1、人類基因組DNA的提取主講人： 協助者：人類基因組DNA人類基因組DNA提取的原理 哺乳動物的一切有核細胞都可以用來制備DNA，除特殊要求外，白細胞、肝或脾組織是最常用的材料。原始材料較少或較難獲得時（如羊水細胞），還必須經過細胞培養來獲得足夠量的細胞；有時為了簡便易行起見，還可以無創傷地采集材料，如用口腔上皮脫落細胞、發根細胞。產前診斷所用的材料則為胎兒的羊水細胞或者絨毛膜細胞。人類基因組DNA提取的原理 根據材料來源不同，采取不同的材料處理方法，而后的DNA提取方法大體類似，但都應考慮以下原則：（1）防止和抑制DNase對DNA的降解；（2）盡量減少對溶液中DNA的機械剪切破壞，保持DNA

2、分子的完整；（3）將蛋白質、脂類、糖類等物質分離干凈。人類基因組DNA提取的原理 制備基因組DNA是進行基因結構和功能研究的重要步驟，通常要求得到的片段的長度不小于100-200kb。在DNA提取過程中應盡量避免使DNA斷裂和降解的各種因素，以保證DNA的完整性，為后續的實驗打下基礎。一般真核細胞基因組DNA有107-9bp，可以從新鮮組織、培養細胞或低溫保存的組織細胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等試劑存在下用蛋白酶K消化細胞，隨后用酚抽提而實現的。這一方法獲得的DNA不僅經酶切后可用于Southern分析，還可用于PCR的模板、文庫構建等實驗。人類基因組DNA提取的原理 SDS是一種

3、去污劑，破壞細胞膜的脂質膜。 蛋白酶K是一種很強的蛋白水解酶，能消化各種蛋白質（包括糖蛋白和肽類）及脂類和胺類物質，但糖蛋白的降解物常與DNA一同沉淀下來，干擾酶的活性，消化后需要用酚、氯仿抽提純化。 酚能變性蛋白質而且還能將變性的蛋白質溶解在其中。（加入1/3體積的飽和NaCl溶液，也可較好地祛除細胞降解物而純化DNA，可以避免酚的污染。）人類基因組DNA提取的方法 從全血中提取 從口腔上皮脫落細胞，發根細胞中提取從胎兒的羊水細胞或者絨毛膜細胞中提取（常用于產前診斷）根據來源：根據來源：人類基因組DNA提取的方法 從全血中提取細胞裂解液：裂解細胞膜，收集細胞核SDS：破裂核膜蛋白酶K：使核蛋

4、白降解成小片段并從DNA上解離下來苯酚氯仿：抽提去除蛋白質無水乙醇：沉淀DNA75%乙醇：洗滌DNA沉淀真空干燥后，溶解于TE(Tris(三羥甲基氨基甲烷)+EDTA)中即得到高分量的DNA人類基因組DNA提取的方法 從全血中提取裂解與與RNase/RNase/蛋白酶蛋白酶K K 消化消化1.取100 l抗凝全血置于1.5ml Eppendorf離心管中，再加入100 l裂解液和20 l RNaseA/蛋白酶K液，用移液器來回吹打混勻，室于55溫浴35分鐘，其間來回顛倒離心管幾次，直至溶液呈水溶狀。2.加入10l 3M的NaAc(pH 4.8)，隨后加入1250 l結合緩沖液，充分振蕩混勻，1

5、2，000 rpm離心30秒。人類基因組DNA提取的方法 從全血中提取裂解DNADNA與吸附柱結合與吸附柱結合3用移液器Tip轉移上清并加入到離心吸附柱（套好收集管）中，放置1分鐘，12，000 rpm離心30秒，倒掉收集管中的廢液。! !注意注意! !待轉移上清約1300l，離心吸附柱容量約650 l，故需每次轉移上清650 l到離心吸附柱中，離心，倒掉收集管中的廢液，重復實驗操作步驟3。人類基因組DNA提取的方法 從全血中提取裂解DNADNA的純化的純化4. 再加入600 l洗滌緩沖液（washing buffer）到離心吸附柱（套好收集管）中，12，000 rpm 離心30秒。5重復步驟

6、4一次，12，000 rpm 離心3分鐘以充分除去洗滌緩沖液。6小心取出離心吸附柱，棄收集管，將離心吸附柱套入一個干凈的1.5ml Eppendorf 離心管，并加入50 l洗脫緩沖液(elution buffer) 到離心吸附柱中(洗脫緩沖液一定要加在離心吸附柱的正中)，放置1分鐘，于12，000 rpm 離心30秒。7取出Eppendorf 離心管，其中便是所提取基因組NA。人類基因組DNA提取的方法 從口腔上皮脫落細胞中提取裂解與裂解液消化與裂解液消化1、用舌頭舔頰粘膜上顎、用牙刮頰部，嘬咀，用分泌出的唾液反復漱口；將唾液吐到杯中。用生理鹽水洗滌，2000rpm離心10分鐘，倒掉上清液；

7、重復1次。2、沉淀中加1ml 1細胞核裂解液(STE)，打散細胞團、混勻，再加酶解混合液（含350l STE、150l 10% SDS和10l 20mg/ml蛋白酶K），搖勻，至出現粘稠透明狀。37溫箱過夜或5034小時。人類基因組DNA提取的方法 從口腔上皮脫落細胞中提取裂解離心除雜質離心除雜質3、加等體積飽和酚（或1/3體積的飽和NaCl），輕搖混勻10分鐘，室溫2000rpm離心10分鐘，去除蛋白和SDS的沉淀。4、小心移上清至另一離心管（盡量避免吸取中間層），加等體積氯仿混勻5分鐘，室溫2000rpm離心5分鐘。5、重復步驟4一次。人類基因組DNA提取的方法 從口腔上皮脫落細胞中提取裂

8、解DNADNA的純化的純化6、將上清移入另一離心管中，沿離心管壁向DNA溶液中加入2.5倍體積的無水乙醇，輕輕搖動離心管混和至體系完全均一，見白色絮狀DNA。用移液器吸頭挑出DNA沉淀，在新配制的70%乙醇洗二次，室溫干燥5分鐘，再將DNA溶于20-100l TE中。7、TE溶解的DNA，在4下可保存一年，如要求長期保存，則需加2倍體積無水乙醇置-70保存。人類基因組DNA提取的方法酚、氯仿萃取法酶學法飽和鹽析法根據原理：根據原理：人類基因組DNA提取的方法酚、氯仿萃取法苯酚/氯仿提取DNA是利用酚是蛋白質的變性劑，反復抽提，使蛋白質變性，SDS(十二烷基磺酸鈉)將細胞膜裂解，在蛋白酶K、ED

9、TA的存在下消化蛋白質或多肽或小肽分子，核蛋白變性降解，使DNA從核蛋白中游離出來。DNA易溶于水，不溶于有機溶劑。蛋白質分子表面帶有親水基團，也容易進行水合作用，并在表面形成一層水化層，使蛋白質分子能順利地進入到水溶液中形成穩定的膠體溶液。當有機溶液存在時，蛋白質的這種膠體穩定性遭到破壞，變性沉淀。離心后有機溶劑在試管底層(有機相)，DNA存在于上層水相中，蛋白質則沉淀于兩相之間。酚-氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白質。氯仿的作用是有助于水相與有機相分離和除去DNA溶液中的酚。抽提后的DNA溶液用2倍體積的無水乙醇在NaCl存在下沉淀DNA，回收DNA用70%乙醇洗去DNA沉淀中的鹽，真空干

10、燥，用TE緩沖液溶解DNA備用。人類基因組DNA提取的方法飽和鹽析法蛋白質在低鹽濃度下的溶解度隨鹽液濃度升高而增加。球蛋白當鹽濃度不斷上升時，蛋白質的溶解度又以不同程度下降并先后析出（鹽析）。這是由于蛋白質分子內和分子間的電荷的極性基團有靜電引力。當水中加入少量鹽時，鹽離子與水分子對蛋白質分子一的極性基團的影響，使蛋白質在水中溶解度增大。但鹽濃度增加一定程度時，水的活度降低，蛋白質表面的電荷大量被中和，水化膜被破壞，于是蛋白質相互聚集而沉淀析出。鹽析法是根據不同蛋白質在一定濃度鹽溶液中溶解度降低程度不同達到彼此分離的方法。人類基因組DNA提取的結果分析聚合酶鏈式反應(PCR)紫外分光光度法瓊脂

11、糖凝膠電泳法限制性內切酶酶切法人類基因組DNA提取的結果分析聚合酶鏈式反應(PCR) PCR是利用DNA在體外攝氏95高溫時變性會變成單鏈，低溫（經常是60C左右）時引物與單鏈按堿基互補配對的原則結合，再調溫度至DNA聚合酶最適反應溫度（72C左右），DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5-3)的方向合成互補鏈。基于聚合酶制造的PCR儀實際就是一個溫控設備，能在變性溫度，復性溫度，延伸溫度之間很好地進行控制。人類基因組DNA提取的結果分析聚合酶鏈式反應(PCR)人類基因組DNA提取的結果分析紫外分光光度法 提取得到的DNA的濃度和純度都是未知的，在后續的DNA酶切、連接及轉化等實驗中需要一定的濃度和

12、純度要求，因此要測定DNA的濃度和純度。 組成DNA的堿基均具有一定的吸收紫外線特性，最大吸收值在波長為250270nm之間，腺嘌呤的最大紫外線吸收值在260.5nm，胞嘧啶：267nm，鳥嘌呤：276nm，胸腺嘧啶：264.5nm，尿嘧啶：259nm。這些堿基與戊糖、磷酸形成核苷酸后其最大吸收峰不會改變，但核酸的最大吸收波長是260nm，吸收低谷在230nm。這個物理特性為測定核酸溶液濃度提供了基礎。在波長260nm紫外線下，10OD值的光密度相當于雙鏈DNA濃度為50g/ml，單鏈DNA或RNA為40g/ml；單鏈寡聚核苷酸為20g/ml人類基因組DNA提取的結果分析紫外分光光度法 分光光

13、度法不但能夠確定核酸的濃度，還可以通過測定在260nm和280nm的紫外線吸收值的比值（A260/A280）估計核酸的純度。DNA的比值為1.8，RNA的比值為2.0。若DNA比值高于1.8，說明制劑中RNA尚未除盡。RNA、DNA溶液中含有酚和蛋白質將導致比值降低。270nm存在高吸收表明有酚的干擾。當然也會出現既含蛋白質又含RNA的DNA溶液比值為1.8的情況，所以有必要結合凝膠電泳等方法鑒定有無RNA，或用測定蛋白質的方法檢測是否存在蛋白質。紫外分光光度法只用于測定濃度大于0.25g/ml的核酸溶液。人類基因組DNA提取的結果分析限制性內切酶酶切法 限制性內切酶(RE)是由細菌自己產生的

14、能識別雙鏈DNA分子中的特定堿基順序，并以內切方式水解核酸中的磷酸二酯鍵的核酸水解酶。它可分為三種類型：、和型，型酶就是通常所指的RE，能識別雙鏈DNA的特異順序，并在這個順序內進行切割。 同一DNA用不同的限制酶進行切割，從而獲得各種限制酶的切割位點，由此建立的位點圖譜有助于對DNA的結構進行分析。 限制性核酸內切酶分析技術是病原變異、毒株鑒別、分型及了解基因結構和進行流行病學研究的有效方法，對動物檢疫有很重要的實用意義，尤其對區別進出境動物及動物產品攜帶病毒是疫苗毒還是野毒，以及推論其是本地毒還是外來毒有很重要的意義。人類基因組DNA提取的結果分析瓊脂糖凝膠電泳法 瓊脂糖凝膠電泳是用于分離

15、、鑒定和提純DNA片段的標準方法。瓊脂糖是從瓊脂中提取的一種多糖，具親水性，但不帶電荷，是一種很好的電泳支持物。DNA在堿性條件下（pH8.0的緩沖液）帶負電荷，在電場中通過凝膠介質向正極移動，不同DNA分子片段由于分子和構型不同，在電場中的泳動速率液不同。溴化乙錠（EB）可嵌入DNA分子堿基對間形成熒光絡合物，經紫外線照射后，可分出不同的區帶，達到分離、鑒定分子量，篩選重組子的目的。人類基因組DNA提取的應用 1、人類基因組測序 2、疾病基因的定位克隆 3、多基因病的研究人類基因組DNA提取的應用 1、人類基因組測序 1990年1998年，人類基因組序列已完成和正在測序的共計約330Mb，占

16、人基因組的11%左右；已識別出人類疾病相關的基因200個左右。此外，細菌、古細菌、支原體和酵母等17種生物的全基因組的測序已經完成。 1998年9月14日美國國家人類基因組計劃研究所（NHGRI）和美國能源部基因組研究計劃的負責人在一次咨詢會議上宣布，美國政府資助的人類基因組計劃將于2001年完成大部分蛋白質編碼區的測序，約占基因組的三分之一，測序的差錯率不超過萬分之一。同時還要完成一幅“工作草圖”，至少覆蓋基因組的90%，差錯率為百分之一。2003年完成基因組測序，差錯率為萬分之一。這一時間表顯示，計劃將比開始的目標提前兩年完成。 人類基因組DNA提取的應用 2、疾病基因的定位克隆 人類基因

17、組計劃的直接動因是要解決包括腫瘤在內的人類疾病的分子遺傳學問題。6000多個單基因遺傳病和多種大面積危害人類健康的多基因遺傳病的致病基因及相關基因，代表了對人類基因中結構和功能完整性至關重要的組成部分。所以，疾病基因的克隆在HGP中占據著核心位置，也是計劃實施以來成果最顯著的部分。 在遺傳和物理作圖工作的帶動下，疾病基因的定位、克隆和鑒定研究已形成了，從表位蛋白質基因的傳統途徑轉向“反求遺傳學”或“定位克隆法”的全新思路。隨著人類基因圖的完成，3000多個人類基因已被精確地定位于染色體的各個區域。今后，一旦某個疾病位點被定位，就可以從局部的基因圖中遴選出相關基因進行分析。這種被稱為“定位候選克隆”的策略，將大大提高發現疾病基因的效率。人類基因組DNA提取的應用 3、多