1、軍團軍團菌及其檢測技術菌及其檢測技術武漢市疾病預防控制中心武漢市疾病預防控制中心微生物檢驗科微生物檢驗科趙瀅趙瀅 博士博士EMAIL：2014年年11月月武漢市疾病預防控制中心武漢市疾病預防控制中心微生物檢驗科微生物檢驗科軍團菌的發(fā)現(xiàn)l 1976年7月在美國費城，參加退伍軍人大會的人員中爆發(fā)了一種癥狀相同，原因不明的細菌性肺炎， 有221人感染疾病，其中死亡34人。l 初步的流行病學分析顯示，致病的微生物可能通過空氣傳播，采集標本，分離病原體l 革蘭氏陰性桿菌嗜肺軍團菌（L. pneumophila ）l 軍團菌病 (已知的首次爆發(fā))武漢市疾病預防控制中心武漢市疾病預防控制中心微生物檢驗科微生

2、物檢驗科Part I：軍團菌及軍團菌病武漢市疾病預防控制中心武漢市疾病預防控制中心微生物檢驗科微生物檢驗科軍團菌軍團菌革蘭陰性桿菌革蘭陰性桿菌, ,淺紅色的短桿菌，直徑淺紅色的短桿菌，直徑0.30.30.5m0.5m，長約，長約1.21.25m5m或更長，或更長，菌體一端有鞭毛菌體一端有鞭毛. .在含在含L L- -半胱氨酸和焦磷酸鐵的半胱氨酸和焦磷酸鐵的BCYEBCYE瓊瓊脂培養(yǎng)基上生長，通常需要在脂培養(yǎng)基上生長，通常需要在3737 5%5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱培養(yǎng)培養(yǎng)2-102-10天。天。生長形成的菌落一般呈白色，也可能生長形成的菌落一般呈白色，也可能會從紫色變?yōu)樗{色，或是灰綠色。會從紫色

3、變?yōu)樗{色，或是灰綠色。初步在初步在BCYEBCYE瓊脂培養(yǎng)基上生長的菌落為瓊脂培養(yǎng)基上生長的菌落為刻花玻璃樣，具有多型性刻花玻璃樣，具有多型性. .武漢市疾病預防控制中心武漢市疾病預防控制中心微生物檢驗科微生物檢驗科軍團菌科、屬、種、血清型軍團菌科、屬、種、血清型u軍團菌科軍團菌科 ( (LegionellaceaeLegionellaceae ）LegionellaLegionella / / FluoribacterFluoribacter bozemaniibozemanii / / TatlockiaTatlockia micdadeimicdadei u軍團菌屬：軍團菌屬：16s 1

4、6s rRNArRNA分析表明，在蛋白細菌系分析表明，在蛋白細菌系亞群中，亞群中，軍團菌科只有一個軍團菌亞群。與引起軍團菌科只有一個軍團菌亞群。與引起Q Q熱病的熱病的coxiellacoxiella burnetiburneti( (貝氏克斯體）親緣關系最近，二者具有同樣的細貝氏克斯體）親緣關系最近，二者具有同樣的細胞內(nèi)生活方式，可以利用共同的基因感染宿主細胞。胞內(nèi)生活方式，可以利用共同的基因感染宿主細胞。u軍團菌種軍團菌種：現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)：現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)5050個種（個種（speciesspecies），），7070多個血清型多個血清型（serogroupsserogroups) )，至少有，至少有2

5、020個種可引起人感染。個種可引起人感染。 武漢市疾病預防控制中心武漢市疾病預防控制中心微生物檢驗科微生物檢驗科種名發(fā)現(xiàn)時間 種名發(fā)現(xiàn)時間 種名發(fā)現(xiàn)時間 Legionella pneumophila1979Legionella maceachernii 1985Legionella geestiana 1993Legionella bozemanae 1980Legionella parisiensis 1985Legionella londiniensis 1993Legionella dumoffii 1980Legionella rubrilucens 1985Legionella na

6、utarum 1993Legionella gormanii 1980Legionella santicrucis 1985Legionella quateirensis 1993Legionella micdadei 1980Legionella spiritensis 1985Legionella worsleiensis 1993Legionella pittsburghensis 1980Legionella steigerwaltii 1985Legionella lansingensis 1994Legionella jordanis 1982Legionella israelen

7、sis 1986Legionella lytica 1996Legionella longbeachae 1982Legionella birminghamensis1988Legionella waltersii 1996Legionella oakridgensis 1983Legionella brunensis 1989Legionella taurinensis 1999Legionella wadsworthii 1983Legionella cincinnatiensis1989Legionella beliardensis 2001Legionella feeleii 1984

8、Legionella moravica 1989Legionella drozanskii 2001Legionella sainthelensi 1984Legionella quinlivanii 1990Legionella fallonii 2001Legionella anisa 1985Legionella tucsonensis 1990Legionella gresilensis 2001Legionella cherrii 1985Legionella adelaidensis 1991Legionella rowbothamii 2001Legionella erythra

9、 1985Legionella fairfieldensis 1991Legionella busanensis 2003Legionella hackeliae 1985Legionella gratiana 1991Legionella drancourtii 2004Legionella jamestowniensis1985Legionella shakespearei 1992軍團菌種軍團菌種武漢市疾病預防控制中心武漢市疾病預防控制中心微生物檢驗科微生物檢驗科軍團菌病軍團菌病武漢市疾病預防控制中心武漢市疾病預防控制中心微生物檢驗科微生物檢驗科Part II：樣本的采集與運輸武漢市疾病

10、預防控制中心武漢市疾病預防控制中心微生物檢驗科微生物檢驗科哪些環(huán)境中存在軍團菌？武漢市疾病預防控制中心武漢市疾病預防控制中心微生物檢驗科微生物檢驗科標本的種類標本的種類u 環(huán)境水標本環(huán)境水標本：空調(diào)冷卻塔水、冷凝水：空調(diào)冷卻塔水、冷凝水, ,溫泉水溫泉水, ,淋浴水淋浴水, , 加濕器水；加濕器水；u 病人組織標本病人組織標本: :如痰如痰, ,支氣管灌洗液支氣管灌洗液, ,胸水胸水, ,血液等標本血液等標本。武漢市疾病預防控制中心武漢市疾病預防控制中心微生物檢驗科微生物檢驗科環(huán)境標本采集原則 最初最初流出的水標本：打開水龍頭或裝置后立即采集水流出的水標本：打開水龍頭或裝置后立即采集水樣，該水

11、樣即樣，該水樣即代表代表設備設備內(nèi)的水內(nèi)的水。 過后流出的水標本：最初流出的水標本收集以后，讓過后流出的水標本：最初流出的水標本收集以后，讓設備內(nèi)的水流掉設備內(nèi)的水流掉后再后再采集水樣。此水代表采集水樣。此水代表供給設備的供給設備的水水。武漢市疾病預防控制中心武漢市疾病預防控制中心微生物檢驗科微生物檢驗科環(huán)境標本采集 有有殺生物劑時的采樣：水樣中含有氯或其它氧化性殺殺生物劑時的采樣：水樣中含有氯或其它氧化性殺生物劑時，向生物劑時，向采樣瓶采樣瓶中添加適量硫代硫酸鉀使其滅活。中添加適量硫代硫酸鉀使其滅活。對于其它的生物劑，加入普通的對于其它的生物劑，加入普通的中性中性試劑是無效的。試劑是無效的。

12、 注意：樣本采集到濃縮，以及樣本采集到濃縮培養(yǎng)的注意：樣本采集到濃縮，以及樣本采集到濃縮培養(yǎng)的間隔時間控制在間隔時間控制在14天天以內(nèi)。樣本的來源，數(shù)量，有無以內(nèi)。樣本的來源，數(shù)量，有無殺蟲劑都要登記，并同標本一起送殺蟲劑都要登記，并同標本一起送到實驗室到實驗室。不知來。不知來源或不知道處理過程的水標本是不予進行試驗的。源或不知道處理過程的水標本是不予進行試驗的。武漢市疾病預防控制中心武漢市疾病預防控制中心微生物檢驗科微生物檢驗科常見幾種系統(tǒng)采集部位冷水冷水系統(tǒng)的采集：系統(tǒng)的采集：進水系統(tǒng)進水系統(tǒng)蓄水池蓄水池與每個蓄水池相連的下水道的排出口與每個蓄水池相連的下水道的排出口蓄水池最遠的下水道的排

13、出口蓄水池最遠的下水道的排出口 對對每一個裝置來說，收集每一個裝置來說，收集500ML最初流出的水標本，讓水持續(xù)最初流出的水標本，讓水持續(xù)流，并流，并在流水在流水中放一只溫度計，待溫度穩(wěn)定后，收集中放一只溫度計，待溫度穩(wěn)定后，收集500ML過過后流出的水標本。后流出的水標本。武漢市疾病預防控制中心武漢市疾病預防控制中心微生物檢驗科微生物檢驗科熱水系統(tǒng)熱水系統(tǒng)加熱器的排出口：選用保護性的橡膠手套和其它的保護性裝備加熱器的排出口：選用保護性的橡膠手套和其它的保護性裝備關掉離加熱器最近的冷水系統(tǒng)。關掉離加熱器最近的冷水系統(tǒng)。避免冷熱水混合避免冷熱水混合加熱器的排水口可用火焰或酒精棉球消毒干燥加熱器的

14、排水口可用火焰或酒精棉球消毒干燥排水口連接一根干凈的硅膠管排水口連接一根干凈的硅膠管 采樣方式采樣方式：打開開關采集最初流出的水標本。讓水排掉至溫度：打開開關采集最初流出的水標本。讓水排掉至溫度穩(wěn)定為止穩(wěn)定為止。再。再采一份過后流出的標本，并關閉開關采一份過后流出的標本，并關閉開關武漢市疾病預防控制中心武漢市疾病預防控制中心微生物檢驗科微生物檢驗科淋浴器 收集收集最初流出的水標本最初流出的水標本 如果淋浴器有一個大的蓮蓬頭式噴嘴，用一個干凈的如果淋浴器有一個大的蓮蓬頭式噴嘴，用一個干凈的未用過的塑料袋未用過的塑料袋，該，該裝置包裹起來，切掉一個角，將裝置包裹起來，切掉一個角，將該切口處置于接取

15、標本容器的開口處該切口處置于接取標本容器的開口處武漢市疾病預防控制中心武漢市疾病預防控制中心微生物檢驗科微生物檢驗科冷卻塔警告警告：為安全起見，采樣前，負責供水系統(tǒng)的工作人員應關掉：為安全起見，采樣前，負責供水系統(tǒng)的工作人員應關掉冷卻塔的鼓風機。戴冷卻塔的鼓風機。戴一副一副齊肘的橡膠手套，從池內(nèi)舀水，由于齊肘的橡膠手套，從池內(nèi)舀水，由于機器繼續(xù)運行而不能關閉冷卻塔時，則需要機器繼續(xù)運行而不能關閉冷卻塔時，則需要采樣采樣人員做出專門人員做出專門的安排，這種情況下，應佩戴安全護目鏡和呼吸道防護裝備。的安排，這種情況下，應佩戴安全護目鏡和呼吸道防護裝備。在塔的入口處采樣：將干凈的硅膠管插入瓶內(nèi)，通過

16、虹吸作用在塔的入口處采樣：將干凈的硅膠管插入瓶內(nèi)，通過虹吸作用吸取頂部蓄水池的水吸取頂部蓄水池的水。先。先用水充滿管子并夾住其一端，以防止用水充滿管子并夾住其一端，以防止管子空了。管的一端放在蓄水池里，另一端管子空了。管的一端放在蓄水池里，另一端放在放在采樣瓶里，使采樣瓶里，使瓶內(nèi)管的一端低于蓄水池管的一端。松開夾子，水開始流出，瓶內(nèi)管的一端低于蓄水池管的一端。松開夾子，水開始流出，取夠取夠所需所需的量，停止虹吸，將管從蓄水池內(nèi)取出。的量，停止虹吸，將管從蓄水池內(nèi)取出。武漢市疾病預防控制中心武漢市疾病預防控制中心微生物檢驗科微生物檢驗科 進水口遠處采集池塘內(nèi)的水：用勺子采取冷卻塔，池進水口遠處

17、采集池塘內(nèi)的水：用勺子采取冷卻塔，池塘表淺部位的粘塘表淺部位的粘泥（泥（深度深度20cm)，用虹吸管采取池，用虹吸管采取池子深處的粘泥。采集位于該系統(tǒng)內(nèi)子深處的粘泥。采集位于該系統(tǒng)內(nèi)濾器的濾器的水，沉淀物，水，沉淀物，碎礫等。碎礫等。 注意：所需樣品的數(shù)量取決于該系統(tǒng)內(nèi)的大小和地理注意：所需樣品的數(shù)量取決于該系統(tǒng)內(nèi)的大小和地理位置。如果位置。如果蓄水池和蓄水池和水塔之間的管道短，那么只需采水塔之間的管道短，那么只需采集一份標本。集一份標本。武漢市疾病預防控制中心武漢市疾病預防控制中心微生物檢驗科微生物檢驗科標本的運輸和相關生物安全要求標本的運輸和相關生物安全要求u在周圍環(huán)境溫度下運送水樣標本在

18、周圍環(huán)境溫度下運送水樣標本, ,不必冷凍不必冷凍, ,但要防止但要防止受熱和陽光受熱和陽光, ,標本要盡可能快或最好在兩天內(nèi)送到實標本要盡可能快或最好在兩天內(nèi)送到實驗室驗室, ,室溫下室溫下(21(21+ +3)3)貯藏在實驗室或其他地方。貯藏在實驗室或其他地方。u對于臨床標本，最好立即做預期實驗，如不能馬上進對于臨床標本，最好立即做預期實驗，如不能馬上進行，應放在行，應放在-20-20凍存?zhèn)溆脙龃鎮(zhèn)溆谩Ｎ錆h市疾病預防控制中心武漢市疾病預防控制中心微生物檢驗科微生物檢驗科軍團菌操作生物安全性軍團菌操作生物安全性u應用的試劑須符合有毒物質(zhì)操作要求和相關規(guī)定。應用的試劑須符合有毒物質(zhì)操作要求和相關

19、規(guī)定。u生物安全生物安全級實驗室，最好在安全柜中操作。級實驗室，最好在安全柜中操作。u操作人員培訓。操作人員培訓。u菌種保存。菌種保存。武漢市疾病預防控制中心武漢市疾病預防控制中心微生物檢驗科微生物檢驗科可感染人類的高致病性病原微生物菌（毒）可感染人類的高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本運輸管理規(guī)定種或樣本運輸管理規(guī)定病原菌名稱病原菌名稱危害程度危害程度分類分類實驗活動所需生物安全實驗室級別實驗活動所需生物安全實驗室級別運輸包裝分類運輸包裝分類學名學名中文名中文名大量活菌大量活菌操作操作動物感動物感染實驗染實驗樣本樣本檢測檢測非感染性非感染性材料實驗材料實驗A/BUN 編編號號Legionel

20、la pneumophila嗜肺軍團嗜肺軍團菌菌第三類第三類BSL-2ABSL-2BSL-2BSL-1BUN 3373武漢市疾病預防控制中心武漢市疾病預防控制中心微生物檢驗科微生物檢驗科Part III：軍團菌的分離與檢測武漢市疾病預防控制中心武漢市疾病預防控制中心微生物檢驗科微生物檢驗科水樣標本中軍團菌的分離方法水樣標本中軍團菌的分離方法檢測依據(jù)檢測依據(jù): 公共場所集中空調(diào)通風公共場所集中空調(diào)通風系統(tǒng)衛(wèi)系統(tǒng)衛(wèi)生生規(guī)范規(guī)范中的集中空調(diào)通風系中的集中空調(diào)通風系統(tǒng)冷卻水、冷凝水中嗜肺軍團統(tǒng)冷卻水、冷凝水中嗜肺軍團菌的檢驗方法見菌的檢驗方法見附錄附錄B B。 適用于各種環(huán)境標本軍團菌檢適用于各種環(huán)境

21、標本軍團菌檢測測 ，包括：，包括： 飲用水、工業(yè)用飲用水、工業(yè)用水、天然水以及一些如沉積物、水、天然水以及一些如沉積物、沉淀物、軟泥等物質(zhì)。沉淀物、軟泥等物質(zhì)。武漢市疾病預防控制中心武漢市疾病預防控制中心微生物檢驗科微生物檢驗科標本肺組織、支氣管灌洗液、血液、痰、胸水、胸腔引流物水樣血清水樣處理與制備血清學檢測方法：*間接熒光抗體染色法*試管凝集試驗*ELISA法接種軍團菌BCYE培養(yǎng)基接種軍團菌選擇性GVPC培養(yǎng)基37，5%CO2，培養(yǎng)3-14天挑可疑菌落革蘭氏染色涂片鏡檢37,5%CO2,培養(yǎng)3-14天革蘭氏染色陰性桿菌革蘭氏染色陽性桿菌 純培養(yǎng) 棄去 確認試驗 血清玻片凝集試驗 PCR檢

22、測 生化試驗 尿液抗原檢測武漢市疾病預防控制中心武漢市疾病預防控制中心微生物檢驗科微生物檢驗科軍團菌水質(zhì)檢測概括軍團菌水質(zhì)檢測概括1.采樣采樣2.濃縮濃縮3.培養(yǎng)培養(yǎng)4.分離分離5.鑒定鑒定武漢市疾病預防控制中心武漢市疾病預防控制中心微生物檢驗科微生物檢驗科實驗所需儀器設備90mm平皿平皿3537孵箱孵箱濾器（大的不銹鋼制成的濾器）濾器（大的不銹鋼制成的濾器）正壓膜蠕動過濾泵：流速可調(diào)。正壓膜蠕動過濾泵：流速可調(diào)。3升升/分鐘分鐘注意：樣本量少，也可用真空輔助的濾過系統(tǒng)代替注意：樣本量少，也可用真空輔助的濾過系統(tǒng)代替膜濾器：膜濾器：0.22um或或0.45um水浴鍋：水浴鍋：離心機：離心機：渦

23、旋振蕩器：渦旋振蕩器：顯微鏡：顯微鏡：武漢市疾病預防控制中心武漢市疾病預防控制中心微生物檢驗科微生物檢驗科軍團菌檢測所需準備基本試軍團菌檢測所需準備基本試劑劑1.1.培養(yǎng)基（培養(yǎng)基（GVPCGVPC，BCYE,BCYE-CYS)BCYE,BCYE-CYS)2.2.試劑試劑 ( (生化試劑、甲醛的鹽溶液）生化試劑、甲醛的鹽溶液）3.3.酸緩沖液（酸緩沖液（0.2mol/L KCL-HCL)，堿緩沖液，堿緩沖液（0.03mol/L KOH）4.4.血清學試劑血清學試劑武漢市疾病預防控制中心武漢市疾病預防控制中心微生物檢驗科微生物檢驗科培養(yǎng)檢測所需準備材料培養(yǎng)檢測所需準備材料1.1.直徑大約為直徑大

24、約為90mm90mm或或100mm100mm的無菌培養(yǎng)皿的無菌培養(yǎng)皿2.2.培養(yǎng)箱，培養(yǎng)箱，COCO2 2能夠恒溫保持在（能夠恒溫保持在（36361 1）。3.3.水浴箱，能夠保持在（水浴箱，能夠保持在（50501 1）4.4.顯微鏡或熒光顯微鏡。顯微鏡或熒光顯微鏡。武漢市疾病預防控制中心武漢市疾病預防控制中心微生物檢驗科微生物檢驗科樣品采樣準備材料樣品采樣準備材料1.1. 玻璃、聚乙烯或類似的容器瓶：滅菌處理。水樣一般采集玻璃、聚乙烯或類似的容器瓶：滅菌處理。水樣一般采集為為250-500ml250-500ml，收集在容器瓶中。，收集在容器瓶中。2.2. 如果所用的容器，如聚乙烯瓶，不能高壓

25、，可用流動的熱如果所用的容器，如聚乙烯瓶，不能高壓，可用流動的熱水（不低于水（不低于7070）或蒸汽進行巴斯德氏消毒，時間不低于）或蒸汽進行巴斯德氏消毒，時間不低于5 5分鐘。分鐘。3.3. 小的無菌容器瓶：可用來收集淤泥、沉淀物或沉積物。小的無菌容器瓶：可用來收集淤泥、沉淀物或沉積物。4.4. 廣口的容器：用來收集淤泥等，要有螺絲蓋。廣口的容器：用來收集淤泥等，要有螺絲蓋。5.5. 滅菌棉拭子。滅菌棉拭子。一般建議用塑料包裝的容器一般建議用塑料包裝的容器武漢市疾病預防控制中心武漢市疾病預防控制中心微生物檢驗科微生物檢驗科軍團菌培養(yǎng)基Muller-HintonMuller-Hinton瓊脂瓊脂

26、第一次分離出嗜肺軍團菌使用的培養(yǎng)基第一次分離出嗜肺軍團菌使用的培養(yǎng)基活性炭酵母抽提物瓊脂，活性炭替代培活性炭酵母抽提物瓊脂，活性炭替代培了淀粉以去除培養(yǎng)基的毒性，并且氨基了淀粉以去除培養(yǎng)基的毒性，并且氨基酸也逐漸被酵母抽提物替代酸也逐漸被酵母抽提物替代CYECYE瓊脂瓊脂CYECYE瓊脂加入瓊脂加入-酮戊二酸酮戊二酸BCYEBCYE瓊脂瓊脂BCYEBCYE瓊脂中含有選擇性抗生素瓊脂中含有選擇性抗生素GVPCGVPC瓊脂瓊脂武漢市疾病預防控制中心武漢市疾病預防控制中心微生物檢驗科微生物檢驗科軍團菌培養(yǎng)基武漢市疾病預防控制中心武漢市疾病預防控制中心微生物檢驗科微生物檢驗科軍團菌分離培養(yǎng)用BCYEB

27、CYE培養(yǎng)基酵母浸出物10.0g 活性炭2.0g瓊脂17.0g 酮戊二酸1.0g蒸餾水950 mL半胱氨酸鹽酸鹽0.4g可溶的焦磷酸鐵0.25g半胱氨酸和焦磷酸鐵分別溶于10 mL蒸餾水，分別過濾（0.45 m濾器）。將剩余培養(yǎng)基成分溶于950 mL蒸餾水，高壓滅菌。水浴冷卻至50，加入上述過濾液。10 N KOH調(diào)整pH至6.9。蒸餾水補充至1L。倒培養(yǎng)基前先搖動混勻以保持碳呈懸浮狀態(tài)。每平板20ml （15100mm），斜面10ml或4ml（20150mm或13100mm）。ACES緩沖液(2 乙酰基 2 氨基乙烷磺酸) 10.0g武漢市疾病預防控制中心武漢市疾病預防控制中心微生物檢驗科微

28、生物檢驗科選擇性（GVPCGVPC）培養(yǎng)基的制備添加四種抗生素：甘氨酸3g/L（穩(wěn)定劑，防腐劑，緩沖劑）多粘菌素B（硫酸鹽）79200iu/L（抑制大腸肺克，百日咳等）萬古霉素（鹽酸鹽） 0.001g/L（金葡，化膿性鏈球菌，白喉，肺鏈，炭疽等）放線菌酮0.08g/L（殺真菌，致畸，）那他霉素也可代替之。武漢市疾病預防控制中心武漢市疾病預防控制中心微生物檢驗科微生物檢驗科抗生素的配制 多粘菌素B：200mg加入100蒸餾水中，混勻后，.uM濾器過濾除菌，以5.5量分裝到無菌瓶內(nèi)，冷凍保存。用時在室溫下孵化。 萬古霉素：20mg加入20蒸餾水中，混勻后.uM濾器過濾除菌，以ML量分裝到無菌瓶內(nèi)，

29、冷凍保存。用時在室溫下孵化。 放線菌酮：2g加入100蒸餾水中，混勻后，.uM濾器過濾除菌，以4 ML量分裝到無菌瓶內(nèi)，冷凍保存。用時在室溫下孵化。 注意：放線菌酮具有肝毒性，當處理這種粉末狀試劑時，應該帶手套和防塵口罩。武漢市疾病預防控制中心武漢市疾病預防控制中心微生物檢驗科微生物檢驗科GVPCGVPC培養(yǎng)基的制備 按上述BCYE培養(yǎng)基的方法配制完成后，冷卻至50 C時，分別添加已配制好的三種抗生素。每種取一份劑量，充分混勻后即為最終選擇性培養(yǎng)基。武漢市疾病預防控制中心武漢市疾病預防控制中心微生物檢驗科微生物檢驗科BCYE-CYSBCYE-CYS培養(yǎng)基培養(yǎng)基 為不含為不含L-L-半胱氨酸的酵

30、母浸出物、炭粉培養(yǎng)基。按照半胱氨酸的酵母浸出物、炭粉培養(yǎng)基。按照配制配制BCYEBCYE培養(yǎng)基的方法配制，不加培養(yǎng)基的方法配制，不加L-L-半胱氨酸。半胱氨酸。武漢市疾病預防控制中心武漢市疾病預防控制中心微生物檢驗科微生物檢驗科半成品培養(yǎng)基武漢市疾病預防控制中心武漢市疾病預防控制中心微生物檢驗科微生物檢驗科培養(yǎng)基的質(zhì)控注意注意：消毒過程中，加熱時間過長或溫度過高，都能影響培養(yǎng)：消毒過程中，加熱時間過長或溫度過高，都能影響培養(yǎng)基的基的營養(yǎng)質(zhì)量營養(yǎng)質(zhì)量。培養(yǎng)基成分每批間的差別（特別是。培養(yǎng)基成分每批間的差別（特別是 酮戊二酸）酮戊二酸）也能影響其效能也能影響其效能。所以。所以，檢驗各批次新配制的培

31、養(yǎng)基是十分必，檢驗各批次新配制的培養(yǎng)基是十分必要的。孵育三天，觀察其要的。孵育三天，觀察其支持支持軍團菌的能力來判斷。軍團菌的能力來判斷。選擇新鮮培養(yǎng)的選擇新鮮培養(yǎng)的LP1型參考菌株和分離到的型參考菌株和分離到的LP1菌株（勿超過菌株（勿超過10代）代）制成菌制成菌懸液，分別接種到新舊兩個批次的培養(yǎng)基上。孵育懸液，分別接種到新舊兩個批次的培養(yǎng)基上。孵育之后記錄和比較之后記錄和比較結(jié)果結(jié)果，確保其菌落形態(tài)和菌落數(shù)量是相同的。，確保其菌落形態(tài)和菌落數(shù)量是相同的。武漢市疾病預防控制中心武漢市疾病預防控制中心微生物檢驗科微生物檢驗科水樣的正壓膜過濾法水樣的正壓膜過濾法1.1. 安放濾膜；安放濾膜；2.

32、2. 過濾；過濾；3.3. 取膜；取膜；4.4. 洗膜。洗膜。武漢市疾病預防控制中心武漢市疾病預防控制中心微生物檢驗科微生物檢驗科水樣濃縮物的貯存水樣濃縮物的貯存1.1.最好對樣品立刻進行分析；最好對樣品立刻進行分析；2.2.標本于（標本于（6 62 2）儲藏最多不超過儲藏最多不超過1515天天。 對于軍團菌來說，如果儲藏于對于軍團菌來說，如果儲藏于0 066，這種損失是，這種損失是最明顯的。而且，溫度在最明顯的。而且，溫度在2020或或2020以上時，異養(yǎng)生物的以上時，異養(yǎng)生物的生長速度就會變快。生長速度就會變快。 武漢市疾病預防控制中心武漢市疾病預防控制中心微生物檢驗科微生物檢驗科兩種處理

33、方法 熱處理熱處理：將濃縮好的樣品混勻后分別取將濃縮好的樣品混勻后分別取1ml 于無菌管于無菌管中，放到中，放到50度水浴度水浴內(nèi)保溫內(nèi)保溫30分鐘；分鐘； 酸處理酸處理: 取取適量濃縮好的樣品混勻后離心，適量濃縮好的樣品混勻后離心，6000rpm10分鐘。滅菌管吸分鐘。滅菌管吸去上去上清，至原來一半的清，至原來一半的量。再次重懸混勻，加入酸緩沖液至原來的量，量。再次重懸混勻，加入酸緩沖液至原來的量，并輕并輕輕輕混勻，室溫下靜置混勻，室溫下靜置5分鐘，備用。分鐘，備用。武漢市疾病預防控制中心武漢市疾病預防控制中心微生物檢驗科微生物檢驗科選擇培養(yǎng)基的接種選擇培養(yǎng)基的接種 將將100ul濃縮好的但

34、未經(jīng)任何處理的標本接種到濃縮好的但未經(jīng)任何處理的標本接種到GVPC平板平板上，用無菌上，用無菌接種環(huán)接種環(huán)將液體均勻涂布在整個培養(yǎng)基表面。將液體均勻涂布在整個培養(yǎng)基表面。 用同樣的方法，從水浴中取出熱處理的標本，吸取用同樣的方法，從水浴中取出熱處理的標本，吸取100ul接接種到種到GVPC平板上平板上。 同樣，經(jīng)酸處理的立即接種。同樣，經(jīng)酸處理的立即接種。武漢市疾病預防控制中心武漢市疾病預防控制中心微生物檢驗科微生物檢驗科接種標本培養(yǎng)接種標本培養(yǎng)u接種過的培養(yǎng)基靜置直至接種物被完全吸收，然后將平板接種過的培養(yǎng)基靜置直至接種物被完全吸收，然后將平板倒置，在（倒置，在（36361 1）培養(yǎng)培養(yǎng)7-

35、107-10天。天。u為了保證培養(yǎng)箱內(nèi)的空氣的濕度，可以在培養(yǎng)箱內(nèi)放置一為了保證培養(yǎng)箱內(nèi)的空氣的濕度，可以在培養(yǎng)箱內(nèi)放置一個盛水的碟子。在每次觀察培養(yǎng)物時，向碟子內(nèi)注滿新鮮個盛水的碟子。在每次觀察培養(yǎng)物時，向碟子內(nèi)注滿新鮮的水（根據(jù)需要）。的水（根據(jù)需要）。u在含在含2.5-5.0% CO22.5-5.0% CO2的環(huán)境下培養(yǎng)有利于軍團菌的生長。的環(huán)境下培養(yǎng)有利于軍團菌的生長。武漢市疾病預防控制中心武漢市疾病預防控制中心微生物檢驗科微生物檢驗科平板的檢查平板的檢查 培養(yǎng)培養(yǎng)時間內(nèi)，時間內(nèi)，48小時后，每天觀察菌落生長情況。小時后，每天觀察菌落生長情況。 軍團菌菌落通常呈灰白，灰綠，紫色和藍色。

36、表面光滑，軍團菌菌落通常呈灰白，灰綠，紫色和藍色。表面光滑，邊緣整齊。邊緣整齊。一種一種的菌落（博杰曼軍團菌，高曼，杜莫夫等）的菌落（博杰曼軍團菌，高曼，杜莫夫等）能自動發(fā)出白色耀眼能自動發(fā)出白色耀眼的熒光的熒光。武漢市疾病預防控制中心武漢市疾病預防控制中心微生物檢驗科微生物檢驗科孵育不同時間菌落生長情況武漢市疾病預防控制中心武漢市疾病預防控制中心微生物檢驗科微生物檢驗科軍團菌菌落特點（軍團菌菌落特點（1 1）u軍團軍菌落通常呈灰白色，但也能呈藍色、灰綠色、深褐軍團軍菌落通常呈灰白色，但也能呈藍色、灰綠色、深褐色或深紅色。色或深紅色。u一般表面光滑濕潤，邊緣完整，并顯示典型的毛玻璃樣外一般表面

37、光滑濕潤，邊緣完整，并顯示典型的毛玻璃樣外觀。觀。u在紫外燈下，某些種的菌落（博杰曼軍團菌、高曼軍團菌、在紫外燈下，某些種的菌落（博杰曼軍團菌、高曼軍團菌、杜莫夫軍團菌、安綏軍團菌、奇銳軍團菌、斯泰戈瓦爾特杜莫夫軍團菌、安綏軍團菌、奇銳軍團菌、斯泰戈瓦爾特軍團菌、格瑞梯納軍團菌、圖森軍團菌、巴黎軍團菌）能軍團菌、格瑞梯納軍團菌、圖森軍團菌、巴黎軍團菌）能自動發(fā)出白色的耀眼熒光；某些種的軍團菌也能發(fā)出紅光。自動發(fā)出白色的耀眼熒光；某些種的軍團菌也能發(fā)出紅光。武漢市疾病預防控制中心武漢市疾病預防控制中心微生物檢驗科微生物檢驗科軍團菌菌落特點（軍團菌菌落特點（2 2）u嗜肺軍團菌的菌落呈暗淡的綠嗜肺

38、軍團菌的菌落呈暗淡的綠色，并常伴有淺黃色色，并常伴有淺黃色。u為了避免軍團菌被殺死，平板為了避免軍團菌被殺死，平板暴露于紫外燈下不能超過規(guī)定暴露于紫外燈下不能超過規(guī)定時間時間。u值得注意的是，新發(fā)現(xiàn)的某些值得注意的是，新發(fā)現(xiàn)的某些種的軍團菌所具有的特征可能種的軍團菌所具有的特征可能會和上述特征有所區(qū)別。會和上述特征有所區(qū)別。 武漢市疾病預防控制中心武漢市疾病預防控制中心微生物檢驗科微生物檢驗科可疑軍團菌菌落的進一步鑒定可疑軍團菌菌落的進一步鑒定1.1.BCYEBCYE或其他培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)或其他培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)2.2.革蘭染色鏡檢革蘭染色鏡檢3.3.生化鑒定生化鑒定4.4.PCRPCR檢測軍團

39、菌特異性基因片段檢測軍團菌特異性基因片段5.5.免疫熒光的方法確定軍團菌的種類免疫熒光的方法確定軍團菌的種類 武漢市疾病預防控制中心武漢市疾病預防控制中心微生物檢驗科微生物檢驗科BCYEBCYE或其他培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)（或其他培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)（1 1）1.1.至少從每塊至少從每塊GVPCGVPC平板上挑選出兩個典型的軍團菌菌落，平板上挑選出兩個典型的軍團菌菌落，在在BCYEBCYE和和BCYE-CysBCYE-Cys培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)要在兩培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)要在兩種培養(yǎng)基上同時進行。種培養(yǎng)基上同時進行。2.2.在（在（36361 1）至少培養(yǎng)兩天。至少培養(yǎng)兩天。3.3.凡是在凡是

40、在BCYEBCYE培養(yǎng)基上生長而在培養(yǎng)基上生長而在BCYE-CysBCYE-Cys培養(yǎng)基上不生長培養(yǎng)基上不生長的菌落即可初步認定為軍團菌。的菌落即可初步認定為軍團菌。 武漢市疾病預防控制中心武漢市疾病預防控制中心微生物檢驗科微生物檢驗科BCYEBCYE或其他培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)（或其他培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)（2 2）u營養(yǎng)瓊脂或血瓊脂培養(yǎng)基可以代替營養(yǎng)瓊脂或血瓊脂培養(yǎng)基可以代替BCYE-CysBCYE-Cys培養(yǎng)基。培養(yǎng)基。如果在這三種培養(yǎng)基上都不生長，原來選擇性培養(yǎng)基如果在這三種培養(yǎng)基上都不生長，原來選擇性培養(yǎng)基上的可疑軍團菌菌落應該繼續(xù)傳代培養(yǎng)。上的可疑軍團菌菌落應該繼續(xù)傳代培養(yǎng)。u橡樹嶺軍團菌和幽

41、靈湖軍團菌在初次分離培養(yǎng)時需要橡樹嶺軍團菌和幽靈湖軍團菌在初次分離培養(yǎng)時需要L-L-半胱氨酸和鐵離子，但隨后在半胱氨酸和鐵離子，但隨后在L-L-半胱氨酸缺失時生半胱氨酸缺失時生長微弱。長微弱。武漢市疾病預防控制中心武漢市疾病預防控制中心微生物檢驗科微生物檢驗科BCYEBCYE培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)BCYE 血平板BCYE不含半胱氨酸革蘭染色鏡檢革蘭染色鏡檢軍團菌是革蘭染色陰性，淺紅色的短桿菌，直徑0.30.5M，長約1.25M或更長，菌體一端有鞭毛，長時間培養(yǎng)后鞭毛可能變成長絲狀。短桿狀長絲狀武漢市疾病預防控制中心武漢市疾病預防控制中心微生物檢驗科微生物檢驗科軍團菌生化鑒定軍團菌生化

42、鑒定生化試驗結(jié)果觸酶/弱+氧化酶-/+硝酸鹽還原-尿素酶-明膠液化+水解馬尿酸+淀粉水解弱+武漢市疾病預防控制中心武漢市疾病預防控制中心微生物檢驗科微生物檢驗科確定軍團菌的種型確定軍團菌的種型 Oxoid Oxoid 的乳膠試劑盒可以鑒定出：的乳膠試劑盒可以鑒定出： 嗜肺軍團菌血清嗜肺軍團菌血清1 1型型; ; 嗜肺軍團菌血清嗜肺軍團菌血清2-142-14混合型；混合型； L. longbeachae1L. longbeachae1和和2 2型型 ，L. bozemanii1L. bozemanii1和和2 2型，型，L. L. dumoffii dumoffii，L. gormaniiL.

43、gormanii，L. jordanisL. jordanis，L. micdadeiL. micdadei， L. anisaL. anisa混合型。混合型。 武漢市疾病預防控制中心武漢市疾病預防控制中心微生物檢驗科微生物檢驗科確定軍團菌的種型確定軍團菌的種型-1-11.1. 在進行鑒定試驗前，要保證在在進行鑒定試驗前，要保證在BCYEBCYE培養(yǎng)基上生長的菌落培養(yǎng)基上生長的菌落是經(jīng)過形態(tài)學檢查的純菌。是經(jīng)過形態(tài)學檢查的純菌。2.2. 屬的鑒定，屬的鑒定，16sRNA16sRNA。武漢市疾病預防控制中心武漢市疾病預防控制中心微生物檢驗科微生物檢驗科嗜肺軍團菌的確定嗜肺軍團菌的確定 應進行生化培養(yǎng)與血清學實驗確定嗜肺軍團菌。有應進行生化培養(yǎng)與血清學實驗確定嗜肺軍團菌。有條件的可做嗜肺軍團菌特異的條件的可做嗜肺軍團菌特異的PCRPCR檢測。檢測。 生化培養(yǎng)：氧化酶（生化培養(yǎng)：氧化酶（/ /弱弱+ +），硝酸鹽還原，尿素），硝酸鹽還原，尿素酶，明膠液化，水解馬尿酸酶，明膠液化，水解馬尿酸, ,淀粉酶水解弱淀粉酶水解弱+ + 血清學實驗：用嗜肺軍團菌診斷血清進行分型。血清