1、Primary cell cultureMethods in Cell Biology Cells that are cultured directly from a subject are known as primary cells. The cells can be removed from the tissue directly and disaggregated by enzymatic or mechanical means before cultivation. Primary culture refers to the stage of the culture after th

2、e cells are isolated from the tissue and proliferated under the appropriate conditions until they occupy all of the available substrate. MethodsTrypsin-digestion method, Explant culturePrimary culture Material：postnatal day 1 Sprague Dawley rat pups Reagents: PBS , DMEM, Supplemented DMEM/10% fetal

3、bovine serum and 100 units/ml penicillin/streptomycin , Trypsin, 75% ethanolMaterials and Reagents Empirical procedure（一）（一）Trypsin-digestion method 1 1、 proper sterile technique ( 75% ethanol )2 2、In a “clean bench” with a blowout hood, harvest cerebral cortex or liver and put them in tissue cultur

4、e dish.3 3、Rinse it with PBS , Place the sample on the lid of a tissue culture dish and use scissors to mince the cerebral cortex or liver into 1-mm3 pieces and Rinse 3 times with ice-cold PBS, Pour them into a 15-ml polypropylene centrifugal tube. F4. Remove the PBS by pipetting and immediately add

5、 5-6 ml/g tissue of trypsin(0.25%), making sure that the fluid is in contact with all of the tissue in the tube. Cap the tube and transfer it to 37 for 30 min, agitating every 5 to 6 min. Do this with sufficient vigor to break the digested tissue apart.5. Add DMEM with 20% fetal bovine serum, serum

6、or medium containing serum to inhibit further trypsin activity.6. Standing 5-10min, Carefully transfering single cell suspension into a fresh tube .7. Centrifuge the tube 5 min at 1000 rpm , decant supernatant.8. Resuspend pellet in PBS, Centrifuge the tube 5 min at 1000 rpm, decant supernatant. 9 9

7、、Add DMEM 1-2 ml, count the cells in three or four quadrants of a hemacytometer. 1010、Plate 5105 cells/ml in 5 ml of fresh complete growth in a 25-cm2 tissue culture flask. Place the culture in a humidified 37 C, 5% CO2 incubator （二）（二）Explant culture The tissue is harvested in an aseptic manner, mi

8、nced, the same as trypsin-digestion method. Four-step, 1-mm3 pieces are placed in a cell culture flask surface, reverse the flask gently, plus growth media in flask. Place the culture in a humidified 37, 5% CO2 incubator. 3-5 hours later, reverse the flask again, gently so as to avoid disturbing the

9、 pieces. use scissors to mince the liver or cerebral cortex into 1-mm3 pieces 1-mm3 pieces are placed in a cell culture flask surface Place the culture in a humidified 37C, 5% CO2 incubator n3-5 hours later, reverse the flask again 步驟（步驟（胰酶消化法胰酶消化法 ）1、將仔鼠頸椎脫臼致死，置、將仔鼠頸椎脫臼致死，置75%酒精泡酒精泡2-3秒鐘秒鐘,將仔鼠帶入超凈臺

10、內解剖取肝臟將仔鼠帶入超凈臺內解剖取肝臟(或大腦皮層等或大腦皮層等) ,置平皿中。置平皿中。 2、用、用PBS液洗滌三次，并剔除脂肪，結締組織，血液等雜物。液洗滌三次，并剔除脂肪，結締組織，血液等雜物。 3、用手術剪將肝臟剪成小塊（、用手術剪將肝臟剪成小塊（ 1mm3 ），再用），再用PBS液洗三次，轉移至離心管中。液洗三次，轉移至離心管中。4、視組織塊量加入、視組織塊量加入5-6倍的倍的0.25%胰酶液，胰酶液，37中消化中消化20-30分鐘，每隔分鐘，每隔5分鐘振蕩分鐘振蕩一次，或用吸管吹打一次，使細胞分離。一次，或用吸管吹打一次，使細胞分離。5、加入、加入3-5ml完全培養液以終止胰酶消

11、化作用（或加入胰酶抑制劑）。完全培養液以終止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制劑）。 6、靜置、靜置5-10分鐘，使未分散的組織塊下沉，取懸液加入到離心管中。分鐘，使未分散的組織塊下沉，取懸液加入到離心管中。 7、1000rpm，離心，離心10分鐘，棄上清液。分鐘，棄上清液。 8、加入、加入PBS液液5ml，沖散細胞，再離心一次，棄上清液。，沖散細胞，再離心一次，棄上清液。9、加入培養液、加入培養液l-2 ml（視細胞量），血球計數板計數。（視細胞量），血球計數板計數。 10、將細胞調整到、將細胞調整到5105/ml左右，轉移至左右，轉移至25ml細胞培養瓶中，細胞培養瓶中，37下培養。下培養。 組

12、織塊直接培養法組織塊直接培養法 自上方法第自上方法第3步后，將組織塊轉移到培養瓶，貼附步后，將組織塊轉移到培養瓶，貼附于瓶底面。于瓶底面。 翻轉瓶底朝上，將培養液加至瓶中，培養液勿接觸翻轉瓶底朝上，將培養液加至瓶中，培養液勿接觸組織塊。入組織塊。入37靜置靜置3-5小時，小時，輕輕翻轉培養瓶，使組織浸入培養液中（勿使組織輕輕翻轉培養瓶，使組織浸入培養液中（勿使組織漂起），漂起），37繼續培養。繼續培養。 TissueChop with Crossed Scalpels to 0.5-1.0mmTransfer pieces toflask with prewetted pipettesIncu

13、bate overnight underThin film of mediumMake up medium to usedVolume after 24-48 hrsAfter about 1 week cells can be seenMigrating radially from the explantWash by resuspension and settling 2-3X注意事項注意事項 1、 無菌操作無菌操作 2、細胞吹打、細胞吹打 3、實驗安全操作、實驗安全操作 原代培養原代培養（一）胰酶消化法（一）胰酶消化法 1、器材：將新生紅皮鼠用、器材：將新生紅皮鼠用75%酒精消毒，在超凈

14、臺內處死，解剖取肝臟酒精消毒，在超凈臺內處死，解剖取肝臟 （或大腦皮層等），置平皿中。（或大腦皮層等），置平皿中。 2、用、用Hanks液（或基培）洗滌液（或基培）洗滌2-3次，并剔除脂肪，結締組織，血液等雜物。次，并剔除脂肪，結締組織，血液等雜物。 3、用手術剪將肝臟剪成小塊（、用手術剪將肝臟剪成小塊（1mm3），再用），再用Hanks液洗三次，轉移至離心管中。液洗三次，轉移至離心管中。 4、視組織塊量加入、視組織塊量加入5-6倍的倍的0.25%胰酶液，消化胰酶液，消化20-30分鐘，每隔分鐘，每隔5-6分鐘振蕩一次，或用吸管吹打一次，使細胞分鐘振蕩一次，或用吸管吹打一次，使細胞分離。分離。

15、 5、加入、加入3-5ml培養液以終止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制劑）。（培養液以終止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制劑）。（ 懸液過篩網，去除未分散的組織塊或靜置懸液過篩網，去除未分散的組織塊或靜置5-10分鐘，使未分散的組織塊下沉，取懸液加入到離心管中。）分鐘，使未分散的組織塊下沉，取懸液加入到離心管中。） 6、 1000rpm，離心，離心5分鐘，棄上清液。分鐘，棄上清液。 7、加入完全培養液、加入完全培養液4-6ml（視細胞量），血球計數板計數。（視細胞量），血球計數板計數。 8、調整細胞密度，轉移至培養瓶中，、調整細胞密度，轉移至培養瓶中，37下培養。下培養。 （二）組織塊直接培養法（二）組織塊直接培養法 1.解剖取肝臟（或大腦皮