1、高二下生物選修1生物技術(shù)實(shí)踐復(fù)習(xí)知識(shí)點(diǎn)1、 果酒和果醋的制作發(fā)酵：利用微生物或其他生物的細(xì)胞在有氧或無(wú)氧條件下繁殖或積累其代謝產(chǎn)物的過(guò)程。類型：（1）根據(jù)是否需要氧氣分為：需氧發(fā)酵和厭氧發(fā)酵。（2）根據(jù)產(chǎn)生的產(chǎn)物可分為：酒精發(fā)酵、乳酸發(fā)酵、醋酸發(fā)酵等酶1酵母菌的細(xì)胞呼吸酶酵母菌進(jìn)行有氧呼吸大量繁殖：C6H12O6+6H2O +6O26CO2+12H2O+能量酵母菌進(jìn)行無(wú)氧呼吸產(chǎn)生酒精和二氧化碳：C6H12O62C2H5OH+2CO2+能量2酵母菌發(fā)酵的最佳環(huán)境:酵母菌在有氧和無(wú)氧的條件下都能生活在有氧時(shí)，酵母菌大量繁殖，但是起不到發(fā)酵效果；在無(wú)氧時(shí)，繁殖速度減慢，但是此時(shí)可以進(jìn)行發(fā)酵。在利用酵

2、母菌發(fā)酵時(shí)最好是先通入足夠的無(wú)菌空氣在有氧環(huán)境下一段時(shí)間使其繁殖，再隔絕氧氣進(jìn)行發(fā)酵。20左右最適合酵母菌繁殖，酒精發(fā)酵的最佳溫度是在1825，pH最好是弱酸性。C6H12O62O22CH3COOH2CO22H2O酶3醋酸菌好氧性細(xì)菌，當(dāng)缺少糖源時(shí)和有氧條件下，可將乙醇（酒精）氧化成醋酸。表達(dá)式為：C2H5OH+O2CH3COOH+H2O；當(dāng)氧氣、糖源都充足時(shí)，醋酸菌將葡萄汁中的糖分解成醋酸。醋酸菌生長(zhǎng)的最佳溫度是在3035裝置各部位的作用充氣口：在醋酸發(fā)酵時(shí)連接充氣泵進(jìn)行充氣。排氣口：排出酒精發(fā)酵時(shí)產(chǎn)生的CO2。出料口：是用來(lái)取樣的。與瓶身相連的長(zhǎng)而彎曲的膠管：加水后防止空氣中微生物的污染。

3、該裝置的使用方法：使用該裝置制酒時(shí)，應(yīng)該關(guān)閉充氣口；制醋時(shí)，應(yīng)將充氣口連接氣泵，輸入氧氣，酵母菌有氧呼吸時(shí)，產(chǎn)生能量多，可大量繁殖；無(wú)氧呼吸時(shí)，產(chǎn)生能量少，僅能滿足自身代謝，基本不繁殖；所以利用酵母菌進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)時(shí)先進(jìn)行通氣再密封。挑選新鮮的水果(如葡萄)沖洗榨汁酒精發(fā)酵醋酸發(fā)酵果酒果醋流程對(duì)照組2mL白酒實(shí)驗(yàn)組2mL發(fā)酵液試管甲2mL發(fā)酵前液試管乙2mL發(fā)酵后液3 molL的H2SO43滴振蕩混勻重鉻酸鉀溶液3滴觀察3 molL的H2SO43滴振蕩混勻重鉻酸鉀溶液3滴觀察果汁發(fā)酵后酒精的檢驗(yàn) (1)兩種對(duì)照方式都必須遵循單一變量原則。(2)前者是標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，后者是自身對(duì)照。還可以設(shè)置一組空白對(duì)

4、照（2ml蒸餾水）幾種常用發(fā)酵菌種的比較菌種項(xiàng)目酵母菌醋酸菌毛霉乳酸菌生物學(xué)分類真核生物原核生物真核生物原核生物代謝類型異養(yǎng)兼性厭氧異養(yǎng)需氧異養(yǎng)需氧異養(yǎng)厭氧繁殖方式適宜條件下出芽生殖二分裂生殖孢子生殖二分裂生殖生產(chǎn)應(yīng)用釀酒釀醋制作腐乳制作泡菜發(fā)酵條件前期需氧，后期不需氧一直需氧一直需氧不需氧 果酒、果醋、腐乳、泡菜制作中所用菌種及控制條件的比較 制作內(nèi)容比較項(xiàng)目 果酒果醋腐乳泡菜所用菌種酵母菌醋酸菌主要是毛霉乳酸菌控制條件O2的有無(wú)無(wú)氧有氧有氧無(wú)氧最適溫度182530351518常溫時(shí)間控制1012天78天腌制8天左右腌制10天左右其他條件封閉充氣口適時(shí)充氣控制鹽酒用量控制鹽水比例深

5、化拓展：1、由于醋酸菌和乳酸菌屬于原核生物，因此在利用這兩類微生物時(shí)，其環(huán)境中一定不要加入青霉素等抗生素。2、發(fā)酵：通過(guò)微生物技術(shù)的培養(yǎng)來(lái)生產(chǎn)大量代謝產(chǎn)物的過(guò)程。3、有氧發(fā)酵：醋酸發(fā)酵 谷氨酸發(fā)酵 |無(wú)氧發(fā)酵：酒精發(fā)酵 乳酸發(fā)酵 4、在葡萄酒自然發(fā)酵的過(guò)程中,起主要作用的是附著在葡萄皮表面的野生型酵母菌.在發(fā)酵過(guò)程中,隨著酒精濃度的提高,紅葡萄皮的色素也進(jìn)入發(fā)酵液,使葡萄酒呈現(xiàn)深紅色.在缺氧 呈酸性的發(fā)酵液中，酵母菌可以生長(zhǎng)繁殖，而絕大多數(shù)其他微生物都因無(wú)法適應(yīng)這一環(huán)境而受到制約。5、控制發(fā)酵條件的作用醋酸菌對(duì)氧氣的含量特別敏感，當(dāng)進(jìn)行深層發(fā)酵時(shí)，即使只是短時(shí)間中斷通入氧氣，也會(huì)引起醋酸菌死亡

6、。醋酸菌最適生長(zhǎng)溫度為3035，控制好發(fā)酵溫度，使發(fā)酵時(shí)間縮短，又減少雜菌污染的機(jī)會(huì)。有兩條途徑生成醋酸：直接氧化和以酒精為底物的氧化。2、微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)1、培養(yǎng)基：人們按照微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，是進(jìn)行微生物培養(yǎng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。2、培養(yǎng)基按照物理性質(zhì)可分為液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基。在液體培養(yǎng)基中加入凝固劑瓊脂（是從紅藻中提取的一種多糖，在配制培養(yǎng)基中用作常用的凝固劑，但不止這一種凝固劑）后，制成瓊脂固體培養(yǎng)基。微生物在固體培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)，可以形成肉眼可見的菌落。根據(jù)菌落的特征可以判斷是哪一種菌。液體培養(yǎng)基應(yīng)用于工業(yè)或生活生產(chǎn)。固體培養(yǎng)基應(yīng)用于微生

7、物的分離和鑒定。半固體培養(yǎng)基則常用于觀察微生物的運(yùn)動(dòng)及菌種保藏等。3、按照成分培養(yǎng)基可分為人工合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基。合成培養(yǎng)基是用成分已知的化學(xué)物質(zhì)配制而成，其中成分的種類比例明確，常用于微生物的分離鑒定。天然培養(yǎng)基是用化學(xué)成分不明的天然物質(zhì)配制而成，常用于實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)。4、按照培養(yǎng)基的用途，可將培養(yǎng)基分為選擇培養(yǎng)基和鑒定培養(yǎng)基。選擇培養(yǎng)基是指在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì)，以抑制不需要的微生物生長(zhǎng)，促進(jìn)所需要的微生物的生長(zhǎng)。鑒別培養(yǎng)基是根據(jù)微生物的特點(diǎn)，在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學(xué)藥品配制而成的，用以鑒別不同類別的微生物。5、培養(yǎng)基的化學(xué)成分包括 水、無(wú)機(jī)鹽、碳源、氮源、生長(zhǎng)因子（部分微生物

8、需要）等。6、碳源：能為微生物的代謝提供碳元素的物質(zhì)。如CO2、NaHCO3等無(wú)機(jī)碳源；糖類、石油、花生粉餅等有機(jī)碳源。異養(yǎng)微生物只能利用有機(jī)碳源。單質(zhì)碳不能作為碳源。7、氮源：能為微生物的代謝提供氮元素的物質(zhì)。如N2、NH3、NO3-、NH4+（無(wú)機(jī)氮源）蛋白質(zhì)、氨基酸、尿素、牛肉膏、蛋白胨（有機(jī)氮源）等。只有固氮微生物才能利用N2。8、培養(yǎng)基還要滿足微生物生長(zhǎng)對(duì)PH、特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及氧氣的要求。例如，培養(yǎng)乳酸桿菌時(shí)需要在培養(yǎng)基中添加維生素，培養(yǎng)霉菌時(shí)須將培養(yǎng)基的pH調(diào)至酸性，培養(yǎng)細(xì)菌是需要將pH調(diào)至中性或微堿性，培養(yǎng)厭氧型微生物是則需要提供無(wú)氧的條件9、無(wú)菌技術(shù)：獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵是防止

9、外來(lái)雜菌的入侵，要注意以下幾個(gè)方面：對(duì)實(shí)驗(yàn)操作的空間、操作者的衣著和手，進(jìn)行清潔和消毒。將用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進(jìn)行滅菌。為避免周圍環(huán)境中微生物的污染，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在酒精燈火焰附近進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)操作時(shí)應(yīng)避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸。無(wú)菌技術(shù)除了用來(lái)防止實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)物被其他外來(lái)微生物污染外，還有什么目的？答：無(wú)菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染。10、消毒與滅菌的區(qū)別消毒指使用較為溫和的物理或化學(xué)方法僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對(duì)人體有害的微生物（不包括芽孢和孢子菌落.芽孢，一種休眠體；孢子，一種生殖細(xì)胞。）。消毒方法常用煮沸消毒法，巴氏消毒法（對(duì)于一些不耐高

10、溫的液體）還有化學(xué)藥劑（如酒精、氯氣、石炭酸等）消毒、紫外線消毒。滅菌則是指使用強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子。滅菌方法有灼燒滅菌、干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌。滅菌方法選擇：接種環(huán)、接種針、試管口等使用灼燒滅菌法；玻璃器皿、金屬用具等使用干熱滅菌法，所用器械是干熱滅菌箱 ； 培養(yǎng)基、無(wú)菌水等使用高壓蒸汽滅菌法，所用器械是高壓蒸汽滅菌鍋 。表面滅菌和空氣滅菌等使用紫外線滅菌法，所用器械是紫外燈 。比較項(xiàng)理化因素的作用強(qiáng)度消滅微生物的數(shù)量芽孢和孢子能否被消滅消毒較為溫和部分生活狀態(tài)的微生物不能滅菌強(qiáng)烈全部微生物能制作牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基（1）方法步驟：計(jì)算、稱量、溶化、滅菌、

11、倒平板。（熔化之后滅菌之前往往需要調(diào)節(jié)PH）（2）倒平板操作的步驟：將滅過(guò)菌的培養(yǎng)皿放在火焰旁的桌面上，右手拿裝有培養(yǎng)基的錐形瓶，左手拔出棉塞。右手拿錐形瓶，將瓶口迅速通過(guò)火焰。用左手的拇指和食指將培養(yǎng)皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，右手將錐形瓶中的培養(yǎng)基（約1020mL）倒入培養(yǎng)皿，左手立即蓋上培養(yǎng)皿的皿蓋。等待平板冷卻凝固，大約需510min。然后，將平板倒過(guò)來(lái)放置，使培養(yǎng)皿蓋在下、皿底在上。純化大腸桿菌（1）微生物接種的方法最常用的是平板劃線法和稀釋涂布平板法。（2）平板劃線法是通過(guò)接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作。將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面。在數(shù)次劃線后培養(yǎng)，可以分離到

12、由一個(gè)細(xì)胞繁殖而來(lái)的肉眼可見的子細(xì)胞群體，這就是菌落。接種環(huán)第一次灼燒，殺死接種環(huán)上原有的微生物；每次劃線前灼燒，殺死上次劃線結(jié)束后接種環(huán)上殘留的菌種，使劃線菌種來(lái)源于上次劃線末端；劃線結(jié)束灼燒，殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免污染環(huán)境和感染操作者。灼燒后冷卻避免接種環(huán)溫度過(guò)高殺死菌種。（3）稀釋涂布平板法是將菌液進(jìn)行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，進(jìn)行培養(yǎng)。分為系列稀釋操作和涂布平板操作兩步。（4）用平板劃線法和稀釋涂布平板法接種的目的是：使聚集在一起的微生物分散成單個(gè)細(xì)胞，從而能在培養(yǎng)基表面形成單個(gè)的菌落，以便于純化菌種。（5）平板劃線法操作步驟：將接種

13、環(huán)放在火焰上灼燒，直到接種環(huán)燒紅。在火焰旁冷卻接種環(huán)，并打開棉塞。將試管口通過(guò)火焰。將已冷卻的接種環(huán)伸入菌液中蘸取一環(huán)菌液。將試管通過(guò)火焰，并塞上棉塞。左手將皿蓋打開一條縫隙，右手將沾有菌種的接種環(huán)迅速伸入平板內(nèi)，劃三至五條平行線，蓋上皿蓋。注意不要?jiǎng)澠婆囵B(yǎng)皿。灼燒接種環(huán)，待其冷卻后，從第一區(qū)域劃線的末端開始往第二區(qū)域內(nèi)劃線。重復(fù)以上操作，在三、四、五區(qū)域內(nèi)劃線。注意不要將最后一區(qū)的劃線與第一區(qū)相連。將平板倒置放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（6）涂布平板操作的步驟：將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中。取少量菌液，滴加到培養(yǎng)基表面。將沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃盡后，冷卻810s。用涂布器將菌液均勻

14、地涂布在培養(yǎng)基表面。培養(yǎng)基表面菌落顏色、形態(tài)、大小基本一致，符合目的菌特點(diǎn)，說(shuō)明接種操作成功。微生物計(jì)數(shù)方法 1、顯微鏡直接計(jì)數(shù)法，利用計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù)，但不能區(qū)分活菌與死菌。計(jì)數(shù)板上有1mm2×0.1mm的計(jì)數(shù)室，每個(gè)計(jì)數(shù)室400個(gè)小格。2、活菌計(jì)數(shù)法，在稀釋度足夠高的菌液中聚集在一起的微生物被分散成單個(gè)細(xì)胞，形成單個(gè)菌落，選擇菌落數(shù)在30-300之間的平板計(jì)數(shù)。菌落數(shù)比活菌實(shí)際數(shù)低，因?yàn)楫?dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞連在一起時(shí)，平板上只觀察到一個(gè)菌落。統(tǒng)計(jì)結(jié)果用菌落數(shù)來(lái)表示。3、濾膜法，飲用水過(guò)濾后，濾膜放在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，計(jì)數(shù)黑色大腸桿菌菌落。菌種的保存（1）對(duì)于頻繁使用的菌種，可

15、以采用臨時(shí)保藏的方法。臨時(shí)保藏方法將菌種接種到試管的固體斜面培養(yǎng)基上，在合適的溫度下培養(yǎng)。當(dāng)菌落長(zhǎng)成后，將試管放入4的冰箱中保藏。以后每36個(gè)月，都要重新將菌種從舊的培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)移到新鮮的培養(yǎng)基上。缺點(diǎn)：這種方法保存的時(shí)間不長(zhǎng)，菌種容易被污染或產(chǎn)生變異。（2）對(duì)于需要長(zhǎng)期保存的菌種，可以采用甘油管藏的方法。在3mL的甘油瓶中，裝入1mL甘油后滅菌。將1mL培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)移到甘油瓶中，與甘油充分混勻后，放在20的冷凍箱中保存。營(yíng)養(yǎng)是指生物攝取、利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的過(guò)程。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是指維持機(jī)體生命活動(dòng)，保證發(fā)育、生殖所需的外源物質(zhì)。人及動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)：水、無(wú)機(jī)鹽、糖類、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、維生素六類。植物的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)

16、：礦質(zhì)元素、水、二氧化碳等三類。微生物的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)：水、無(wú)機(jī)鹽、碳源、氮源及特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)五類。確定培養(yǎng)基制作是否合格的方法：將未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫12天，無(wú)菌落生長(zhǎng)，說(shuō)明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。培養(yǎng)基的分類和應(yīng)用劃分標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基種類特點(diǎn)用途物理性質(zhì) 液體培養(yǎng)基不加凝固劑工業(yè)生產(chǎn)半固體培養(yǎng)基加凝固劑，如瓊脂觀察微生物的運(yùn)動(dòng)、分類、鑒定固體培養(yǎng)基加凝固劑，如瓊脂微生物分離、鑒定、活菌計(jì)數(shù)化學(xué)組成天然培養(yǎng)基含化學(xué)成分不明確的天然物質(zhì) 工業(yè)生產(chǎn) 合成培養(yǎng)基培養(yǎng)基成分明確（用化學(xué)成分已知的化學(xué)物質(zhì)配成） 分類、鑒定 目的用途選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì)，以抑制不需要的微生物的生

17、長(zhǎng)，促進(jìn)所需要的微生物的生長(zhǎng)培養(yǎng)、分離出特定微生物鑒別培養(yǎng)基根據(jù)微生物的代謝特點(diǎn)，在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學(xué)藥品鑒別不同種類的微生物消毒與滅菌的區(qū)別比較項(xiàng)目消毒滅菌條件使用較為溫和的理化方法使用強(qiáng)烈的理化因素結(jié)果殺死物體表面或內(nèi)部一部分對(duì)人體有害的微生物（不包括芽孢和孢子） 殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子 適用實(shí)驗(yàn)操作的空間、操作者的衣服和手 微生物的培養(yǎng)器皿、接種用具和培養(yǎng)基等 常用方法煮沸消毒法（如在100，煮沸56 min）、巴氏消毒法（如在80，煮15 min）；使用酒精、氯氣、石炭酸等化學(xué)藥劑進(jìn)行消毒 灼燒滅菌、干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌  三種常用滅菌方法的比較

18、滅菌方法滅菌條件滅菌時(shí)間適用材料或用具灼燒滅菌酒精燈火焰的充分燃燒層直至燒紅接種環(huán)、接種針或其他金屬工具干熱滅菌干熱滅菌箱內(nèi)，16017012 h玻璃器皿（吸管、培養(yǎng)皿）和金屬用具等高壓蒸汽滅菌100kPa，1211530 min培養(yǎng)基等3、土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)篩選菌株：利用選擇培養(yǎng)基篩選菌株。測(cè)定微生物數(shù)量的常用方法：統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目和顯微鏡直接計(jì)數(shù)。土壤取樣選擇培養(yǎng)梯度稀釋涂布平板微生物的培養(yǎng)與觀察挑選菌落尿素：是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥，尿素并不能直接被農(nóng)作物吸收。只有當(dāng)土壤中的細(xì)菌將尿素分解成氨之后，才能被植物利用。土壤中的細(xì)菌之所以能分解尿素，是因?yàn)樗麄兡芎铣呻迕?尿素最初是從人的

19、尿液中發(fā)現(xiàn)的尿素分解菌的分離：尿素分解菌能合成脲酶將尿素分解成氨。氨使培養(yǎng)基的PH升高。以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，培養(yǎng)尿素分解菌，指示劑變紅色。篩選菌株（1）實(shí)驗(yàn)室中微生物的篩選應(yīng)用的原理人為提供有利于目的菌株生長(zhǎng)的條件（包括營(yíng)養(yǎng)、溫度、pH等），同時(shí)抑制或阻止其他微生物生長(zhǎng)。（2）選擇性培養(yǎng)基在微生物學(xué)中，將允許特定種類的微生物生長(zhǎng)，同時(shí)抑制或阻止其他種類微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，稱作選擇培養(yǎng)基。（3）配制選擇培養(yǎng)基的依據(jù)：根據(jù)選擇培養(yǎng)的菌種的生理代謝特點(diǎn)加入某種物質(zhì)以達(dá)到選擇的目的。例如，培養(yǎng)基中不加入有機(jī)物可以選擇培養(yǎng)自養(yǎng)微生物；培養(yǎng)基中不加入氮元素，可以選擇培養(yǎng)能固氮的微生物

20、；加入高濃度的食鹽可選擇培養(yǎng)金黃色葡萄球菌等。設(shè)置對(duì)照：設(shè)置對(duì)照的主要目的是排除實(shí)驗(yàn)組中非測(cè)試因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。對(duì)照實(shí)驗(yàn)是指除了被測(cè)試的條件以外，其他條件都相同的實(shí)驗(yàn)，其作用是比照試驗(yàn)組，排除任何其他可能原因的干擾，證明確實(shí)是所測(cè)試的條件引起相應(yīng)的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)包括實(shí)驗(yàn)方案，所需儀器、材料、用具和藥品，具體的實(shí)施步驟以及時(shí)間安排等的綜合考慮和安排。（1）土壤取樣：同其他生物環(huán)境相比，土壤中的微生物，數(shù)量最大，種類最多。在富含有機(jī)質(zhì)的土壤表層，有更多的微生物生長(zhǎng)。從富含有機(jī)物、潮濕、pH7的土壤中取樣。鏟去表層土，在距地表約38cm的土壤層取樣。（2）樣品的稀

21、釋：樣品的稀釋程度將直接影響平板上生長(zhǎng)的菌落數(shù)目。在實(shí)際操作中，通常選用一定稀釋范圍的樣品液進(jìn)行培養(yǎng)，以保證獲得菌落數(shù)在30300之間、適于計(jì)數(shù)的平板。測(cè)定土壤中細(xì)菌的數(shù)量，一般選用104 105 106測(cè)定放線菌的數(shù)量，一般選用103 104 105 測(cè)定真菌的數(shù)量，一般選用102 103 104（3）微生物的培養(yǎng)與觀察不同種類的微生物，往往需要不同的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間。細(xì)菌3037 12天放線菌2528 57天 霉菌2528 34天每隔24小時(shí)統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目，選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為結(jié)果，這樣可以防止因培養(yǎng)時(shí)間不足而導(dǎo)致一樓菌落的數(shù)目。一般來(lái)說(shuō)，在一定的培養(yǎng)條件下（相同的培養(yǎng)基、唯獨(dú)

22、及培養(yǎng)時(shí)間），同種微生物表現(xiàn)出穩(wěn)定的菌落特征。形狀、大小、隆起程度、顏色如何從平板上的菌落數(shù)推測(cè)出每克樣品中的菌落數(shù)？統(tǒng)計(jì)某一稀釋度下平板上的菌落數(shù)，最好能統(tǒng)計(jì)3個(gè)平板，計(jì)算出平板菌落數(shù)的平均值每克樣品中的菌落數(shù)=（C/V）*M 其中，C代表某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積（ml），M代表稀釋倍數(shù)4、 菊花的組織培養(yǎng)一、植物組織培養(yǎng)的基本過(guò)程1、原理：植物細(xì)胞全能性。 細(xì)胞分化的實(shí)質(zhì)：基因選擇性表達(dá)的結(jié)果。2、全能性表達(dá)的條件：離體狀態(tài)和適宜環(huán)境條件（如營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、激素、溫度等）3、基本過(guò)程：離體的植物組織或細(xì)胞愈傷組織叢芽、生根（試管苗）完整植株4、愈傷組

23、織：排列疏松而無(wú)規(guī)則，高度液泡化的呈無(wú)定型狀態(tài)的薄壁細(xì)胞。二、菊花的組織培養(yǎng) 1、材料選取：未開花植株的莖上部新萌生的側(cè)枝。2、營(yíng)養(yǎng)：MS培養(yǎng)基，一般添加植物激素(濃度、使用順序、用量比例都會(huì)影響實(shí)驗(yàn))。 3、過(guò)程：制備MS培養(yǎng)基外植體消毒接種培養(yǎng)移栽栽培細(xì)胞分化：在生物個(gè)體發(fā)育過(guò)程中，細(xì)胞在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和生理功能上出現(xiàn)穩(wěn)定性差異的過(guò)程。愈傷組織的細(xì)胞排列疏松而無(wú)規(guī)則，是一種高度液泡化的呈無(wú)定形狀態(tài)的薄壁細(xì)胞。脫分化（去分化）：由高度分化的植物組織或細(xì)胞產(chǎn)生愈傷組織的過(guò)程。 再分化：愈傷組織繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，又可以重新分化成根或芽等器官的過(guò)程。具有某種生物全套遺傳信息的任何一個(gè)活細(xì)胞，都具有發(fā)育成完

24、整個(gè)體的能力，即每個(gè)生物細(xì)胞都具有全能性。但在生物體的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中并不表現(xiàn)出來(lái)，這是因?yàn)樵谔囟ǖ臅r(shí)間和空間條件下，通過(guò)基因的選擇性表達(dá)，構(gòu)成不同組織和器官。植物組織培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用有：實(shí)現(xiàn)優(yōu)良品種的快速繁殖；培育脫毒作物；制作人工種子；培育作物新品種以及細(xì)胞產(chǎn)物的工廠化生產(chǎn)等。細(xì)胞分化是一種持久性的變化，它有什么生理意義？：使多細(xì)胞生物體中細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能趨向?qū)ｉT化，有利于提高各種生理功能的效率。比較根尖分生組織和愈傷組織的異同組織類型細(xì)胞來(lái)源細(xì)胞形態(tài)細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)胞排列細(xì)胞去向根尖分生組織受精卵正方形無(wú)液泡緊密分化成多種細(xì)胞組織愈傷組織高度分化細(xì)胞無(wú)定形高度液泡化疏松再分化成新個(gè)體相同點(diǎn)都通過(guò)有絲

25、分裂進(jìn)行細(xì)胞增殖影響植物組織培養(yǎng)的條件材料：不同的植物組織，培養(yǎng)的難易程度差別很大。植物的種類、材料的年齡和保存時(shí)間的長(zhǎng)短等都會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。菊花組織培養(yǎng)一般選擇未開花植物的莖上部新萌生的側(cè)枝作材料。一般來(lái)說(shuō)，容易進(jìn)行無(wú)性繁殖的植物容易進(jìn)行組織培養(yǎng)。選取生長(zhǎng)旺盛嫩枝進(jìn)行組培的是嫩枝生理狀態(tài)好，容易誘導(dǎo)脫分化和再分化。營(yíng)養(yǎng)：離體的植物組織和細(xì)胞，對(duì)營(yíng)養(yǎng)、環(huán)境等條件的要求相對(duì)特殊，需要配制適宜的培養(yǎng)基。常用的培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基，其中含有的大量元素是N、P、S、K、Ca、Mg，微量元素是Fe、Mn、B、Zn、Cu、Mo、I、Co，有機(jī)物有甘氨酸、煙酸、肌醇、維生素、蔗糖等。激素：植物激素中生長(zhǎng)素和細(xì)

26、胞分裂素是啟動(dòng)細(xì)胞分裂、脫分化和再分化的關(guān)鍵性激素。在生長(zhǎng)素存在的情況下，細(xì)胞分裂素的作用呈現(xiàn)加強(qiáng)趨勢(shì)。在培養(yǎng)基中需要添加生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素等植物激素，其濃度（根據(jù)生長(zhǎng)素作用的兩重性：低濃度促進(jìn)生長(zhǎng)，高濃度抑制生長(zhǎng)，甚至殺死植物）、使用的先后順序、用量的比例等都影響結(jié)果。使用順序?qū)嶒?yàn)結(jié)果先生長(zhǎng)素，后細(xì)胞分裂素有利于分裂但不分化先細(xì)胞分裂素，后生長(zhǎng)素細(xì)胞既分裂也分化同時(shí)使用分化頻率提高生長(zhǎng)素 細(xì)胞分裂素比值與結(jié)果比值高時(shí)促根分化，抑芽形成比值低時(shí)促芽分化，抑根形成比值適中促進(jìn)愈傷組織生長(zhǎng)+環(huán)境條件：PH、溫度、光等環(huán)境條件。 不同的植物對(duì)條件的要求往往不同。進(jìn)行菊花的組織培養(yǎng)，一般將pH控制在5

27、.8左右，溫度控制在1822，并且每日用日光燈照射12h. 1、菊花莖的組織培養(yǎng)與月季的花粉培養(yǎng)的比較比較項(xiàng)目菊花莖的組織培養(yǎng)理論依據(jù)細(xì)胞的全能性基本過(guò)程脫分化、再分化影響因素選材、營(yíng)養(yǎng)、激素、pH、溫度、光照等 比較材料選取生長(zhǎng)旺盛的嫩枝pH5.8溫度1822光照每日光照12h操作流程制備培養(yǎng)基外植體消毒接種培養(yǎng)移栽栽培 植物組織培養(yǎng)技術(shù)與微生物培養(yǎng)技術(shù)的比較比較項(xiàng)目植物組織培養(yǎng)微生物培養(yǎng)含義在無(wú)菌條件下，將離體的植物體器官或組織接種在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，最終發(fā)育成完整植物體在無(wú)菌條件下，在適宜的營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境條件下對(duì)微生物的培養(yǎng)培養(yǎng)基成分水、礦質(zhì)元素、蔗糖、維生素、有機(jī)添加物和植物激素等水

28、、無(wú)機(jī)鹽、碳源、氮源等特殊操作要求嚴(yán)格控制無(wú)菌操作，在培養(yǎng)過(guò)程中要更換培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素的比例嚴(yán)格控制無(wú)菌操作，整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程無(wú)需更換培養(yǎng)基 注：在這兩種技術(shù)中均需要一定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，但營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的劃分標(biāo)準(zhǔn)不同。4、 操作流程配制MS固體培養(yǎng)基：配制各種母液：將各種成分按配方比例配制成的濃縮液（培養(yǎng)基母液）。·使用時(shí)根據(jù)母液的濃縮倍數(shù)，計(jì)算用量，并加蒸餾水稀釋。·配制培養(yǎng)基：應(yīng)加入的物質(zhì)有瓊脂、蔗糖、大量元素、微量元素、有機(jī)物和植物激素的母液，并用蒸餾水定容到1000毫升。·在菊花組織培養(yǎng)中，可以不添加植物激素原因是菊花莖段組織培養(yǎng)比較容易。

29、83;滅菌：采取的滅菌方法是高壓蒸汽滅菌。·MS培養(yǎng)基中各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的作用是什么？與肉湯培養(yǎng)基相比，MS培養(yǎng)基有哪些特點(diǎn)？大量元素和微量元素提供植物細(xì)胞所必需的無(wú)機(jī)鹽；蔗糖提供碳源，維持細(xì)胞滲透壓；甘氨酸、維生素等物質(zhì)主要是為了滿足離體植物細(xì)胞在正常代謝途徑受到一定影響后所產(chǎn)生的特殊營(yíng)養(yǎng)需求。微生物培養(yǎng)基以有機(jī)營(yíng)養(yǎng)為主，MS培養(yǎng)基則需提供大量無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)。外植體的消毒 外植體：用于離體培養(yǎng)的植物器官或組織片段。選取菊花莖段時(shí)，要取生長(zhǎng)旺盛的嫩枝。菊花莖段用流水沖洗后可加少許洗衣粉，用軟刷輕輕刷洗，刷洗后在流水下沖洗20min左右。用無(wú)菌吸水紙吸干外植體表面的水分，放入體積分?jǐn)?shù)為70%的酒

30、精中搖動(dòng)23次，持續(xù)67s，立即將外植體取出，在無(wú)菌水中清洗。取出后仍用無(wú)菌吸水紙吸干外植體表面水分，放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的氯化汞溶液中12min。取出后，在無(wú)菌水中至少清洗3次，漂洗消毒液。注意：對(duì)外植體進(jìn)行表面消毒時(shí)，就要考慮藥劑的消毒效果，又要考慮植物的耐受能力。接種：接種過(guò)程中插入外植體時(shí)形態(tài)學(xué)上端朝上，每個(gè)錐形瓶接種78個(gè)外植體。外植體接種與細(xì)菌接種相似，操作步驟相同，而且都要求無(wú)菌操作。培養(yǎng)：應(yīng)該放在無(wú)菌箱中進(jìn)行，并定期進(jìn)行消毒，保持適宜的溫度（1822）和光照（12h）移栽：栽前應(yīng)先打開培養(yǎng)瓶的封口膜，讓其在培養(yǎng)間生長(zhǎng)幾日，然后用流水清洗根部培養(yǎng)基。然后將幼苗移植到消過(guò)毒的蛭石

31、或珍珠巖等環(huán)境中生活一段時(shí)間，進(jìn)行壯苗。最后進(jìn)行露天栽培。栽培 ：外植體在培養(yǎng)過(guò)程中可能會(huì)被污染，原因有外植體消毒不徹底；培養(yǎng)基滅菌不徹底；接種中被雜菌污染；錐形瓶密封性差等。5果膠酶在果汁生產(chǎn)中的作用（一）基礎(chǔ)知識(shí) 1植物細(xì)胞壁以及胞間層的主要組成成分有纖維素和果膠。并且兩者不溶于水，在果汁加工中，既影響出汁率，又使果汁渾濁。 2果膠酶的作用是能夠?qū)⒐z分解成可溶性的半乳糖醛酸，瓦解植物的細(xì)胞壁及胞間層，并且使果汁變得澄清。3果膠酶是一類酶總稱，包括多聚半乳糖醛酸酶、果膠分解酶、果膠酯酶等。4果膠酶的來(lái)源：植物、霉菌、酵母菌和細(xì)菌。5影響酶活性的因素包括：溫度、PH、和酶的抑制劑等。6酶的活

32、性是指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力。其高低用一定條件下酶所催化的某一化學(xué)反應(yīng)的速度來(lái)表示。7酶的反應(yīng)速度是指單位時(shí)間內(nèi)，單位體積中反應(yīng)物的減少量或產(chǎn)物的增加量來(lái)表示。8果膠酶的用量：生產(chǎn)果汁時(shí)，為了使果膠酶得到充分的利用，需要控制好酶的用量，用量的多少常要通過(guò)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)來(lái)探究。（二）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)一探究溫度對(duì)酶活性的影響1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前要解決的幾個(gè)問題： 此實(shí)驗(yàn)的自變量是溫度；根據(jù)單一變量原則，你應(yīng)確保各實(shí)驗(yàn)組相同的變量有PH、底物濃度、底物量、實(shí)驗(yàn)器材、酶的用量等等。 你準(zhǔn)備如何測(cè)定果膠酶的活性，即你要觀測(cè)的因變量是出汁量和果汁的澄清度。 如何控制實(shí)驗(yàn)要求的溫度梯度？各個(gè)燒杯內(nèi)加入不同溫度的水2設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)

33、（1）實(shí)驗(yàn)原理：在一恒定PH下，通過(guò)改變溫度來(lái)確定最適宜的溫度（2）實(shí)驗(yàn)步驟： 攪拌器攪拌制蘋果泥。 將分別裝有蘋果泥和果膠酶的試管在恒溫水浴中保溫。 加入果膠酶反應(yīng)一段時(shí)間。 過(guò)濾果汁。并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。改變不同的溫度后重復(fù)上面的實(shí)驗(yàn)。（3）實(shí)驗(yàn)結(jié)果、結(jié)論：設(shè)計(jì)二探究PH對(duì)酶活性的影響1 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前要解決的幾個(gè)問題：你準(zhǔn)備如何設(shè)置pH梯度，又將如何控制實(shí)驗(yàn)要求的pH？5 6 7 8 9 選取不同的試管，調(diào)至所需PH 此實(shí)驗(yàn)應(yīng)選一個(gè)適宜的溫度進(jìn)行水浴加熱，并且要控制好其他的因素。 2設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)可參考溫度對(duì)酶活性的影響實(shí)驗(yàn)，作相應(yīng)的變動(dòng)。設(shè)計(jì)三探究果膠酶的用量1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前要解決的幾個(gè)問題： 此探究實(shí)

34、驗(yàn)是建立在溫度和PH對(duì)果膠酶活性影響的基礎(chǔ)之上的。此時(shí)，研究的變量是酶的用量，其他因素保持不變。 實(shí)驗(yàn)時(shí)可以配制不同濃度的果膠酶溶液，也可以只配制相同濃度的果膠酶溶液，然后使用不同的體積即可，但必需保證反應(yīng)液的用量必須相同，否則影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。 2設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)可參考前兩個(gè)探究實(shí)驗(yàn)，作相應(yīng)的變動(dòng)。6 血紅蛋白的提取和分離一、實(shí)驗(yàn)原理蛋白質(zhì)的物化理性質(zhì)：形狀、大小、電荷性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)、親和力等千差萬(wàn)別，由此提取和分離各種蛋白質(zhì)。1凝膠色譜法（分配色譜法）：（1）原理：分子量大的分子通過(guò)多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動(dòng)快；分子量小的分子穿過(guò)多孔凝膠顆粒內(nèi)部，路程長(zhǎng)，流動(dòng)慢。（2）凝膠

35、材料：多孔性，多糖類化合物，如葡聚糖、瓊脂糖。（3）分離過(guò)程： 混合物上柱洗脫大分子流動(dòng)快、小分子流動(dòng)慢收集大分子收集小分子 洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質(zhì)分子的差速流動(dòng)。（4）作用： 分離蛋白質(zhì)，測(cè)定生物大分子分子量，蛋白質(zhì)的脫鹽等。2緩沖溶液（1）原理：由弱酸和相應(yīng)的強(qiáng)堿弱酸鹽組成（如H2CO3NaHCO3， NaH2PO4/Na2HPO4等），調(diào)節(jié)酸和鹽的用量，可配制不同pH的緩沖液。（2）緩沖液作用：抵制外界酸、堿對(duì)溶液pH的干擾而保持pH穩(wěn)定。3凝膠電泳法：（1）原理：不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)、電量、形狀和大小不同，在電場(chǎng)中受到的作用力大小、方向、阻力不同，導(dǎo)致不同蛋白質(zhì)在

36、電場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)方向和運(yùn)動(dòng)速度不同。（2）分離方法：瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。（3）分離過(guò)程：在一定pH下，使蛋白質(zhì)基團(tuán)帶上正電或負(fù)電；加入帶負(fù)電荷多的SDS，形成“蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物”，使蛋白質(zhì)遷移速率僅取決于分子大小。二、實(shí)驗(yàn)步驟1樣品處理 紅細(xì)胞的洗滌洗滌紅細(xì)胞的目的是去除雜蛋白，采集的血樣要及時(shí)采用低速短時(shí)間離心分離紅細(xì)胞，然后用膠頭吸管吸出上層透明的黃色血漿，將下層暗紅色的紅細(xì)胞液體倒入燒杯，再加入五倍體積的生理鹽水，緩慢攪拌10min，低速短時(shí)間離心，如此重復(fù)洗滌三次，直至上清液中沒有黃色，表明紅細(xì)胞已洗滌干凈。血紅蛋白的釋放在蒸餾水和甲苯作用下，紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。

37、注：加入蒸餾水后紅細(xì)胞液體積與原血液體積要相同。加入甲苯的目的是溶解細(xì)胞膜，有利于血紅蛋白的釋放和分離。2粗分離分離血紅蛋白溶液 將攪拌好的混合溶液離心后，試管中的溶液分為4層。第一層為無(wú)色透明的甲苯層，第2層為白色薄層固體，是脂溶性物質(zhì)的沉淀層，第3層是紅色透明液體，這是血紅蛋白的水溶液，第4層是其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物。將試管中的液體用濾紙過(guò)濾，除去之溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。透析 取1mL的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300mL的物質(zhì)的量的濃度為20mmol/L的磷酸緩沖液中，透析12h。透析可以去除樣品中分子量較小的雜質(zhì)，或用于更換樣品的緩

38、沖液。3純化調(diào)節(jié)緩沖液面：打開色譜柱下端的流出口，使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液緩慢下降到與凝 膠面平齊，關(guān)閉出口。加入蛋白質(zhì)樣品：用吸管將透析后的樣品沿管壁環(huán)繞移動(dòng)加到色譜柱的頂端。加樣后， 打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全滲入凝膠層后， 關(guān)閉出口。調(diào)節(jié)緩沖液面：加入20mmol/L的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度洗脫：連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口，進(jìn)行洗脫。收集分裝蛋白質(zhì)：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集。4.純度鑒定-SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（選做）三、注意事項(xiàng)1. 電泳技術(shù)電泳技術(shù)就是在電場(chǎng)的作用下，利用待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)

39、生不同的遷移速度，從而達(dá)到對(duì)樣品進(jìn)行分離、鑒定或提純的目的。2. 紅細(xì)胞的洗滌如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過(guò)高和時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細(xì)胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。3如何檢測(cè)凝膠色譜柱的裝填是否成功由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。此外，還可以加入大分子的有色物質(zhì)，觀察色帶移動(dòng)的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說(shuō)明凝膠色譜柱的性能良好。如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時(shí)要重新裝柱。4為什么凝膠的裝填要緊密、均勻？如果凝膠裝填得不夠緊密、均勻，就會(huì)在色譜柱內(nèi)形成無(wú)效的空隙，使本該進(jìn)入凝膠內(nèi)部的樣品分子從這些空隙中通過(guò)，攪亂洗脫液的流動(dòng)次序，影響分離的效果。5沸水浴處理加入洗脫液的濕凝膠的目的不但節(jié)約時(shí)間，還能除去凝膠中可能帶有的微生物和排除凝膠內(nèi)的空氣。6G-75“G”代表凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍，75表示凝膠得水值，即每克凝膠膨脹時(shí)吸水7.5g。7裝填完后，立即用洗脫液洗脫的目的：使凝膠裝填緊密8加入檸檬酸鈉有何目的？為什么要低速、短時(shí)離心？為什么要緩慢攪拌？