gòu)象的穩(wěn)定性基團(tuán)相互交聯(lián)增加了酶分子構(gòu)象的穩(wěn)定性（表表4-1）。）。（）抗原性（）抗原性：修飾酶的抗原性與修飾劑有關(guān)，修飾酶的抗原性與修飾劑有關(guān)，目前比較公認(rèn)的是目前比較公認(rèn)的是PEG和和人血清白蛋白人血清白蛋白在消在消除酶

35、分子抗原性方面效果較好（除酶分子抗原性方面效果較好（表表4-2）。）。表表4-14-1 天然酶和修飾酶的熱穩(wěn)定性比較天然酶和修飾酶的熱穩(wěn)定性比較 酶酶 修飾劑修飾劑 修飾酶修飾酶 天然酶天然酶 處理?xiàng)l件處理?xiàng)l件(/(/時(shí)間時(shí)間) ) 殘留酶活殘留酶活(%)(%)酰苷脫氫酶酰苷脫氫酶 胰蛋白酶胰蛋白酶 過(guò)氧化氫酶過(guò)氧化氫酶 溶菌酶溶菌酶 尿激酶尿激酶糜蛋白酶糜蛋白酶 右旋糖苷右旋糖苷 右旋糖苷右旋糖苷 右旋糖苷右旋糖苷 右旋糖苷右旋糖苷 人血清白蛋白人血清白蛋白 肝肝 素素 37/100min37/100min 100/30min100/30min 50/10min50/10min 100/30

36、min100/30min 37/48h37/48h 37/24h37/24h 7070 100100 4646 6464 4040 9090 2020 9999 8080 0 0 9595 5050酶酶L-Asn L-Asn 酶酶SODSOD酶酶 Gln-Aln Gln-Aln 酶酶尿酸酶尿酸酶腺苷脫氫酶腺苷脫氫酶Arg Arg 酶酶過(guò)氧化氫酶過(guò)氧化氫酶胰蛋白酶胰蛋白酶抗原性抗原性修飾劑修飾劑 - - 葡萄糖苷葡萄糖苷酶酶核糖核酸酶核糖核酸酶PEGPEGPEGPEGPEGPEGPEGPEGPEGPEGPEGPEG白蛋白白蛋白白蛋白白蛋白白蛋白白蛋白Poly-DL-AlaPoly-DL-Ala消

37、消 除除消消 除除消消 除除消消 除除消消 除除消消 除除消消 除除降降 低低降降 低低消消 除除表表4-24-2 修飾酶的抗原性變化修飾酶的抗原性變化(3)對(duì)各類(lèi)失活因子的抵抗力對(duì)各類(lèi)失活因子的抵抗力:化學(xué)修飾酶與天然酶相化學(xué)修飾酶與天然酶相比比,對(duì)蛋白酶、抑制劑等失活因子的抵抗力均有不對(duì)蛋白酶、抑制劑等失活因子的抵抗力均有不同程度的提高（表同程度的提高（表4-3）。）。(4)修飾酶在體內(nèi)的半衰期：修飾酶在體內(nèi)的半衰期：多數(shù)修飾酶在體內(nèi)的半多數(shù)修飾酶在體內(nèi)的半衰期得到有效延長(zhǎng)（表衰期得到有效延長(zhǎng)（表4-4）。）。(5)最適最適pH:大多數(shù)酶經(jīng)化學(xué)修飾后，最適大多數(shù)酶經(jīng)化學(xué)修飾后，最適pH發(fā)生

38、了發(fā)生了變化，這在應(yīng)用上具有重要意義（表變化，這在應(yīng)用上具有重要意義（表4-5）。）。(6)Km 的變化的變化:有些酶經(jīng)化學(xué)修飾后，有些酶經(jīng)化學(xué)修飾后，Km變大，這變大，這可能是由于可能是由于屏蔽效應(yīng)屏蔽效應(yīng)引起的。引起的。表表4-3 4-3 天然酶和修飾酶抗失活因子能力比較天然酶和修飾酶抗失活因子能力比較酶酶抗抑制劑抗抑制劑抗蛋白酶抗蛋白酶修飾劑修飾劑抗失活劑抗失活劑過(guò)氧化氫酶過(guò)氧化氫酶核糖核酸酶核糖核酸酶溶菌酶溶菌酶胰蛋白酶胰蛋白酶 - - 葡萄糖苷葡萄糖苷酶酶尿激酶尿激酶右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷白蛋白白蛋白右旋糖苷右旋糖苷抗胰蛋白酶抗胰蛋白酶抗蛋白

39、酶抗蛋白酶抗糜蛋白酶抗糜蛋白酶抗胰蛋白酶抗胰蛋白酶抗抗SDSSDS抗大豆抑制劑抗大豆抑制劑抗胃蛋白酶抗胃蛋白酶抗胎盤(pán)抑制劑抗胎盤(pán)抑制劑抗尿素抗尿素抗抗SDSSDS表表4-4 4-4 天然酶與修飾酶的半衰期比較天然酶與修飾酶的半衰期比較酶酶羧肽酶羧肽酶Arg Arg 酶酶Gln-AsnGln-Asn酶酶尿酸酶尿酸酶超氧化物岐化酶超氧化物岐化酶過(guò)氧化氫酶過(guò)氧化氫酶修飾劑修飾劑半衰期半衰期天然酶天然酶修飾酶修飾酶白蛋白白蛋白白蛋白白蛋白糖肽糖肽右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷PEGPEG3.5h3.5h17h17h1.4h1.4h1h1h4h4h6min6min6h6h12h12h8h8h20h20

40、h4h4h8h8h表表4-5 4-5 天然酶與修飾酶的最適天然酶與修飾酶的最適pHpH酶酶修飾酶修飾酶天然酶天然酶修飾劑修飾劑糜蛋白酶糜蛋白酶豬肝尿酸酶豬肝尿酸酶吲哚吲哚-3 -3 -鏈烷羥化酶鏈烷羥化酶豬肝尿酸酶豬肝尿酸酶產(chǎn)沅假絲酵母尿酸酶產(chǎn)沅假絲酵母尿酸酶白蛋白白蛋白PEGPEGPEGPEG聚丙烯酸聚丙烯酸肝肝 素素10.510.57.4 - 8.57.4 - 8.55.0 - 5.55.0 - 5.59.09.08.88.83.53.58.28.28.28.28.08.09.09.04. 修飾酶的化學(xué)性質(zhì)修飾酶的化學(xué)性質(zhì)（）熱穩(wěn)定性（）熱穩(wěn)定性（）抗原性（）抗原性（）對(duì)各類(lèi)失活因子的抵抗

41、力（）對(duì)各類(lèi)失活因子的抵抗力（）修飾酶在體內(nèi)的半衰期（）修飾酶在體內(nèi)的半衰期（）最適（）最適pH（）（）Km 的變化的變化5. 化學(xué)人工酶化學(xué)人工酶=化學(xué)人工酶是根據(jù)酶的催化機(jī)理，模擬天然酶的生物催化功能，利用有機(jī)化學(xué)和生物學(xué)方法合成的具有專(zhuān)一催化功能的酶模擬物或酶；=依據(jù)合成方法，又分為半合成酶和全合成酶，抗體酶就是一種特殊的全合成酶；=此外，科學(xué)家還根據(jù)有關(guān)酶和輔酶的知識(shí)，用有機(jī)化學(xué)合成的方法設(shè)計(jì)、合成比輔酶分子更小簡(jiǎn)單的輔酶模型化合物，研究其在非酶促條件下的反應(yīng)活性和催化機(jī)理。5.化學(xué)人工酶化學(xué)人工酶（1）半合成酶）半合成酶（2）全合成酶）全合成酶 小分子有機(jī)物全合成酶 抗體酶 人工聚合

42、物酶（3）輔酶模型化合物）輔酶模型化合物將具有催化活性的金屬或金屬有機(jī)物與具有特異性將具有催化活性的金屬或金屬有機(jī)物與具有特異性的蛋白質(zhì)相結(jié)合；的蛋白質(zhì)相結(jié)合； （1）半合成酶（）半合成酶（Semisynthetic Enzyme)半合成酶：半合成酶：將具有一定結(jié)構(gòu)和功能的將具有一定結(jié)構(gòu)和功能的物質(zhì)物質(zhì)與與特異的蛋特異的蛋白質(zhì)白質(zhì)相結(jié)合，形成的一類(lèi)新的生物催化劑。相結(jié)合，形成的一類(lèi)新的生物催化劑。半合成酶的合成方法有兩種：半合成酶的合成方法有兩種： Go將具有特異性的物質(zhì)與具有催化功能的酶相結(jié)合。將具有特異性的物質(zhì)與具有催化功能的酶相結(jié)合。 GoGrayGray與與MargalitMargal

43、it將電子傳遞催化劑將電子傳遞催化劑RnRn釕釕(NH(NH3 3) )3 3 3+3+與巨頭鯨與巨頭鯨肌紅蛋白肌紅蛋白結(jié)合，產(chǎn)生一種半合成的無(wú)機(jī)結(jié)合，產(chǎn)生一種半合成的無(wú)機(jī)生物酶。肌紅蛋白傳遞氧氣，生物酶。肌紅蛋白傳遞氧氣， Rn(NHRn(NH3 3) )3 3 3+3+將能將能氧氧化化各種有機(jī)物（如抗壞血酸）。各種有機(jī)物（如抗壞血酸）。這種人工酶的催化效率接近天然的抗壞血酸氧化這種人工酶的催化效率接近天然的抗壞血酸氧化酶的活力。酶的活力。抗壞血酸氧化酶抗壞血酸氧化酶美國(guó)美國(guó)SchultzSchultz小組，寡聚核苷酸鏈連接到金黃色小組，寡聚核苷酸鏈連接到金黃色葡萄球菌核酸酶的葡萄球菌核酸酶

44、的CysCys116116上（上（ LysLys116116突變成突變成CysCys116116 ）然后，作用于單鏈然后，作用于單鏈RNARNA底物上，使底物發(fā)生了序底物上，使底物發(fā)生了序列特異性切割列特異性切割這是第一個(gè)不同于這是第一個(gè)不同于DNADNA限制性?xún)?nèi)切酶的限制性?xún)?nèi)切酶的RNARNA限制限制性?xún)?nèi)切酶性?xún)?nèi)切酶（2）全合成酶）全合成酶=這類(lèi)人工酶不是蛋白質(zhì)（抗體酶除外），而是這類(lèi)人工酶不是蛋白質(zhì)（抗體酶除外），而是一些一些有機(jī)化合物有機(jī)化合物通過(guò)引入通過(guò)引入酶的催化基團(tuán)酶的催化基團(tuán)來(lái)控制來(lái)控制空間構(gòu)象，象天然酶那樣能選擇性地催化化學(xué)空間構(gòu)象，象天然酶那樣能選擇性地催化化學(xué)反應(yīng)。全合成酶

45、又分為：反應(yīng)。全合成酶又分為：4小分子有機(jī)化合物小分子有機(jī)化合物 ：是利用各種有機(jī)分子（如：是利用各種有機(jī)分子（如 -環(huán)糊精、卟啉等）和金屬離子制備的具有水環(huán)糊精、卟啉等）和金屬離子制備的具有水解、氧化還原或轉(zhuǎn)氨等功能的全合成酶。解、氧化還原或轉(zhuǎn)氨等功能的全合成酶。4抗體酶抗體酶：具有催化活性的抗體；是利用分子印：具有催化活性的抗體；是利用分子印跡技術(shù)制備的人工酶。跡技術(shù)制備的人工酶。4人工聚合物酶人工聚合物酶：制備原理與抗體酶相同，只是：制備原理與抗體酶相同，只是以以人工聚合物人工聚合物代替了抗體代替了抗體。 小分子有機(jī)物全合成酶小分子有機(jī)物全合成酶 ： 是利用各種是利用各種有機(jī)分子有機(jī)分子

46、（如（如 -環(huán)糊精、卟啉等）和環(huán)糊精、卟啉等）和金屬離子金屬離子制備的具有水解、氧化還原或轉(zhuǎn)氨等制備的具有水解、氧化還原或轉(zhuǎn)氨等功能的全合成酶。功能的全合成酶。 1985年年Bender等人用等人用 -環(huán)糊環(huán)糊精的空穴作為底物結(jié)合部位，精的空穴作為底物結(jié)合部位，以連在環(huán)糊精上的以連在環(huán)糊精上的羧基羧基、咪咪唑基唑基及環(huán)糊精自身的一個(gè)及環(huán)糊精自身的一個(gè)羥羥基基共同構(gòu)成催化中心，制備共同構(gòu)成催化中心，制備了名為了名為-Benzyme的胰凝乳蛋的胰凝乳蛋白模擬酶白模擬酶. 其中胰凝乳蛋白模擬酶催化其中胰凝乳蛋白模擬酶催化簡(jiǎn)單酯反應(yīng)的速率和天然酶簡(jiǎn)單酯反應(yīng)的速率和天然酶接近，但接近，但熱穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性

47、與與pH穩(wěn)定穩(wěn)定性大大優(yōu)于天然酶，模擬酶性大大優(yōu)于天然酶，模擬酶的活力在的活力在80仍能保持，在仍能保持，在pH213的大范圍內(nèi)都是穩(wěn)定的大范圍內(nèi)都是穩(wěn)定的。的。 由環(huán)糊精制成的人工轉(zhuǎn)氨酶由環(huán)糊精制成的人工轉(zhuǎn)氨酶能催化第一酮酸與磷酸吡哆能催化第一酮酸與磷酸吡哆胺專(zhuān)一性地合成氨基酸胺專(zhuān)一性地合成氨基酸 其催化對(duì)叔丁基苯乙酸酯比天然酶快一倍其催化對(duì)叔丁基苯乙酸酯比天然酶快一倍氨肽酶全合成酶氨肽酶全合成酶：由三乙撐四胺（：由三乙撐四胺（TrienTrien）的）的CoCo3+3+絡(luò)合物絡(luò)合物轉(zhuǎn)氨全合成酶轉(zhuǎn)氨全合成酶：GlyGly與與AlaAla的西佛氏堿的的西佛氏堿的CuCu2+2+絡(luò)合絡(luò)合物物AT

48、PATP水解全合成酶水解全合成酶：CoCo3+3+Edda(HEdda(H2 2O O2 2) )2 2 - -GlyC=N-Ala O5.化學(xué)人工酶化學(xué)人工酶（1）半合成酶）半合成酶（2）全合成酶）全合成酶 小分子有機(jī)物全合成酶小分子有機(jī)物全合成酶 抗體酶抗體酶 人工聚合物酶人工聚合物酶（3）輔酶模型化合物輔酶模型化合物 抗體酶（抗體酶（Abzyme):=20世紀(jì)世紀(jì)80年代以來(lái)出現(xiàn)的一種具有催化活性的年代以來(lái)出現(xiàn)的一種具有催化活性的蛋白質(zhì)，是利用生物學(xué)和化學(xué)的成果在分子水蛋白質(zhì)，是利用生物學(xué)和化學(xué)的成果在分子水平上交叉滲透研究的產(chǎn)物；平上交叉滲透研究的產(chǎn)物；=抗體酶：抗體酶：其本質(zhì)上是免疫

49、球蛋白，只是在其易其本質(zhì)上是免疫球蛋白，只是在其易變區(qū)被賦予了酶的屬性，因此抗體酶又稱(chēng)為催變區(qū)被賦予了酶的屬性，因此抗體酶又稱(chēng)為催化抗體（化抗體（Catalytic Antibody)。4抗體酶的理論基礎(chǔ)：抗體酶的理論基礎(chǔ)：4半抗原與催化性抗體：半抗原與催化性抗體：4抗體酶的制備方法：抗體酶的制備方法：n抗體：是在動(dòng)物體針對(duì)注射抗原產(chǎn)生抗體：是在動(dòng)物體針對(duì)注射抗原產(chǎn)生 的，能特異與這種抗原結(jié)合的免疫球的，能特異與這種抗原結(jié)合的免疫球 蛋白。即：動(dòng)物為對(duì)抗外來(lái)物質(zhì)的入蛋白。即：動(dòng)物為對(duì)抗外來(lái)物質(zhì)的入 侵而合成的一種蛋白質(zhì)。侵而合成的一種蛋白質(zhì)。n抗原：能啟動(dòng)機(jī)體的免疫應(yīng)答，且能與其應(yīng)答產(chǎn)物結(jié)合，

50、并發(fā)抗原：能啟動(dòng)機(jī)體的免疫應(yīng)答，且能與其應(yīng)答產(chǎn)物結(jié)合，并發(fā)生一系列生物學(xué)效應(yīng)的物質(zhì)。抗原一般具備兩種特性：一是生一系列生物學(xué)效應(yīng)的物質(zhì)。抗原一般具備兩種特性：一是免免疫原性疫原性，即能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答（特異性抗體）；二是，即能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答（特異性抗體）；二是抗抗原性原性，指能與抗體特異性結(jié)合。，指能與抗體特異性結(jié)合。n完全抗原：同時(shí)具備免疫原性和抗原性的稱(chēng)為完全抗原完全抗原：同時(shí)具備免疫原性和抗原性的稱(chēng)為完全抗原n半抗原（半抗原（hapten）：只具備抗原性而不具備免疫原性的，也稱(chēng)）：只具備抗原性而不具備免疫原性的，也稱(chēng)不完全抗原（不完全抗原（incomplete antigen）

51、。外來(lái)的小分子不會(huì)刺激動(dòng)）。外來(lái)的小分子不會(huì)刺激動(dòng)物體產(chǎn)生抗體，但若他們與大分子結(jié)合后，則能誘導(dǎo)抗體的形物體產(chǎn)生抗體，但若他們與大分子結(jié)合后，則能誘導(dǎo)抗體的形成。成。抗體酶的理論基礎(chǔ)抗體酶的理論基礎(chǔ)Pauling(1948)過(guò)渡態(tài)結(jié)構(gòu)理論：過(guò)渡態(tài)結(jié)構(gòu)理論：酶與抗體的重要區(qū)別：酶能夠結(jié)合并穩(wěn)定化學(xué)酶與抗體的重要區(qū)別：酶能夠結(jié)合并穩(wěn)定化學(xué)反應(yīng)的過(guò)渡態(tài)，降低反應(yīng)的活化能；而抗體結(jié)合反應(yīng)的過(guò)渡態(tài)，降低反應(yīng)的活化能；而抗體結(jié)合的抗原只是一個(gè)基態(tài)分子。的抗原只是一個(gè)基態(tài)分子。相同點(diǎn)：酶分子與它催化反應(yīng)的過(guò)渡態(tài)互補(bǔ)，相同點(diǎn)：酶分子與它催化反應(yīng)的過(guò)渡態(tài)互補(bǔ)，抗體與抗原互補(bǔ)；酶和抗體都是有生物活性的蛋抗體與抗原

52、互補(bǔ)；酶和抗體都是有生物活性的蛋白質(zhì)。白質(zhì)。 Lerner(1984)提出：若以提出：若以過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物為半抗過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物為半抗原原，則其誘發(fā)，則其誘發(fā)產(chǎn)生的抗體應(yīng)該與該類(lèi)似物具有互產(chǎn)生的抗體應(yīng)該與該類(lèi)似物具有互補(bǔ)構(gòu)象補(bǔ)構(gòu)象；這種抗體與過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物結(jié)合后，從而；這種抗體與過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物結(jié)合后，從而引起催化引起催化作用。作用。1986 年年Lerner和和Schultz兩個(gè)研究小組獨(dú)自發(fā)表兩個(gè)研究小組獨(dú)自發(fā)表了關(guān)于芳香酯了關(guān)于芳香酯(aryl esters) 和碳酸酯和碳酸酯(carbonates) 的抗體催化水解的報(bào)道。首次證實(shí)由的抗體催化水解的報(bào)道。首次證實(shí)由過(guò)渡態(tài)類(lèi)似過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物為半抗原物為半

53、抗原,通過(guò)雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的抗體具有類(lèi)似通過(guò)雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的抗體具有類(lèi)似酶的催化活性。酶的催化活性。 1986年年Lerner研究組在研究組在Science上發(fā)上發(fā)表了抗體酶研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，標(biāo)志著表了抗體酶研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，標(biāo)志著抗體抗體酶的研究進(jìn)入了一個(gè)新階段酶的研究進(jìn)入了一個(gè)新階段。l轉(zhuǎn)酰基反應(yīng)轉(zhuǎn)酰基反應(yīng)l水解反應(yīng)水解反應(yīng)lClaisen重排反應(yīng)重排反應(yīng)l酰胺合成反應(yīng)酰胺合成反應(yīng)lDiels-Alder反應(yīng)反應(yīng)l轉(zhuǎn)酯反應(yīng)轉(zhuǎn)酯反應(yīng)l光誘導(dǎo)反應(yīng)光誘導(dǎo)反應(yīng)l氧化還原反應(yīng)氧化還原反應(yīng)l脫羧反應(yīng)脫羧反應(yīng)l順?lè)串悩?gòu)化反應(yīng)順?lè)串悩?gòu)化反應(yīng) 抗體酶（抗體酶（Abzyme):4抗體酶的理論基礎(chǔ)：抗體酶的理論基礎(chǔ)：

54、4半抗原與催化性抗體半抗原與催化性抗體：4抗體酶的制備方法：抗體酶的制備方法：半抗原與催化性抗體半抗原與催化性抗體半抗原設(shè)計(jì)中應(yīng)考慮：半抗原設(shè)計(jì)中應(yīng)考慮：產(chǎn)生的抗體能否具有預(yù)期的產(chǎn)生的抗體能否具有預(yù)期的催化活性催化活性能否刺激機(jī)體能否刺激機(jī)體免疫應(yīng)答免疫應(yīng)答半抗原結(jié)構(gòu)與催化抗體之間的關(guān)系：半抗原結(jié)構(gòu)與催化抗體之間的關(guān)系：半抗原結(jié)構(gòu)中應(yīng)含有半抗原結(jié)構(gòu)中應(yīng)含有芳香結(jié)構(gòu)芳香結(jié)構(gòu)（具較強(qiáng)的免疫原性）（具較強(qiáng)的免疫原性）催化抗體和半抗原的催化抗體和半抗原的親和力親和力，一般認(rèn)為結(jié)合常數(shù)，一般認(rèn)為結(jié)合常數(shù)KiKi應(yīng)小于應(yīng)小于1010- -6 6mol/Lmol/L，容易獲得高效催化抗體；，容易獲得高效催化

55、抗體；誘導(dǎo)羧酸酯、酰胺水解的催化性抗體，可利用其具有誘導(dǎo)羧酸酯、酰胺水解的催化性抗體，可利用其具有四面體結(jié)四面體結(jié)構(gòu)的高能過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物構(gòu)的高能過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物為抗原為抗原半抗原設(shè)計(jì)應(yīng)考慮催化反應(yīng)的環(huán)境與反應(yīng)機(jī)制，即所設(shè)計(jì)的半半抗原設(shè)計(jì)應(yīng)考慮催化反應(yīng)的環(huán)境與反應(yīng)機(jī)制，即所設(shè)計(jì)的半抗原應(yīng)能誘導(dǎo)催化抗體在其抗原結(jié)合部位抗原應(yīng)能誘導(dǎo)催化抗體在其抗原結(jié)合部位創(chuàng)造出特定的有利創(chuàng)造出特定的有利于催化反應(yīng)的環(huán)境于催化反應(yīng)的環(huán)境（疏水微環(huán)境疏水微環(huán)境） 抗體酶（抗體酶（Abzyme):4抗體酶的理論基礎(chǔ)：抗體酶的理論基礎(chǔ)：4半抗原與催化性抗體：半抗原與催化性抗體：4抗體酶的制備方法：抗體酶的制備方法：誘導(dǎo)法：誘導(dǎo)法

56、：用設(shè)計(jì)好的抗原按照一定的單用設(shè)計(jì)好的抗原按照一定的單克隆程序，獲得具有催化活性的抗體。克隆程序，獲得具有催化活性的抗體。aa過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物載體蛋白載體蛋白抗體酶抗體酶抗體酶的制備方法抗體酶的制備方法博萊克博萊克(Pollack)等以硝基苯酚磷酸膽堿酯作為半抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生單等以硝基苯酚磷酸膽堿酯作為半抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生單抗，經(jīng)篩選找到加快水解反應(yīng)抗，經(jīng)篩選找到加快水解反應(yīng)1.2萬(wàn)倍的抗體酶。萬(wàn)倍的抗體酶。抗體酶的制備方法抗體酶的制備方法拷貝法拷貝法：用已知的酶作為抗原對(duì)動(dòng)物進(jìn)行第一次免疫用已知的酶作為抗原對(duì)動(dòng)物進(jìn)行第一次免疫, ,獲獲得抗酶抗體得抗酶抗體; ;再用抗酶抗體作為抗原進(jìn)行第二次免

57、疫獲得抗抗再用抗酶抗體作為抗原進(jìn)行第二次免疫獲得抗抗體體, ,抗抗體實(shí)際上就是具有原來(lái)酶活性的抗體酶。抗抗體實(shí)際上就是具有原來(lái)酶活性的抗體酶。酶酶第一次免疫第一次免疫抗酶抗體抗酶抗體第二次免疫第二次免疫抗體酶抗體酶引入法引入法n將將催化基團(tuán)催化基團(tuán)或或輔助因子輔助因子引入引入到到抗體的抗原結(jié)合部位抗體的抗原結(jié)合部位, ,一一般可采用兩種方法般可采用兩種方法: :即即選擇性化學(xué)修飾法選擇性化學(xué)修飾法和和基因工程定基因工程定點(diǎn)突變法點(diǎn)突變法。n以底物為半抗原所產(chǎn)生的抗體應(yīng)當(dāng)具有以底物為半抗原所產(chǎn)生的抗體應(yīng)當(dāng)具有底物結(jié)合部位底物結(jié)合部位, , 然后在此抗體的結(jié)合部位上然后在此抗體的結(jié)合部位上引入催化

58、基團(tuán)引入催化基團(tuán)；如果引入；如果引入的催化基團(tuán)與底物結(jié)合部位取向正確、空間排布恰到的催化基團(tuán)與底物結(jié)合部位取向正確、空間排布恰到好處好處, , 則應(yīng)產(chǎn)生高活力抗體酶則應(yīng)產(chǎn)生高活力抗體酶. .n羅貴民領(lǐng)導(dǎo)的研究小組開(kāi)發(fā)了一種化學(xué)誘羅貴民領(lǐng)導(dǎo)的研究小組開(kāi)發(fā)了一種化學(xué)誘變具有底物結(jié)合部位的單克隆抗體制備變具有底物結(jié)合部位的單克隆抗體制備含含硒抗體酶硒抗體酶的方法。的方法。n該方法的原理是該方法的原理是, ,抗體可變區(qū)一般含有抗體可變區(qū)一般含有3 34 4 個(gè)絲氨酸個(gè)絲氨酸(Ser) (Ser) 殘基殘基, ,而而Ser Ser 可用化學(xué)修飾可用化學(xué)修飾法轉(zhuǎn)化為硒代半胱氨酸法轉(zhuǎn)化為硒代半胱氨酸(SeC

59、ys) ,(SeCys) ,而而SeCysSeCys 是是谷胱甘肽過(guò)氧化物酶谷胱甘肽過(guò)氧化物酶( GPX) ( GPX) 不可缺少的不可缺少的催化活性基團(tuán)催化活性基團(tuán)。n先用標(biāo)準(zhǔn)的單抗制備法獲得具有谷胱甘肽先用標(biāo)準(zhǔn)的單抗制備法獲得具有谷胱甘肽( GSH) ( GSH) 結(jié)合部位的單抗結(jié)合部位的單抗, ,再用苯甲基磺酰再用苯甲基磺酰氟氟( PMSF) ( PMSF) 活化活化Ser Ser 的羥基的羥基, ,相繼以氫化硒相繼以氫化硒(H(H2 2Se) Se) 處理處理, ,則將單抗結(jié)合部位上的則將單抗結(jié)合部位上的SerSer突突變成硒代半胱氨酸變成硒代半胱氨酸( (SeCysSeCys) ,)

60、 ,因而在單抗結(jié)因而在單抗結(jié)合部位上引入了酶的催化基團(tuán)。這樣合部位上引入了酶的催化基團(tuán)。這樣, ,單抗單抗的結(jié)合部位上既有底物結(jié)合部位的結(jié)合部位上既有底物結(jié)合部位, ,又有催化又有催化基團(tuán)基團(tuán), ,因而會(huì)顯示出因而會(huì)顯示出GPXGPX活性活性20022008固氮酶固氮酶結(jié)構(gòu)輿功能及其防結(jié)構(gòu)輿功能及其防氧保證機(jī)制研究氧保證機(jī)制研究、酶穩(wěn)酶穩(wěn)定劑定劑的開(kāi)發(fā)研究的開(kāi)發(fā)研究、提高提高超氧化物岐化酶活力超氧化物岐化酶活力和穩(wěn)定和穩(wěn)定性的研究性的研究、含硒人工酶含硒人工酶研究研究等項(xiàng)目的研究工作。等項(xiàng)目的研究工作。v近年發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶中存在近年發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶中存在硒硒代半胱氨酸代半胱氨酸，