1、分子標記遺傳圖譜的構建檢測出的每個分子標記反映的都是相應染色體座位上的遺傳多態性狀態。為了有效地分析利用分子標記所提供的遺傳信息，人們希望知道不同分子標記在染色體上的相對位置或排列情況，也就是要構建分子標記的遺傳連鎖圖譜。利用DNA標記構建遺傳連鎖圖譜在原理上與傳統遺傳圖譜的構建是一樣的。其基本步驟包括：選擇適合作圖的DNA標記；根據遺傳材料之間的DNA多態性，選擇用于建立作圖群體的親本組合；建立具有大量DNA標記處于分離狀態的分離群體或衍生系；測定作圖群體中不同個體或株系的標記基因型；對標記基因型數據進行連鎖分析，構建標記連鎖圖。至今為止，已構建了許多植物的高密度分子標記連鎖圖。本章側重介紹

2、利用DNA標記構建分子遺傳連鎖圖譜的原理與方法。第一節作圖群體的建立要構建DNA標記連鎖圖譜，必須建立作圖群體。建立作圖群體需要考慮的重要因素包括親本的選配、分離群體類型的選擇及群體大小的確定等。一、親本的選配親本的選擇直接影響到構建連鎖圖譜的難易程度及所建圖譜的適用范圍。一般應從四個方面對親本進行選擇，首先要考慮親本間的DNA多態性。親本之間的DNA多態性與其親緣關系有著密切關系，這種親緣關系可用地理的、形態的或同工酶多態性作為選擇標準。一般而言，異交作物的多態性高，自交作物的多態性低。例如，玉米的多態性極好，一般自交系間配制的群體就可成為理想的RFLP作圖群體；番茄的多態性較差，因而只能選

3、用不同種間的后代構建作圖群體；水稻的多態性居中，美國康乃爾大學S.D.Tanksley實驗室1988年發表的RFLP連鎖圖譜是以釉稻和爪哇稻之間的雜交組合為基礎構建的(McCouchetal.1988)。在作物育種實踐中，育種家常將野生種的優良性狀轉育到栽培種中，這種親源關系較遠的雜交轉育，DNA多態性非常豐富。第二，選擇親本時應盡量選用純度高的材料，并進一步通過自交進行純化。第三，要考慮雜交后代的可育性。親本間的差異過大，雜種染色體之間的配對和重組會受到抑制，導致連鎖座位間的重組率偏低，并導致嚴重的偏分離現象，降低所建圖譜的可信度和適用范圍；嚴重的還會降低雜種后代的結實率，甚至導致不育，影響

4、分離群體的構建。由于各種原因，僅用一對親本的分離群體建立的遺傳圖譜往往不能完全滿足基因組研究和各種育種目標的要求，應選用幾個不同的親本組合，分別進行連鎖作圖，以達到相互彌補的目的。第四，選配親本時還應對親本及其Fi雜種進行細胞學鑒定。若雙親間存在相互易位，或多倍體材料（如小麥）存在單體或部分染色體缺失等問題，那末其后代就不宜用來構建連鎖圖譜。二、分離群體類型的選擇根據其遺傳穩定性可將分離群體分成兩大類：一類稱為暫時性分離群體，如F2、F3、F4、BC、三交群體等，這類群體中分離單位是個體，一經自交或近交其遺傳組成就會發生變化，無法永久使用。另一類稱為永久性分離群體，如RI、DH群體等，這類群體

5、中分離單位是株系，不同株系之間存在基因型的差異，而株系內個體間的基因型是相同且純合的，是自交不分離的。這類群體可通過自交或近交繁殖后代，而不會改變群體的遺傳組成，可以永久使用。構建DNA連鎖圖譜可以選用不同類型的分離群體，它們各有其優缺點，因此應結合具體情況選用。（一）F2代群體F2群體是常用的作圖群體，迄今大多數植物的DNA標記連鎖圖譜都是用F2群體構建的。不論是自花授粉植物，還是異花授粉植物，建立F2群體都是容易的，這是使用F2群體進行遺傳作圖的最大優點。但F2群體的一個不足之處是存在雜合基因型。對于顯性標記，將無法識別顯性純合基因型和雜合基因型。由于這種基因型信息簡并現象的存在，會降低作

6、圖的精度。而為了提高精度，減小誤差，則必須使用較大的群體，從而會增加DNA標記分析的費用。F2群體的另一個缺點是不易長期保存，有性繁殖一代后，群體的遺傳結構就會發生變化。為了延長F2群體的使用時間，一種方法是對其進行無性繁殖，如進行組織培養擴繁。但這種方法不是所有的植物都適用，且耗資費工。另一種方法是使用F2單株的衍生系（F3株系或F4家系）。將衍生系內多個單株混合提取DNA,則能代表原F2單株的DNA組成。為了保證這種代表性的真實可靠，衍生系中選取的單株必須是隨機的，且數量要足夠多。這種方法對于那些繁殖系數較大的自花授粉植物（如水稻、小麥等）特別適用。（二）BCi群體BCi（回交一代）也是一

7、種常用的作圖群體。BCi群體中每一分離的基因座只有兩種基因型，它直接反映了Fi代配子的分離比例，因而BCi群體的作圖效率最高，這是它優于F2群體的地方。BCi群體還有一個用途，就是可以用來檢驗雌、雄配子在基因間的重組率上是否存在差異。其方法是比較正、反回交群體中基因的重組率是否不同。例如正回交群體為（AXB）XA,反回交群體為AX（AXB）,則前者反映的是雌配子中的重組率，后者反映的是雄配子中的重組率。雖然BCi群體是一種很好的作圖群體，但它也與F2群體一樣，存在不能長期保存的問題。可以用F2中使用的類似方法來延長BCi群體的使用時間。另外，對于一些人工雜交比較困難的植物，BCi群體也不太合適

8、，因為一是難以建立較大的BCi群體，二是容易出現假雜種，造成作圖的誤差。順便一提，對于一些自交不親和的材料，可以使用三交群體，即（AXB）XC。由于存在自交不親和性，這樣的三交群體中不存在假雜種現象。（三）RI群體RI（重組自交系）群體是雜種后代經過多代自交而產生的一種作圖群體，通常從F2代開始，采用單粒傳的方法來建立。由于自交的作用是使基因型純合化，因此，RI群體中每個株系都是純合的，因而RI群體是一種可以長期使用的永久性分離群體。理論上，建立一個無限大的RI群體，必須自交無窮多代才能達到完全純合；建立一個有PM大小的RI群體則只需自交有限代。然而，即使是建立一個通常使用的包含i00200個

9、株系的RI群體，要達到完全純合，所需的自交代數也是相當多的。據吳為人等（i997）從理論上推算，對一個擁有i0條染色體的植物種，要建立完全純合的RI作圖群體，至少需要自交i5代。可見，建立RI群體是非常費時的。在實際研究中，人們往往無法花費那么多時間來建立一個真正的RI群體，所以常常使用自交67代的“準”RI群體。從理論上推算，自交6代后，單個基因座的雜合率只有大約3%,已基本接近純合。然而，由于構建連鎖圖譜時涉及到大量的DNA標記座位，因而雖然多數標記座位已達到或接近完全純合，但仍有一些標記座位存在較高的雜合率，有的高達20%以上（李維明等2000）。盡管如此，實踐證明，利用這樣的“準”RI

10、群體來構建分子標記連鎖圖譜仍是可行的。在RI群體中，每一分離座位上只存在兩種基因型，且比例為i:i。從這點看，RI群體的遺傳結構與BCi相似，也反映了Fi配子的分離比例。但值得注意的是，當分析RI群體中兩個標記座位之間的連鎖關系時，算得的重組率比例并不等于Fi配子中的重組率，這是因為在建立RI群體的過程中，兩標記座位間每一代都會發生重組，所以RI群體中得到的重組率比例是多代重組頻率的積累。不過，從理論上可以推算出，RI群體中的重組比例（R）與Fi配子中的重組率（r）之間的關系為：R=2r/（1+2r）。因此，用RI群體仍然可以估計重組率，亦即RI群體仍然可以用于遺傳作圖。RI群體的優點是可以長

11、期使用，可以進行重復試驗。因此它除了可用于構建分子標記連鎖圖外，特別適合于數量性狀基因座（QTL）的定位研究。但是，考慮到構建RI群體要花費很長時間，如果僅是為了構建分子標記連鎖圖的話，選用RI群體是不明智的。另外，異花授粉植物由于存在自交衰退和不結實現象，建立RI群體也比較困難。（四）DH群體高等植物的單倍體（Haploid）是含有配子染色體數的個體。單倍體經過染色體加倍形成的二倍體稱為加倍單倍體或雙單倍體（DH）。DH群體產生的途徑很多，亦因物種不同而異，最常見的方法是通過花藥培養，即取Fi植株的花藥進行離體培養，誘導產生單倍體植株，然后對染色體進行加倍產生DH植株。DH植株是純合的，自交

12、后即產生純系，因此DH群體可以穩定繁殖，長期使用，是一種永久性群體。DH群體的遺傳結構直接反映了Fi配子中基因的分離和重組，因此DH群體與BCi群體一樣，作圖效率是最高的。另外，由于DH群體跟RI群體一樣，可以反復使用，重復試驗，因此也特別適合于QTL定位的研究。DH群體直接從Fi花粉經培養產生，因而建立DH群體所需時間不多。但是，產生DH植株有賴于花培技術。有些植物的花藥培養非常困難，就無法通過花培來建立DH群體。另外，植物的花培能力跟基因型關系較大，因而花培過程會對不同基因型的花粉產生選擇效應，從而破壞DH群體的遺傳結構，造成較嚴重的偏分離現象，這會影響遺傳作圖的準確性。因此，如果是以構建

13、分子標記連鎖圖為主要目的的話，DH群體不是一種理想的作圖群體。三、群體大小的確定遺傳圖譜的分辨率和精度，很大程度上取決于群體大小。群體越大，則作圖精度越高。但群體太大，不僅增大實驗工作量，而且增加費用。因此確定合適的群體大小是十分必要的。DNA標記連鎖圖譜所合適群體大小的確定與作圖的內容有關。大量的作圖實踐表明，構建需的群體遠比構建形態性狀特別是數量性狀的遺傳圖譜要小，大部分已發表的分子標記連鎖圖譜所用的分離群體一般都不足100個單株或家系。而如果用這樣大小的群體去定位那些控制農藝性狀尤其是數量性狀的基因，就會產生很大的試驗誤差。從作圖效率考慮，作圖群體所需樣本容量的大小取決于以下兩個方面：一

14、是從隨機分離結果可以辨別的最大圖距，二是兩個標記間可以檢測到重組的最小圖距。因此，作圖群體的大小可根據研究的目標來確定。作圖群體越大，則可以分辨的最小圖距就越小，而可以確定的最大圖距也越大。如果建圖的目的是用于基因組的序列分析或基因分離等工作，則需用較大的群體，以保證所建連鎖圖譜的精確性。在實際工作中，構建分子標記骨架連鎖圖可基于大群體中的一個隨機小群體（如150個單株或家系），當需要精細地研究某個連鎖區域時，再有針對性地在骨架連鎖圖的基礎上擴大群體。這種大小群體相結合的方法，既可達到研究的目的，又可減輕工作量。作圖群體大小還取決于所用群體的類型。如常用的F2和BCi兩種群體，前者所需的群體就

15、必須大些。這是因為，F2群體中存在更多種類的基因型，而為了保證每種基因型都有可能出現，就必須有較大的群體。一般而言，F2群體的大小必須比BCi群體大約大一倍，才能達到與BCi相當的作圖精度。所以說，BCi的作圖效率比F2高得多。在分子標記連鎖圖的構建中，DH群體的作圖效率在統計上與BCi相當，而RI群體則稍差些。總的說來，在分子標記連鎖圖的構建方面，為了達到彼此相當的作圖精度，所需的群體大小的順序為F2RIBCi和DH。第二節圖譜構建的理論基礎一、染色體遺傳理論i903年W.S.Sutton和T.Boveri分別提出了遺傳因子位于染色體上的理論，他們將染色體看作是孟德爾基因的物理載體。該理論亦

16、稱為Sutton-Boveri染色體遺傳理論，其基本要點如下：（i）體細胞核內的染色體成對存在，其中一條來自雌親，一條來自雄親，成對染色體的兩個成員是同源的。（2）每條染色體在個體的生命周期中均能保持其結構上的恒定性和遺傳上的連續性，因而在個體的發育過程中起著一定的作用。（3）在減數分裂中，同源染色體的兩個成員相互配對，隨后又發生分離，走向細胞的兩極，從而形成兩個單倍體性細胞。二、基因重組和連鎖理論連鎖圖譜構建的理論基礎是染色體的交換與重組。在細胞減數分裂時，非同源染色體上的基因相互獨立、自由組合，同源染色體上的基因產生交換與重組，交換的頻率隨基因間距離的增加而增大。位于同一染色體上的基因在遺

17、傳過程中一般傾向于維系在一起，而表現為基因連鎖。它們之間的重組是通過一對同源染色體的兩個非姊妹染色單體之間的交換來實現的。假設某一對同源染色體上存在A-a,B-b兩對連鎖基因，現有兩個親本P1和p2,它們的基因型分別為AABB和aabb,兩親本雜交產生AaBb雙雜合體。Fi在減數分裂過程中應產生4種類型的配子，其中兩種為親型配子AB和ab,兩種為重組型配子Ab和aBo由于A-a和B-b位于同一染色體上，要產生重組型配子必須在這兩個基因的連鎖區段上發生交換。重組型配子所占的比例取決于減數分裂細胞中發生交換的頻率。交換頻率越高，則重組型配子的比例越大。重組型配子最大可能的比例是50%,這時在所有減

18、數分裂的細胞中，在兩對基因的連鎖區段上都發生交換，相當于這兩對基因間無連鎖，表現為獨立遺傳。重組型配子占總配子的比例稱為重組率，用r表示。重組率的高低取決于交換的頻率，而兩對基因之間的交換頻率取決于它們之間的直線距離。重組率的值變化于完全連鎖時的0%到完全獨立時的50%之間。因此重組率可用來表示基因間的遺傳圖距，圖距單位用厘摩(centi-Morgan,cM)表示，1cM的大小大致符合1%的重組率。三、圖譜制作的統計學原理(一)兩點測驗如果兩個基因座位于同一染色體上且相距較近，則在分離后代中通常表現為連鎖遺傳。對兩個基因座之間的連鎖關系進行檢測，稱為兩點測驗。在進行連鎖測驗之前，必須了解各基因

19、座位的等位基因分離是否符合孟德爾分離比例，這是連鎖檢驗的前提。在共顯性條件下，F2群體中一個座位上的基因型分離比例為1:2:1,而BC1和DH群體中分離比例均為1:1;在顯性條件下，F2群體中分離比例為3:1,而BC1和DH群體中分離比例仍為1:1。檢驗DNA標記的分離是否偏離孟德爾比例，一般采用72檢驗。只有當待檢驗的兩個基因座各自的分離比例正常時，才可進行這兩個座位的連鎖分析。在DNA標記連鎖圖譜的制作過程中，常常會遇到大量DNA標記偏離孟德爾分離比例的異常分離現象，這種異常分離在遠緣雜交組合的分離群體及DH和RI群體中尤為明顯。目前在水稻中已發現了十余個與異常分離有關的基因座位，這些基因

20、座位可能影響配子生活力和競爭力，導致配子選擇，從而產生異常分離。異常分離會使連鎖的檢驗受到影響，一些本來不存在連鎖的標記由于各自的異常分離，可能誤導得出連鎖的結論，而另一些本來連鎖著的標記也有可能由于異常分離而無法檢測到連鎖。發生嚴重異常分離的標記一般不應用于連鎖作圖。將分離比的檢驗與連鎖檢驗相結合，是實際分析過程中解決異常分離的常用方法。兩個連鎖座位不同基因型出現的頻率是估算重組值的基礎。在一般的遺傳學教材中，重組值的估計是根據分離群體中重組型個體占總個體的比例來估計的。這種估計方法無法得到估計值的標準誤，因而無法對估值進行顯著性檢驗和置信區間估計。采用最大似然法進行重組率的估計可解決這一問

21、題。最大似然法以滿足其估計值在觀察結果中出現的概率最大為條件。在人類遺傳學研究中，由于通常不知道父母的基因型或父母中標記基因的連鎖相是相斥還是相引，因而無法簡單地通過計算重組體出現的頻率來進行連鎖分析，而必須通過適當的統計模型來估算重組率，并采用似然比檢驗的方法來推斷連鎖是否存在，即比較假設兩座位間存在連鎖(r3;而要否定連鎖的存在，則要求似然比小于100:1,即LOD2。在其它生物遺傳圖譜的構建中，似然比的概念也用來反映重組率估值的可靠性程度或作為連鎖是否真實存在的一種判斷尺度。(二)多點測驗兩點測驗是最簡單，也是最常用的連鎖分析方法。然而，在構建分子標記連鎖圖中，每條染色體都涉及到許多標記

22、座位。遺傳作圖的目的就是要確定這些標記座位在染色體上的正確排列順序及彼此間的遺傳圖距。所以，這里涉及到一個同時分析多個基因座之間連鎖關系的問題。這個問題看似簡單，其實挺復雜，因為對于m個連鎖座位，就有m!/2種可能的排列順序。例如，若m=10,則共有1,814,400種可能。要從這么多種可能中挑選出正確的順序，確實沒那么容易。這項工作用兩點測驗方法是難以完成的，因為它每次只能分析兩個座位間的連鎖關系。由于兩點測驗估得的重組率存在誤差，因此，根據比較不同座位之間重組率大小來確定座位的排列順序是不可靠的，很可能存在錯誤。為了解決這個問題，就必須同時對多個座位進行聯合分析，利用多個座位間的共分離信息

23、來確定它們的排列順序，也就是進行多點測驗。在事先未知各基因座位于哪條染色體的情況下，可先進行兩點測驗，根據兩點測驗的結果，將那些基因座分成不同的連鎖群，然后再對各連鎖群（染色體）上的座位進行多點連鎖分析。與兩點測驗一樣，多點測驗通常也采用似然比檢驗法。先對各種可能的基因排列順序進行最大似然估計，然后通過似然比檢驗確定出可能性最大的順序。在每次多點測驗中，不能包含太多的座位，否則可能的排列數會非常大，即使使用高速的計算機，也要花費很長的時間。在一條染色體上，經過多次多點測驗，就能確定出最佳的基因排列順序，并估計出相鄰基因間的遺傳圖距，從而構建出相應的連鎖圖。對于在兩點測驗中沒能歸類到某個連鎖群（

24、染色體）的基因座，可在各連鎖群的連鎖圖初步建成之后，再嘗試定位到某個連鎖群上。但在構建分子標記連鎖圖的實際研究中，往往總有一些標記無法定位到染色體上。造成這種現象的原因，主要可能是在測定標記基因型時存在錯誤。（三）交換干擾與作圖函數隨著間距的增加，兩個基因座之間便可能在兩處同時發生遺傳物質的交換，即雙交換。在染色體某區段上發生的雙交換，其實際頻率往往少于由單交換概率相乘所估得的理論值。這是因為一個位置上所發生的交換會減少其周圍另一個單交換的發生，這種現象稱為交叉干擾。干擾的程度可用符合系數C表示，符合系數C為實際雙交換值與理論雙交換值的比值。理論雙交換值是指兩個相鄰的單交換同時獨立發生的概率。

25、實際雙交換C=理論雙交換值實際雙交換r心C的值變動于01之其中1和2分別為兩個相鄰染色體區段發生單交換的概率。符合系數間。當C=0時，表示完全干擾，沒有雙交換發生；當C=1時，表示沒有干擾，兩單交換獨立發生。一般而言，兩單交換的位置相距越遠，則彼此干擾的程度就越低，符合系數就越大。要計算兩個相距較遠的基因座之間的圖距時，如果中間沒有其它基因座可利用，則兩個基因座之間實際發生的雙交換就不能被鑒別出來，因此，采用一些數學方法進行矯正是必要的，否則，從重組率估計出的圖距就會比真實圖距小。這種矯正可通過作圖函數來實現。在C=1的假定下，圖距x與重組率r之間的關系服從Haldane作圖函數：x=-(1/

26、2)In(1-2r)其中x以M為單位。這里M讀作Morgan（摩爾根），它是用著名遺傳學家摩爾根的姓命名的，并取第一個字母表示。1M=100cM（厘摩），1cM為一個遺傳單位，即1%的重組率。根據Haldane作圖函數，20%的重組率相當于圖距為-（1/2）In（1-2X0.20）=0.255M,即25.5cM。Haldane作圖函數的不合理之處在于假定了完全沒有交叉干擾。為了將交叉干擾的因素考慮進去，一種比較合理的假設是，雙交換符合系數與重組率之間存在線性關系，即C=2r。該式表示，C值隨r的增加而增加，干擾相應減弱。當r=0.5（即沒有連鎖）時，C=1（即沒有干擾）。根據這一假設推導出了如

27、下作圖函數（Kosambi作圖函數）：1+2rx=（1/4）ln不彳根據上式可以算出，當r=0.2時，x=21.2cM。可見Kosambi作圖函數算出的圖距比Haldane作圖函數的小。由于Kosambi作圖函數比Haldane作圖函數更合理，因此它在遺傳學研究中得到了更廣泛的應用。第三節DNA標記分離數據的數學處理一、分離數據的收集與數字化DNA多態性信息，是進行遺從分離群體中收集分子標記的分離數據，獲得不同個體的傳連鎖分析的第一步。通常各種DNA標記基因型的表現形式是電泳帶型，將電泳帶型數字化是DNA標記分離數據進行數學處理的關鍵。下面以RFLP為例來說明將DNA標記帶型數字化的方法。假設

28、某個RFLP座位在兩個親本（Pi,P2）中各顯示一條帶，由于RFLP是共顯性的，則Fi個體中將表現出兩條帶，而F2群體中不同個體的帶型有三種，即Pi型、P2型和Fi（雜合體）型。可以根據習慣或研究人員的喜好，任意選擇一組數字或符號，來記錄F2個體的帶型。例如，將Pi帶型記為1,P2帶型記為3,Fi帶型記為2。如果帶型模糊不清或由于其它原因使數據缺失，則可記為0。假設全部試驗共有i20個F2單株，本測了i00個RFLP標記，這樣可彳#到一個由i00（行）Xi20（列）的、由簡單數字組成的RFLP數據矩陣。進彳TDNA標記帶型數字化的基本原則是，必須區分所有可能的類型和情況，并賦與相應的數字或符號

29、。比如在上例中，總共有4種類型，即Pi型、Fi型、P2型和缺失數據，故可用4個數字i、2、3和0分別表示之。如果存在顯性標記，則F2中還會出現兩種情況。一種是Pi對P2顯性，于是Pi型和Fi型無法區分，這時應將Pi型和Fi型作為一種類型，記為4。另一種情況正好相反，P2對Pi顯性，無法區分P2型和Fi型，故應將它們合為一種類型，記為5。對于BCi、DH和RI群體，每個分離的基因座都只有兩種基因型，不論是共顯性標記還是顯性標記，兩種基因型都可以識別，加上缺失數據的情況，總共只有3種類型。因而用3個數字就可以將標記全部帶型數字化。在分析質量性狀基因與遺傳標記之間的連鎖關系時，也必須將有關的表型數字

30、化，其方法與標記帶型的數字化相似。例如，假設在DH群體中，有一個主基因控制株高，那么就可以將株系按植株的高度分為高稈和矮稈兩大類，然后根據親本的表現分別給高稈和矮稈株系賦值，如i和2。將質量性狀經過這樣的數字化處理，就可以與DNA標記數據放在一起進行連鎖分析。DNA標記數據的收集和處理應注意以下問題：（i）應避免利用沒有把握的數據。由于分子多態性分析涉及許多實驗步驟，很難避免出現錯誤，經常會遇到所得試驗結果（如X-光片）不清楚等問題。如果硬性地利用這樣沒有把握的數據，不僅會嚴重影響該標記自身的定位，而且還會影響到其它標記的定位。因此，應刪除沒有把握的數據，寧可將其作為缺失數據處理，或重做試驗。

31、（2）應注意親本基因型，對親本基因型的賦值（如Pi型為i,P2型為2）,在所有的標記座位上必須統一，千萬別混淆。如果已知某兩個座位是連鎖的，而所得結果表明二者是獨立分配的，這就有可能是把親本類型弄錯引起的。（3）當兩親本出現多條帶的差異時，應通過共分離分析鑒別這些帶是屬于同一座位還是分別屬于不同座位。如屬于不同座位，應逐帶記錄分離數據。二、遺傳圖距與物理距離對應關系的估計不同生物的1cM圖距所對應的實際物理距離（堿基對數量）存在很大差異。一般而言，生物越低等或越簡單，1cM圖距平均對應的堿基對數量就越少（表3.1）。表3.1中給出的各種生物中遺傳圖距與物理距離之間的對應關系只是一個大約的平均值

32、，實際上它變化很大。在一條染色體上，由于不同區域上發生交換的頻率存在差異，因而遺傳圖距與物理距離之間的對應關系可以有很大的變化。例如，在著絲粒附近，染色體交換受到抑制，因而所估計的遺傳圖距小于平均對應的物理距離。在同一種生物中，兩個特定基因座之間的遺傳圖距會因遺傳背景的不同而改變，甚至有時由同一對親本所產生的遺傳背景相同的不同群體間也存在很大差異。表3.1不同生物中單位圖距所相當的平均物理距離物種基因組大小（kb）遺傳圖距（cM）kb/cM嗜菌體T41.6X1028000.2大腸桿菌4.2X1031,7502.4酵母2.0X1044,2004.8真菌2.7X1041,00027.0線蟲8.0X

33、104320250.0果蠅1.4X105280500.0水稻4.5X1051,500300.0小鼠3.0X1061,7001,800.03.3X1063,3001,000.02.5X1062,5001,000.0、構建DNA標記圖譜的計算機軟件遺傳圖譜的構建需要對大量標記之間的連鎖關系進行統計分析。隨著標記數目的增加，計算工作量常常呈指數形式增加，這是手工無法完成的。因此，必須借助計算機進行分析和處理。許多學者為構建遺傳圖譜設計了專用程序包，通過Internet網址/soft/list.html可以獲得各種專用程序的相關信息，如軟件的名

34、稱及簡要介紹，源程序編碼語言、支持的操作系統、執行程序的名稱、參考文獻以及獲取軟件的網址等。應用于植物遺傳連鎖分析和遺傳圖譜構建的常用軟件有LINKAGE、MAPMAKER/EXP等。LINKAGE軟件可通過/software/linkage獲得，該軟件是利用最大似然法估計兩座位或多座位間的重組率和LOD值；MAPMAKER/EXP可通過/distri-bution/software/mapmaker3獲得，該軟件可以應用于各種類型的實驗群體進行遺傳作圖，是目前應用最為廣泛的作圖軟件之一

35、。第四節DNA標記連鎖圖譜的完善、DNA標記連鎖群的染色體定位把分子標記所建立的連鎖群與經典遺傳圖譜聯系起來，并將其歸屬到相應的染色體上，是構建了一個比較飽和的分子圖譜之后十分重要的工作。通常根據分子標記與已知染色體位置的形態標記的連鎖關系來確定分子標記連鎖群屬于哪條染色體。還可以利用非整倍體或染色體結構變異材料，如水稻中利用三體、玉米中利用A/B易位系、小麥中利用缺體/四體染色體代換系等，將分子標記連鎖群歸屬到相應的染色體上。以水稻為例，目前已獲得全套12條染色體的初級三體（2n+1）。在水稻某種三體中，由于三體染色體有一式3份，其DNA含量為其它11條染色體的1.5倍。在DNA定量相當準確

36、的條件下，用已知能檢測某一連鎖群的探針分別與12種三體的總DNA雜交。根據劑量效應，雜交強弱與同源序列的含量成正比，雜交后對應三體的DNA濾膜放射自顯影顯帶強度將明顯高于其它11種，由此可以判定該標記所對應的序列就在該三體染色體上。隨著技術的進步,原位分子雜交的靈敏度已可以揭示單拷貝序列的雜交位點,因此采用原位分子雜交可以容易地將連鎖群的分子標記定位到染色體上。要得到一個完整的遺傳圖譜，必須知道染色體上的標記與著絲粒之間的距離。一個完整的染色體具有以下幾個主要部分：著絲粒、縊痕、隨體及端粒，這些基本結構在生物染色體的運動與復制等方面起著重要的作用，其結構也是遺傳圖譜制作中不可忽視的重要部分。由

37、于著絲粒并不是一個基因，不能從表型測知，因此采用常規的兩點、三點乃至多點分析方法是無法確定標記與著絲粒之間的關系的。在經典遺傳圖譜的構建中，一般采用近端著絲粒染色體來對基因與著絲之間的距離進行定位。近端著絲粒染色體是正常染色體在著絲粒附近斷裂形成的異常染色體。目前已獲得小麥全部42條染色體的近端著絲粒染色體。利用染色體易位材料也可以判斷著絲粒在染色體上的位置。一般易位點和著絲粒所在部分的交換被抑制，因而推算位于著絲粒兩旁的易位點與標記基因間的重組率時一般都偏小。利用這個現象可以推算連鎖圖上著絲粒的位置。在細胞學上，利用已知易位點的易位系統進行基因分析也可知道著絲粒的位置。早在1945年，在玉米

38、中就利用易位分析的結果推測了全部染色體的著絲粒位置。染色體上的端粒是指染色體的自然末端。在遺傳圖譜的構建中，端粒位置的確定就意味著為染色體的全長設定界標。傳統的凝膠電泳方法由于分辨能力有限，大多數情況下無法將具有多態性的端粒片段區分開來。一般要借助具有高分辨率的脈沖場凝膠電泳(PFGE)才能將有差異的端粒片段分離開來。利用PFGE與切割位點稀少的限制性酶相結合，Wu和Tanksley(1993)研究了水稻端粒結構的特征，采用來自擬南芥的端粒探針，將三個水稻的端粒DNA電泳條帶分別定位在第8、9、11染色體上，并證實了多態性的端粒片段不僅在遺傳上而且在物理上與遺傳圖譜上最遠端的RFLP標記相連鎖

39、。目前，在日本水稻基因組研究計劃所構建的包含2275個標記的水稻分子連鎖圖中，除第9染色體之外，其余11條染色體的著絲粒(區)都已定位(Harushimaetal.1998)。另外，該圖中的第5染色體短臂、第11染色體兩臂以及第12染色體短臂的端粒也已定位。二、飽和DNA標記連鎖圖的制作一個遺傳圖譜飽和度是指單位長度染色體上已定位的標記數或標記在染色體上的密度。20cM。如果構建連鎖基本的染色體連鎖框架圖大概要求在染色體上的標記平均間隔不大于圖譜的目的是為了進行主基因的定位，其平均間隔要求在1020cM或更小。用于QTL定位的連鎖圖，其標記的平均間隔要求在10cM以下。如果構建的連鎖圖譜是為了

40、進行基因克隆，則要求目標區域標記的平均間隔在1cM以下。不同生物基因組大小有極大差異，因此滿足上述要求所需的標記數是不同的。以人類和水稻為例，它們的基因組全長分別為3.3X106kb和4.5X105kb,如果構建一個平均圖距為0.5cM的分子圖譜，則所要定位的標記數就要分別達到6600和3000個。幾種生物不同圖譜飽和度下所需定位的標記數如表3.2所示。表3.2遺傳圖譜達到特定飽和度所需的標記數生物人類水稻玉米擬南芥番茄基因組(kb)3.3X1064.5X1052.5X106_47.0義107.1X105大小(cM)3300150025005001500kb/cM100030010001404

41、73圖20cM165751252575譜10cM33015025050150飽5cM660300500100300和1cM3300150025005001500度0.5cM66003000500010003000Tanksley等(1988)以假設擁有12條染色體，每條長100cM,全長1200cM的生物為例，研究了所需標記數與圖譜飽和度之間的關系，發現影響所需標記數的主要因素有兩個。一個是標記間的平均距離，即圖譜總長度除以定位的標記數，它反映了標記圖譜的平均密度。對于染色體全長1200cM的生物，如果定位了120個標記，則標記間的平均距離為10cM。另一個因素是標記間的最大距離。標記在基因組

42、上的分布是不均勻的。即使在一張平均密度很高的圖譜上，仍然可能存在較大的間隙區。例如，據理論推算，如果用于作圖的標記是隨機選擇的，則當標記平均距離為1cM時，仍有可能存在10cM的間距。而若要將最大可能間距從10cM減小到5cM,則需要另外增加1000個標記。因此，通過提高圖譜平均密度的方法來縮小最大標記間距是很困難的。在實際研究中，為了填補間隙，應有針對性地在間隙區上尋找標記，或尋找該間隙所在區域上有差異的親本構建作圖群體。沒有一種標記在基因組中分布是完全隨機的。如著絲粒區通常以重復序列為主，因而以單拷貝克隆為探針的RFLP標記就不可能不覆蓋這些染色體區域。從這一點考慮，利用特性上互補的不同DNA標記進行遺傳作圖，將有助于提高遺傳圖譜的飽和度。三、DNA標記連鎖圖與經典遺傳連鎖圖的整合從1987年報道玉米和番茄的RFLP遺傳圖譜以來，具有重要經濟價值的栽培植物幾乎都已構建了以RFLP為主的DNA標記遺傳圖