1、凝膠遷移實驗（EMSA）凝膠遷移或電泳遷移率實驗（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是一種研究DNA結合蛋白和其相關的DNA結合序列相互作用的技術，可用于定性和定量分析。這一技術最初用于研究DNA結合蛋白，目前已用于研究RNA結合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。實驗步驟：探針的標記 探針的純化 EMSA膠的配制 EMSA結合反應 電泳分析一、探針的標記1.設置探針標記的反應體系；2.使用水浴或PCR儀，37反應10分鐘；3.加入1微升探針標記終止液，混勻，終止探針標記反應。4.再加入89微升TE，混勻。此時可以取少量探針用于檢測標記的效率。通

2、常標記的效率在30%以上，即總放射性的30%以上標 記到了探針上。為實驗簡便起見，通常不必測定探針的標記效率。5.標記好的探針最好立即使用，最長使用時間一般不宜超過3天。標記好的探針可以保存在-20。 二、 探針的純化1.對于100微升標記好的探針，加入1/4體積即25微升的5 M醋酸銨，再加入2體積即200微升的無水乙醇，混勻。2.在-70至-80沉淀1小時，或在-20沉淀過夜。3.在4，12 000 g-16 000 g離心30分鐘。小心去除上清，切不可觸及沉。4.在4，12 000 g-16 000 g離心1分鐘。小心吸去殘余液體。微晾干沉淀，但不宜過分干燥。5.加入100微升TE，完全

3、溶解沉淀。標記好的探針最好立即使用，最長使用時間一般不宜超過3天。標記好的探針可以保存在 -20。 三、EMSA 膠的配制1.準備好倒膠的模具。可以使用常規的灌制蛋白電泳膠的模具，或其它適當的模具。最好選擇可以灌制較薄膠的模具，以便于干膠等后續操作。為得到更好的結果，可以選擇可灌制較大 EMSA 膠的模具。2.按照如下配方配制20毫升4的聚丙烯酰胺凝膠(注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis對結果影響不大)。3.按照上述次序加入各個溶液，加入TEMED前先混勻，加入TEMED后立即混勻，并馬上加入到制膠的模具中。避免產生氣泡， 并加上梳齒。如果發現非常容易形成氣泡，可以把一塊制膠的玻璃板

4、進行硅烷化處理。 四、EMSA結合反應1. 如下設置EMSA結合反應 陰性對照反應： （1）Nuclease-Free Water ：7微升。（2）EMSA/Gel-Shift結合緩沖液(5X) ：2微升。（3）細胞核蛋白或純化的轉錄因子： 0微升。（4）標記好的探針 ：1微升。（5）總體積 ：10微升。 樣品反應：（1）Nuclease-Free Water ：5微升。（2）EMSA/Gel-Shift結合緩沖液(5X) ：2微升。（3）細胞核蛋白或純化的轉錄因子 ：2微升。（4）標記好的探針： 1微升。（5）總體積： 10微升。 探針冷競爭反應：（1）Nuclease-Free Water

5、 ：4微升。（2）EMSA/Gel-Shift結合緩沖液(5X) ：2微升。（3）細胞核蛋白或純化的轉錄因子： 2微升。（4）未標記的探針： 1微升。（5）標記好的探針： 1微升。（6）總體積 ：10微升。 突變探針的冷競爭反應：（1）Nuclease-Free Water ：4微升。（2）EMSA/Gel-Shift結合緩沖液(5X) ：2微升。（3）細胞核蛋白或純化的轉錄因子 ：2微升。（4）未標記的突變探針： 1微升。（5）標記好的探針： 1微升。（6）體積 ：10微升 Super-shift反應：（1）Nuclease-Free Water：4微升。（2）EMSA/Gel-Shift結

6、合緩沖液(5X) ：2微升。（3）細胞核蛋白或純化的轉錄因子：2微升。（4）目的蛋白特異抗體 ：1微升。（5）標記好的探針：1微升。（6）總體積 ：10微升。 2. 按照上述順序依次加入各種試劑，在加入標記好的探針前先混勻，并且室溫(20-25)放置10分鐘，從而消除可能發生的探針和蛋白的非特異性結合，或者讓冷探針優先反應。然后加入標記好的探針，混勻，室溫(20-25)放置20分鐘。 3. 加入1微升EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液(無色，10X)，混勻后立即上樣。注意：有些時候溴酚藍會影響蛋白和DNA的結合，建 議盡量使用無色的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液。如果對于使用無色上

7、樣緩沖液在上樣時感覺到無法上樣，可以在無色上樣緩沖液里面添加極少量的藍色的上樣緩沖液，至能觀察到藍顏色即可。 五、 電泳分析 1.用0.5XTBE作為電泳液。按照10V/厘米的電壓預電泳10分鐘。預電泳的時候如果有空余的上樣孔，可以加入少量稀釋好的1X 的EMSA上樣緩沖液(藍色)，以觀察電壓是否正常進行。 2.把混合了上樣緩沖液的樣品加入到上樣孔內。在多余的某個上樣孔內加入10微升稀釋好的1X的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液 (藍色)，用于觀察電泳進行的情況。3.按照10 V/厘米的電壓電泳。確保膠的溫度不超過30，如果溫度升高，需要適當降低電壓。電泳至EMSA/Gel-Shift上

8、樣緩 沖液中的藍色染料溴酚藍至膠的下緣1/4處，停止電泳。4.剪一片大小和EMSA膠大小相近或略大的比較厚實的濾紙。小心取下夾有EMSA膠的膠板，用吸水紙或普通草紙大致擦干膠板邊 緣的電壓液。小心打開兩塊膠板中的上面一塊(注：通常選擇先移走硅烷化的那塊玻璃板)，把濾紙從EMSA膠的一側逐漸覆蓋住整個EMSA膠，輕輕把濾紙和膠壓緊。濾紙被膠微微浸濕后(大約不足1分鐘)，輕輕揭起濾紙，這時EMSA膠會被濾紙一起揭起來。把濾紙側向下，放平，在EMSA膠的上面覆蓋一層保鮮膜，確保保鮮膜和膠之間沒有氣泡。5.干膠儀器上干燥EMSA膠。然后用X光片壓片檢測，或用其它適當儀器設備檢測。EMSA實驗成功的關鍵

9、因素：1.試驗設計用藥品刺激細胞時,設計的藥品濃度和時間梯度的問題,這個很關鍵！總結建議:一是受體結合類的直接刺激激活信號通路的方法，一般達到EMSA核轉運高峰的時間比較短，大概控制在30min-2h之間，很多時候都是在45min和1h達到高峰，當然還有合適的濃度！二是用藥物刺激產生受體可能時間會長一些，因為藥物還有一個滲透和刺激產生細胞因子的過程。時間可以長一些,主要根據自己的藥物刺激特性確定時間點。2.核蛋白樣品的制備（1）注意用專用的核蛋白抽提試劑來做，才能使制備的核蛋白保持蛋白原有的天然活性和構像；（2）掌握好核蛋白的濃度和純度，尤其是濃度。能入核的蛋白本來就不是很多，所以核蛋白的濃度

10、往往不會很高，但是EMSA試驗對核蛋白的濃度要求還是比較高的! 一般要求在1ug/ul以上！有時候稍微低于這個數量級也可以，但是不能太低，否則影響結合反應拿不到結果。這就要求核蛋白抽提盡量避免核蛋白的損失。（3）同時，一般制備核蛋白的材料為細胞和組織，細胞要比組織好做的多，最重要的是用細胞得到核蛋白的純度比組織要高很多。而組織抽提后雜蛋白相對較多！雜蛋白多會不容易得到EMSA陽性結果！3.探針的制備: 生物素標記到3端還是5端？其實我覺得最好還是兩端都標記,這樣才能更好的提高靈敏度, 國內的標記技術我還不是很了解,我們這邊的探真都是國外定做的,還算可以,其制作程序如下: 合成寡核苷酸-標記生物

11、素-純化-退火合成雙鏈.也是一個比較復雜的過程。（在操作中會用到同位素，要注意實驗室環境和實驗員的保護）4.EMSA實驗技術要點（1）制膠 必須是非變性PAGE凝膠,我們實驗室一般用6.5%的非變性膠.制膠很重要,直接影響電泳的效果!一般控制在5分鐘凝固的效果.10X TBE 1.0ml40% Acrylamide（40%聚丙烯酰胺） 3.3ml50% Glycerol（50%甘油） 1.0mldH2O（蒸餾水） 14.8mlTEMED（四甲基乙二氨） 20l脫氣10min 10% AP（過硫酸氨） 120l總量 20.0ml（2）探針用量: 這相當于10-50fmoles的DNA探針。我們通

12、常是最少50fmol.（3）蛋白樣品用量: 一般用量在2-20ug(控制在1-5l)蛋白, 總體系15ul. 細胞核抽屜物濃度都比較低,組織的一般都比較高,因為雜蛋白較多.其他的對照的含義:. 常規反應(含激活的目的轉錄因子的核蛋白標記探針)； 陰性對照反應(核蛋白標記探針); 陽性對照(核蛋白標記探針) 探針冷競爭反應(含激活的目的轉錄因子的核蛋白標記探針標記探針100倍量的未標記探針)； 突變探針的冷競爭反應(含激活的目的轉錄因子的 核蛋白標記探針標記探針100倍量的未標記突變探針)； Super-shift反應(含激活的目的轉錄因子的核蛋白標記探針目的轉錄因子的特異抗體).（4）預電泳和

13、電泳：0.25X TBE在冰上120V 預電泳1小時; 務必換掉預電泳的緩沖液, 用新的0.25X TB低溫下150V，電泳約60分鐘。注意橫壓電泳的時候注意電流的數字變化,記錄開始電泳和電泳結束的電流數據的變化!（5）電轉運在0.5X TBE中390mA電轉移40分鐘, 注意轉運膜的選擇, 有一種離子加強型的轉運效果比較好! 我當初選擇過一般的和離子加強型的,還是離子加強型結合效果好!（6）紫外交聯: 正規的應該是紫外交聯儀的使用,但是很多單位沒有交聯儀,那就用無菌操作臺上的紫外等下10cm處交聯10分鐘就可以了!這個數據是我做了好多次試驗才摸索出來的!（7）化學發光反應包括Blocking Buffer 30分鐘封閉, Streptavidin-HRP標記, Washing Buffer洗滌; Equilibration Solution平衡, 這些按照規定操作即可! 沒有太多的細節,只是注