1、“海大1號”長牡蠣新品種四倍體的誘導及單體牡蠣培育模式的優化研究摘要 前言 牡蠣又稱海蠣子，蠔等，是一種世界性分布性的貝類，在大多數海域都有分布，牡蠣營養豐富肉質細嫩被贊譽為“海中牛奶”，牡蠣富含蛋白質、膽固醇、鈣、鐵維生素等營養成分，深受人們的喜愛，是重要的養殖貝類，我國具有廣闊的海上疆域，擁有長達18000km的海岸線，廣闊的海區條件和豐富的餌料使我國的貝類資源豐富，并為我國貝類養殖業的發展提供了良好的條件，我國的牡蠣養殖業可以追溯到宋代的插竹養殖，經過多年的發展牡蠣養殖已成為是我國養殖業的重要組成部分，我國的牡蠣養殖業發展已經較為成熟，自然海區的半人工采苗和工廠化室內人工育苗為牡蠣養殖業

2、提供了充足的苗種供應，筏式養殖灘涂播養等養成技術保證了成體牡蠣的供應，消費者的認同保證了牡蠣的銷路，牡蠣養殖業創造了巨大的經濟效益和社會效益，但是隨著養殖業的蓬勃發展，種質衰退、海區自然資源減少、養殖海區污染，引種混亂，發展路線低端牡蠣單位價值較低等問題日益凸顯，制約了我國牡蠣養殖業的發展。培育出生長更快，風味更好，抗逆能力更強的養殖新品種成為解決上述問題的理想方法。2014年3月24日，農業部公布了第五屆全國水產原種和良種審定委員會審定通過的15個水產新品種，由中國海洋大學水產學院貝類遺傳育種研究室培育的長牡蠣“海大1號” 獲得了水產新品種證書。長牡蠣“海大1號”是我國培育的第一個牡蠣新品種

3、，填補了我國牡蠣良種培育的空白，對實現海水養殖良種化，推動牡蠣養殖業持續、穩定、健康發展將起到重要促進作用。 “海大1號”是來以從山東乳山海區養殖的長牡蠣為基礎群體，使用群體選育的方法經過連續6代選育而成的，主要的選育指標是生長速度和殼形，該新品種具有生長速度快、殼型規則等特點，在相同的養殖條件下，15月齡平均殼高比普通長牡蠣苗種提高16.2%，總濕重提高24.6%，出肉率提高18.7%，殼形較美觀，整齊度明顯的高于普通商品長牡蠣，由于其生長快、個體大、殼形規則的特點，一經推廣就被養殖戶廣泛接受，創造了良好的經濟效益。但是在繁殖季節，由于牡蠣的性成熟及精卵的排放會導致牡蠣的生長停滯，肉質下降等

4、問題，在繁殖過后，又會因為體質虛弱導致大量死亡，影響了牡蠣在繁殖季節的口味和產品供應，而由于三倍體牡蠣的育性差，不會出現類似的情況（王昭萍等，2000；曾志南等，1999；），可以彌補傳統二倍體牡蠣養殖過程中在繁殖期出現的問題，同時三倍體牡蠣生長速度較快，個體較大可以縮短養殖周期具有較高的經濟價值（王昭萍等，1998；胡慶明等，1997；曾志南等，1999 Allen S K and Downing S L；Stanley J G et al 1984；Davis J P，1989），目前可以通過多種理化方法直接誘導牡蠣三倍體，常采用的化學誘導劑有6-二甲基氨基嘌呤、細胞松弛素B、咖啡因等，或

5、者使用溫度休克法或水靜壓等物理方法誘導，但是大多數方法三倍體誘導率無法達到100%，而且直接誘導獲得三倍體的方法不穩定，誘導過程易受到外界環境以及操作者水平的影響,各種理化處理方法還會對受精卵的存活產生影響，影響幼蟲的孵化。而且三倍體牡蠣不能進行自群繁殖，想要獲得三倍體苗種需要進行重復操作，工作量較大。對此理想的解決方法就培育出四倍體牡蠣，理論上四倍體牡蠣和正常的二倍體牡蠣雜交可以獲得100%的三倍體后代（Guo X et al，1996；闕華勇等，2003王昭萍等，2004），而且四倍體牡蠣可以正常繁殖,可以建立穩定的四倍體群體（施坤濤等，2006）,可以更加簡單有效的獲得三倍體，有利于三倍

6、體貝類的產業化推廣。由于養殖環境、品質等因素, 我國的牡蠣價格相對較低, 僅為國際市場價格20%左右，為了提高牡蠣的經濟價值，人們逐漸開始關注單體牡蠣的養殖，單體牡蠣具有形狀規則，大小均勻，方便收獲、加工和運輸的優點，而且單體牡蠣可以充分的利用水體，方便控制養殖密度，目前,國際上發達國家的牡蠣養殖主要采用單體牡蠣養殖的方式, 而我國單體牡蠣的研究起步相對較晚，單體牡蠣發展較為緩慢，單體苗種的供應和配套的養殖設施和技術都不甚完善。本次實驗將以“海大1號”長牡蠣新品種為研究對象，通過多種方式，探討“海大1號”長牡蠣新品種四倍體的誘導方式，為海大1號長牡蠣新品種的多倍體育種提供理論依據，同時實驗以腎

7、上腺素誘導獲得的對海大1號長牡蠣新品種單體牡蠣稚貝為實驗材料，從培育密度、水循環方式等方面入手尋找一種適宜的單體養成模式，提高單體牡蠣稚貝的存活率和生長速度。第一章文獻綜述第一節 “海大1號”長牡蠣新品種四倍體的誘導1 貝類育種的研究現狀 為了創造更高的經濟效益，解決牡蠣養殖業中暴露出來的一系列問題，科研工作者一直致力于具有優良性狀的新品種的培育和推廣，目前常見的新品種培育手段有選擇育種技術、雜交育種技術、雌核發育育種技術、雄核發育育種技術、多倍體育種技術等。 選擇育種技術：選擇育種又稱系統育種，是一種最基本的育種方法，通過對原始品種進行有目的有計劃的反復淘汰選擇，選擇出性狀可以穩定遺傳的符合

8、人們需要的新品種，是以現有品種在繁殖過程中的自然變異作為原始材料的育種方法。在貝類選擇育種研究方面選擇的目標大都是選擇出生長快速、規格大、抗逆性強、外形美觀的品種。我國比較成功的選擇育種的案例主要有包振民等選育出的櫛孔扇貝新品種“蓬萊紅”，李琪教授選育的長牡蠣新品種“海大1號”等。雜交育種技術：雜交育種指不同種群、不同基因型個體間進行雜交，并對其雜種后代進行培育和選擇最終育成新品種的方法。雜交育種是一種經典的育種方法，其應用非常廣泛，在農作物方面全球約有90%的育種是雜交育種近年來國內外的專家做了大量的工作，取得了一定成果，1995年Heath研究發現蝦夷扇貝和西北盤扇貝的雜交后代的抗派金氏蟲

9、病能力較強，呂豪開展了大連灣牡蠣和太平洋牡蠣雜交的實驗，實驗結果證明兩種牡蠣間的雜交是可行的（呂豪等，1994）。雌核發育育種技術：雌核發育是指用遺傳失活的精子激活卵，卵僅靠雌核發育成胚胎的現象，精子并不參與合子的形成，因為這種胚胎只有正常個體一半的染色體，所以胚胎并不能正常存活，但通過抑制極體的釋放或者抑制卵裂的方法等可以使細胞核核恢復到正常的染色體，從而可以正常的存活，雌核發育技術中主要使用紫外線照射使精子的遺傳物質失活，通過雌核發育得到的二倍體是純合的，有利于快速的建立高度純合的品系，因此受到了科學家的關注。雌核發育育種技術在鯰魚、羅非魚、真鯛等經濟魚類中取得了成功，在貝類中雌核發育的研

10、究相對滯后，但也取得了一些成果，李琪等成功誘導出了太平洋牡蠣雌核發育二倍體。但是人工誘導牡蠣雌核發育得到的幼蟲存活率較低，培養至成體的難度較大。雄核發育育種技術：與雌核發育相似，雄核發育是卵子失去遺傳活性僅靠精子的遺傳物質進行發育的方式，誘導后可以通過抑制第一次卵裂獲得可存活的二倍體個體，也可以通過兩個精子融合獲得二倍體個體在貝類中，雄核發育的誘導研究已經在長牡蠣和櫛孔扇貝中開展，但是沒有獲得可以成活的雄核發育二倍體。多倍體育種技術：多倍體通常指體細胞中含有三個或三個以上染色體組的生物個體，真核生物形成配子時進行減數分裂，得到四個染色體數目減半的配子，貝類的精子在排放時已經完成了整個減數分裂的

11、過程，但是卵子并沒有完成整個減數分裂的過程，在排放時一般處于減數第一次分裂的前期或中期，在受精后才能繼續進行減數分裂，最終才能受精，這一特殊現象為貝類的多倍體育種操作提供了可能性。 目前貝類多倍體育種的研究已經取得了很大的進展（Guo X and Allen S K，1994a；Guo X and Allen S K，1994b；Stanley J G et al，1981；Shen Y P et al，1993，Quillet E, Panelay P J et al，1986；Nell J A et al，1995；Mason K M et al，1988；Chaiton J A et a

12、l，1985； Komaru A and Wada K T，1989），誘導技術也日漸成熟，目前貝類三倍體主要通過各種理化學方法來抑制受精卵第二極體的釋放獲得，化學誘導方法主要是使用細胞松弛素B、6-二甲氨基嘌呤、咖啡因等化學誘導劑，常用的物理誘導方法有溫度休克法和水靜壓化學方法，在太平洋牡蠣（王昭萍等，2000；Allen S K et al，1986；Yamamoto S et al，1988； Allen S K and Bushek D，1992，于瑞海等，2002a；于瑞海等2002b；于瑞海等，2003；Akashige S and Fushimi T，1992；隋錫林等1997；

13、田傳遠等，1998；田傳遠等，2000；田傳遠等，1999a；田傳遠等，1999b；田傳遠等，1999c；田傳遠等，1999d；王菊生等，1999；于瑞海等，1994；于瑞海等，2001）、美洲牡蠣（Stanley J G et al，1981）、近江牡蠣（楊春玲等，1981）、大連灣牡蠣（梁英等，1994）、櫛孔扇貝（王清印和楊愛國，2000，王子臣等，1990；楊愛國等，2000）、蝦夷扇貝（王昭萍等2009；常亞青等2001a；常亞青等2001b）僧帽牡蠣（曾志南等，1994）皺紋盤鮑（Arai K et al，1986；顧勇杰等2010）多等種貝類中這些誘導方式都有被研究，但是這些誘導

14、方式都存在一定的缺陷，而四倍體牡蠣和二倍體雜交可以產生三倍體，理論上講這種方式可以獲得100%的三倍體后代，而且操作簡便易行，避免了使用理化處理對胚胎造成的不良影響，理論上講可以為貝類三倍體產業化提供一條簡便易行的途徑，但是這種方法需要培育貝類四倍體，人們對貝類四倍體育種的研究比貝類三倍體的研究要晚,貝類四倍體的誘導難度也更大。1988年,Stephens等通首次過抑制太平洋牡蠣受精卵第一極體的釋放獲得了四倍體幼蟲（Stephens L B and Downing S L，1988），而后國內外學者對太平洋牡蠣、美洲牡蠣（Supan J E et al，2000）、櫛孔扇貝、近江牡蠣（Alle

15、n S K et al，2003；容壽柏等，1992）、蝦夷扇貝、合浦珠母貝（孫振興等，1998）、貽貝（蔡國雄，1996）、地中海貽貝、菲律賓蛤仔、皺紋盤鮑（孫振興等，1998）、食用牡蠣（Gendreau S and Grizel H1990）等10余種貝類進行了四倍體育種研究，雖然在實驗中都獲得了四倍體胚胎或幼蟲,但有四倍體成體存活的僅在櫛孔扇貝、地中海貽貝、和菲律賓蛤仔中有報道（王昭萍等，2004）。1994年,Guo和Allen成功的獲得了存活的四倍體太平洋牡蠣（Guo X and Allen S K，1994），他們對之前誘導四倍體失敗的原因進行了分析，并嘗試利用太平洋牡蠣三倍體的

16、卵子與正常精子受精后抑制第一極體來誘導四倍體，最終獲得了成功,并將四倍體與二倍體雜交生產全三倍體的方法應用于生產中。此后,利用這種方法又在合浦珠母貝和美洲牡蠣（Guo X et al，2002）中培育出存活的四倍體。2貝類多倍體育種原理 一般情況下，貝類都是二倍體生物，既體細胞內包含有兩個染色體組，而多倍體指體細胞中含有多個染色體組的個體，通常使用物理或者化學方法改變正常二倍體受精卵的染色體組數目，經過發育后獲得多倍體。貝類的精子在排放時己經完成了整個減數分裂過程,而卵子在排放時一般停止在第一次減數分裂的前期或中期，并沒有完全完成減數分裂,只有在受精后才會完成剩余的減數分裂過程，完成兩個極體的

17、釋放、雌雄原核的融合，然后進入第一次有絲分裂階段，正是卵子的這種獨特的減數分裂過程為貝類多倍體育種操作提供了有利的時機和條件?；谪愵惇毺氐臏p數分裂過程人們可以方便的通過抑制極體的釋放來影響受精卵體內染色體的行為方式獲得貝類多倍體，除抑制極體的釋放外還可以通過各種理化手段抑制卵裂、細胞融合，人工雌核發育等方式影響細胞內的染色體數獲得多倍體。2.1抑制受精卵第一極體的釋放：抑制第一極體的釋放會導致第二次減數分裂過程中染色體行為的復雜化，會產生三倍體、四倍體、非整倍體的個體，以太平洋牡蠣為例，抑制第一極體的的釋放后，在隨后的過程中染色體分離有以下幾種方式：聯合二級分離；隨機三級分離；非混合三級分離

18、；獨立二級分離。2.1.1聯合二極分離：兩組二分體聯合成一體以二級分離的方式進行減數第二次分裂，20條染色單體以第二極體的形式被排出，另外20條染色單體保留在細胞核中。其結果是產生了MI三倍體18。2.1.2隨機三極分離：染色體分離過程中會形成三個紡錘體，兩組二分體合成一群后被隨機的分成三組，每組6至7個，在第二次減數分裂中期三組二分體分布在三極紡錘體的三個分裂面上，隨后進入減數第二次分裂后期，至末期時每一極都接受來自相鄰兩組的二分體分離出來的染色單體，最后最靠近卵子邊緣的染色體組作為第二極體排出，導致了非整倍體的產生18。2.1.3非混合三級分離：分裂過程中形成三個紡錘體，兩組二分體在進入三

19、極分離之前不結合或者重疊，其中一組二分體等分到兩個靠近邊緣的分裂面中另外一組二分體位于靠近內側的分裂面中仍然保持在一起，其中一套染色單體可能移動到邊緣一極作為第二極體被排出，其余的母本染色體和父本染色體結合而形成四倍體18。2.1.4獨立二級分離：分裂過程中形成四極紡錘體，兩組二分體各自以二極分離方式獨立進入第二次減數分裂，到第二次減數分裂末期時所有染色體被均分到四個極，然后排出不定數目的染色體作為第二極體，將會導致二倍體、三倍體、四倍體的產生18。2.2抑制受精卵第二極體的釋放：抑制受精卵第二極體的釋放后，染色體的行為相對簡單，可以使受精卵保留一組額外的染色體，產生三倍體個體。2.3抑制卵裂

20、：使用理化方法抑制受精卵的卵裂，使已經完成染色體加倍的細胞不能分裂，從而產生多倍體貝類。2.4細胞融合：使用物理或化學物質對細胞進行處理，使其細胞膜融合成為一個細胞，最終會產生多倍體貝類，通常以聚乙二醇作為細胞融合劑，或者通過電脈沖等方式誘導細胞融合。2.5人工雌核發育：雌核發育是指用遺傳失活的精子激活卵，卵僅靠雌核發育成胚胎的現象，精子并不參與合子的形成，因為這種胚胎只有正常個體一半的染色體，所以胚胎并不能正常存活，但是可以將其和其他化學方式結合，通過抑制極體的釋放或者抑制卵裂的方法使獲得多倍體貝類，通常使用紫外線、Y射線輻射處理或甲苯胺蘭、乙烯脲、二甲基硫酸鹽等化學物質處理使精子染色體失活

21、。3貝類多倍體常用誘導方法貝類多倍體的誘導研究主要集中在如何獲得三倍體和四倍體兩方面，通過各種理化方法干預受精卵的發育過程從而獲得預期的效果。貝類三倍體誘導的研究已經相對成熟，而對于誘導四倍體的研究起步相對較晚。3.1貝類三倍體的誘導方法：3.1.1化學方法：采用能夠抑制分裂的化學物質來干預細胞分裂的過程，從而獲得預期的效果，常用的化學藥品有細胞松弛素B，6-二甲氨基嘌呤，咖啡因等。細胞松弛素B（CB）：真菌的代謝產物，一般認為細胞松弛素B可以特異性的破壞微絲，抑制細胞的分裂，一般認為細胞松弛素B的有效的使用濃度是0.5-1.0mg/L，處理時間一般為10-15min，一般溶解到0.1%的二甲

22、亞砜中使用，雖然細胞松弛素B可以有效的誘導貝類三倍體但是因為其是劇毒物質有一定的致癌性所以在生產上已經禁止使用。6-二甲基氨基嘌呤（6-DMAP）：嘌呤霉素的類似物，是一種蛋白質磷酸化抑制劑，可以作用于特定的激酶，破壞微管的聚合中心，使微管無法形成。一般認為6-DMAP的適宜濃度范圍為300-450umol/L，處理持續時間10-20min，因為6-二甲基氨基嘌呤毒性較低且易溶于水，被認為是能夠替代細胞松弛素B的誘導劑?？Х纫颍杭毎至堰^程中構成紡錘絲的微管對Ca2+濃度非常敏感Ca2+濃度極低或者高于10-3時會引起微管二聚體的解聚，阻止分裂。一般認為咖啡因的有效濃度為5-15mmol/L,

23、處理時間10-15min。秋水仙素：秋水仙素不會影響合子或細胞內染色體的復制和分離,但是它可以抑制微管的組裝過程,并且會使已有的微管解聚,這樣就阻止了分裂過程中新紡錘體的形成并破壞己經形成的紡錘體,使得細胞的染色體加倍而不分離從而獲得多倍體。3.1.2物理方法：常用的物理方法包括溫度休克法和水靜壓法，近年來王昭萍等又發現了采用滲透壓誘導同樣可以誘導產生多倍體。溫度休克法：溫度休克包括冷休克和熱休克兩種，溫度休克可以引起細胞內酶構型的變化，從而影響酶促反映的進行，使分裂過程中形成紡錘絲所需要的ATP供應途徑受阻，影響細胞的分裂,由于溫度休克法成本較低、操作相對簡單,經常被用于多倍體的誘導。水靜壓

24、：使用液壓機等加壓設備對處理對象施壓，可以阻礙紡錘體微管和微絲的形成，抑制細胞的分裂。低滲誘導：是近年來提出的誘導多倍的方法，通過將處理對象放置到低滲環境中的方法抑制細胞的分裂，王昭萍等認為低滲可能會引起能量代謝的紊亂，影響微管微絲的形成，可以組織極體的釋放從而形成多倍體。姜衛國等誘導合浦珠母貝多倍體的研究表明，在實驗所設的范圍內，使用細胞松弛素B誘導三倍體適宜的處理時間為15min左右，適宜的處理濃度為1.2-2.0mg/L，各個實驗組的結果表明在水溫27.9-29.9的環境下，受精后3min使用濃度為1.2-2.0mg/L細胞松弛素B處理受精卵15min時可以獲得的三倍體率為40.4-47

25、.2%，但是處理后的受精卵孵化率較低，低于8%，在水溫為28的環境中在受精后17min進行誘導時，使用1.2mg/L的細胞松弛素B誘導15min就可以獲得76.8%的三倍體率（姜衛國等，1987）。李永仁等在使用細胞松弛素B抑制第二極體釋放從而獲得菲律賓蛤仔三倍體的實驗中發現：0.5mg/L與0.75mg/L細胞松弛素誘導率較高，分別達到89.4%和89.2%，實驗過程中以極體釋放的比率為參考確定誘導時機和時間，在對照組受精卵出現第一極體的比例達50%時加入細胞松弛素B處理，處理至對照組出現第二極體的受精卵比例達到50%止，實驗發現細胞松弛素B濃度和胚胎發育速度呈負相關，與各發育階段的畸形率呈

26、正相關，綜合考慮下認為0.5mg/L是誘導菲律賓蛤仔三倍體的適宜濃度。林岳光等人研究發現使用0.5mg/L的細胞松弛素B抑制華貴櫛孔扇貝第一極體的釋放時可以獲得44.1%的三倍體，而抑制第二極體的釋放可以獲得90.2%的三倍體。楊蕙平等使用細胞松弛素B誘導蝦夷扇貝多倍體的研究表明在0.6mg/L的細胞松弛素的作用下，通過抑制第一極體獲得了3.96%的三倍體，同時抑制第一極體和第二極體的釋放獲得的三倍體率為2.42%，實驗過程中出現了大量的五倍體和非整倍體。秦艷平等對香港巨牡蠣的研究表明在溫度2830 ，鹽度為15-25，受精卵密度為2×108時，采用0.5 mg/L的CB在受精后15

27、18 min處理，誘導持續時間為20 min，可產生100%三倍體。李霞等人對細胞松弛素B，咖啡因，6-二甲基氨基嘌呤誘導皺紋盤鮑多倍的機理進行了研究，實驗中使用的藥物濃度分別為細胞松弛素0.5mg/L，6-二甲基氨基嘌呤90umol/L，咖啡因50mmol，誘導時間分別為20min、15min、10min，在染色觀察誘導處理后染色體行為的過程中發現了聯合二級分離、獨立二級分離等分離方式，可以誘導產生三倍體。容壽柏等人分別使用冷熱休克的方法誘導獲得了近江牡蠣的三倍體，其中低溫休克溫度為10，高溫休克溫度為35，在受精后25min開始誘導，誘導處理20min，獲得的三倍體率分別為69%和64%，

28、嚴正凜等利用冷休克規?；T導雜色鮑三倍體時，在受精后15min后處理，處理溫度為13.5-14，處理持續時間為10至15min，這些組合中獲得稚貝在兩年的檢測中三倍體率分別為51.7%和70%，誘導九孔鮑時使用的組合為處理時間13.5min，處理溫度為13-13.5處理持續時間為15-18min，稚貝階段兩年的三倍體率分別為54.5%和63.3%，田傳遠等采用低溫休克誘導太平洋牡蠣三倍體時發現，采用4-5的處理溫度，在授精15min之后處理15min可以獲得較好的誘導效果，三倍體誘導率為36.8% Arai K 等對皺紋盤鮑的研究表明，在受精之后12min或者32min使用3冷休克誘導處理15

29、min或者使用35誘導處理15min都可以抑制第一極體或者第二極體的釋放獲得三倍體，或者在受精后7min或22min后使用200kg/cm2的壓力抑制極體的釋放也可以獲得三倍體。 3.2貝類四倍體的誘導方法：貝類四倍體誘導所用的方法和三倍體誘導的原理大致相同，都是通過各種理化手段改變受精卵內的染色體數，然后經過胚胎發育獲得四倍體個體。在初始研究階段人們試圖通過直接通過抑制第一極體、同時抑制兩個極體的釋放、抑制第一次卵裂、細胞融合和人工雌核發育等方法由二倍體貝類直接誘導獲得四倍體貝類,這些方法都能誘導出四倍體的胚胎或者幼蟲但是培育出存活的四倍體少有報道18。1988年Stephers等首次使用1

30、mg/L的細胞松弛素B誘導太平洋牡蠣四倍體獲得了四倍體幼蟲，誘導率達91%。Scarpa等在地中海貽貝受精后7min到35min的時段內使用1mg/L的細胞松弛素B進行處理，同時抑制了第一極體和第二極體的釋放獲得了18%的四倍體，并且在一個月之后的檢測中仍檢測到了四倍體。Gendreau等在誘導歐洲食用牡蠣四倍體時，使用細胞松弛素濃度為1mg/L，處理時間為20min，分別選在受精后5min及260min進行誘導處理，分別的獲得了40%和53%的四倍體率。田傳遠等在使用6-二甲基氨基嘌呤誘導太平洋牡蠣四倍體的過程中發現，人工授精20min后，使用450umol/L的6-二甲基氨基嘌呤處理10m

31、in后可獲得40%的四倍體誘導率。常亞青等在研究蝦夷扇貝四倍體的過程中使用了多種化學物質進行實驗，實驗采用觀察正常受精卵發育情況的方法確定誘導時機及誘導時間，實驗發現使用細胞松弛素B、A-二甲基氨基嘌呤秋水仙素抑制第一次卵裂誘發四倍體的比例低于25%,使用細胞松弛素B在抑制第一極體可有效的產生四體，在12時在授精后20-22min開始處理在62-67min終止處理可以獲得56.5%的四倍體率。楊蕙萍等使用細胞松弛素B誘導櫛孔扇貝四倍體時發現在20的條件下，卵子受精后10min，分別誘導10min、20min抑制第一極體的排出獲得的四倍體率為39.75%和30.24%，在授精后1h分別處理10、

32、15、20、25min以抑制第一次有絲分裂獲得的四倍體率分別為21.36%、27.57%、28.41%、29.35%，Ximing Guo等使用0.5mg/L的腎上腺素誘導美洲牡蠣四倍體時，從受精后10min開始處理，處理至受精后30min成功的獲得了四倍體，容壽柏等人研究了使用溫度休克抑制第一次卵裂來誘導近江牡蠣四倍體的方法，實驗結果表明冷休克組的最佳誘導溫度為10，熱休克組以39為最佳，獲得的早期胚胎的四倍體率分別為30%和28%，Guo等利用35-40的溫度通過抑制第一次卵裂的方式成功的獲得了45%的四倍體。Guo等使用聚乙二醇(PEG)為融合劑,利用細胞融合的方法誘導太平洋牡蠣四倍體,

33、結果表明:合子間融合的效果較好,但是四倍體比例較低，精子間融合效果不理想，2細胞分裂球間的融合產生了30%的四倍體,但是未能成活（Guo X and Hershberger WK，1988）。包振民等利用PEG和脂質體進行了皺紋盤鮑的合子融合實驗,獲得的四倍體率分別為25%和12%（包振民，1997）。Cdaoret等通過600v/cm的電脈沖誘導2細胞期的分裂球融合的方法在太平洋牡蠣中獲得了20%的四倍體胚胎，在貽貝中獲得了26%的四倍體胚胎（Cadoret J P，1992）。雖然直接利用二倍體產生四倍體的方法多有研究，但是極少有報道獲得了成活的四倍體，推測是因為四倍體的核較大，正常二倍體

34、的卵子較小，在卵裂過程中細胞數目不足引起個體死亡(Guo，1994),因此人們開始研究使用三倍體來誘導四倍體的方法，因為三倍體的卵子體積較大，可能有利于四倍體的存活，通過這種方法Guo等嘗試了利用三倍體產生的卵與正常精子受精后抑制其第一極體排放的新方法,成功的獲得了存活的四倍體太平洋牡蠣，并且在其性腺發育成熟后，通過和正常的二倍體雜交獲得了全三倍體后代，為三倍體的產業化發展提供了一種新途徑，具有很高的應用價值(Guo1996)。4影響貝類多倍體誘導的因素貝類多倍體的誘導效果會受到多種因素的影響，一般來講誘導處理的強度、時機和處理的時間最為重要。適宜的誘導條件應當滿足誘導率較高，對生物的負面影響

35、小的條件。誘導處理強度：在使用化學方法誘導貝類多倍體的實驗中，往往會出現在一定的范圍內多倍體誘導率與使用誘導劑的濃度呈正相關的關系，在超過一定值后誘導率變化不大甚至出現降低的情況，而且現有的理化處理手段往往會對受精卵造成一定程度的損害，影響之后的生長發育過程。因此，應根據處理對象的不同、綜合考慮多倍體誘導率和后續的生長發育情況和來確定出最佳處理強度誘導處理的時機：目前誘導貝類多倍體多是通過抑制PB1或者PB2的釋放獲取多倍體。因此對于處理時機的把握十分重要，受溫度、性腺發育狀況等因素的影響，受精卵排放極體的時間不盡相同，因此處理時機不能一概而論，為了優化處理時機的把握，Allen等提出了以第一

36、極體PB1或第二極體PB2出現的比率作為確定誘導時機的指標()。在多數經濟牡蠣品種和扇貝經濟品種在PB1出現30-50%是誘導可得最大三倍體率34-37；有的則在受精卵釋放出第一個第二極體時處理可檢測到三倍體誘導率最大。誘導處理時長：誘導時長需要能夠保證受精卵獲得充分的處理又需要降低處理條件對于受精卵造成的不良影響，不同種的貝類最適誘導時長不盡相同，根據以往研究，處理時長一般在15-20min最佳，也有實驗中以對照組的發育情況的參照確定處理時長。此外配子的質量及受精卵發育的同步性也會對誘導效果產生影響，由于實驗過程中卵子往往來自不同的母本，卵子的發育程度不盡相同，受精能力及受精后發育速度會存在

37、不同，會影響對處理時機的把控，為了避免這種情況在實驗中應當盡量選取配子發育良好的實驗材料，或者可以通過解剖獲得精卵后使用5-羥色胺等進行促熟，然后再進行受精及誘導操作，用于誘導的化學試劑往往存在毒性，會對受精卵的發育造成一定的損害，造成孵化率低等問題。在誘導過程中造成的染色體數目和結構的異常變化(孫振興等1998)也是造成多倍體胚胎存活能力差的原因。5倍性檢測方法目前,在貝類多倍體誘導研究中,常使用染色體分析法和流式細胞術對實驗對象進行倍性檢測。染色體數目分析鑒定貝類是最直接可靠的方法，在檢測倍性方面有廣泛的應用，基本原理是對對貝類早期胚胎、擔輪幼蟲或幼貝的鰓組織等進行染色,壓片或滴片后對其進

38、行觀察計數，通過對比其與已知倍性的染色體數目的對比確定倍性組成（李慷均，2004），常用染色劑包括蘇木精一鐵明礬、乙酸一地衣紅或Giemas染液等。流式細胞儀是對細胞進行自動分析和分選的裝置。它可以快速的測量并顯示懸浮在液體中的細胞的一系列重要的生理、生化特征。使用流式細胞儀測定倍性的原理在于流式細胞儀可以檢測出每個細胞的熒光強度，當由特異性的染料染色后的細胞經過儀器時，儀器可以使用激光或者紫外光激發細胞核上的熒光染料，因為DNA的含量存在差異所以熒光強度也存在差異，將我們得到的熒光強度和己知的二倍體細胞的熒光強度進行對比,就可以判斷被檢細胞群體的倍性組成。.第二節 單體牡蠣培育模式的優化 1

39、 雙殼貝類附著變態的研究 貝類成體大多數營附著、固著、埋棲或匍匐等生活方式，而其幼蟲營浮游生活，在形態生活方式等等方面與成體有很大區別，幼蟲需經歷一系列的發育階段才能轉變為成體，多數雙殼貝類在發育過程中都要經過附著變態的過程，附著變態是雙殼貝類從幼蟲向成體轉變的一個重要發育階段。能否順利附著變態對種群的數量有著巨大的影響，可以直接決定苗種生產的成敗。研究貝類幼蟲的附著變態過程及其機理有重要的應用價值，研究其機理有助于闡明他們的種群數量變動，同時可以借助誘導物誘導幼蟲的附著變態，促進重要經濟貝類增養殖的發展。 人們從分子水平，生理水平和生態水平三個不同的層次對于附著變態進行了研究。目前人們對一些

40、重要經濟貝類的附著變態機理研究比較深入。目前,有關海洋無脊椎動物幼蟲附著變態的模型3個:雙調控模型；上行調節模型；脂肪酸調節模型。雙調控模型以牡蠣為代表，Coon等認為牡蠣幼蟲的附著變態是由多巴胺行為途徑和腎上腺素行為途徑兩種方式控制著的。當外界條件適宜時，牡蠣幼蟲會分泌多巴胺，從而激活行為途徑，行為途徑激活后牡蠣幼蟲對外界環境的感覺更敏感，在外界環境適宜的情況下幼蟲體內會分泌腎上腺素或去甲腎上腺素，腎上腺素或者去甲腎上腺素作用于靶組織誘導牡蠣幼蟲的變態。上行調節模型以鮑魚為代表，Baxter等認為紅鮑的附著變態由形態發生途徑和調控途徑控制，在兩種途徑的影響下使得紅鮑幼蟲對外界環境變得敏感。其

41、中環磷酸腺苷（cAMP）作為形態發生途徑的第二信使，能夠激活蛋白激酶A，使細胞產生去極化，而調控途徑以甘油二酯（DG）和磷脂酰肌醇（IP3）作為第二信使，通過激活蛋白激酶C使細胞產生去極化。脂肪酸途徑以多毛類為代表，Jensen等人認為幼蟲細胞內的由脂肪氧合酶分解不飽和脂肪酸產生的小分子物質是這一途徑的第二信使，激活了細胞膜上的K+通道，從而使得幼蟲變態（張濤，2000）。幼蟲在發育到一定階段后就具有了附著變態的能力，在適宜的環境中會尋找適宜的附著基完成附著變態。附著變態是一個復雜的過程，分為附著和變態兩步，附著過程是選擇合適的附著基的過程，是可逆的，而變態過程是形態變化過程，是不可逆的。幼蟲

42、尋找適宜附著基的過程可分為3個階段：1大范圍探索階段，幼蟲主要是沿直線爬行，從一個地點轉移到另一個地點；2小范圍探索階段， 探索步調縮短增加同時探索方向改變的頻率；2檢查階段，在這個階段，幼蟲在很小范圍內探索附著地點適宜情況，在它體長范圍內旋轉移動。幼蟲變態后在形態生活習性上都會發生很大的變化，幼蟲完成變態有三個主要標志：1形成含有鈣質的次生殼2面盤萎縮退化，鰓形成開始用鰓呼吸攝食3生活習性發生改變，變態前幼蟲多營浮游和匍匐生活，變態后轉變為成體的生活方式主要營附著、固著、匍匐或埋棲生活（張濤，2000）。貝類附著變態會受到物理因素、化學因素等很多因素的影響，物理因素主要有鹽度、溫度、附著基、

43、溶解氧、流速、和光照等。化學因素主要包括金屬陽離子、兒茶酚胺化合物、氨基酸類化合物、膽堿及其衍生物、影響細胞內環化腺苷酸的化合物五大類。幼蟲本身的健康狀況、同種個體的分泌物、微生物膜、餌料分泌物也可以影響幼蟲的附著變態。對于影響貝類附著變態的研究有很多（楊智鵬等，2016；吳寶玲等，1999；李成華等2003），何義朝等發現墨西哥灣扇貝在度為28-30時具有最高的變態發生率，在溫度23.4-27.5時，變態率無明顯變化，在溫度高于31時變態率急劇下降（何義朝等，1999），海灣扇貝適宜的變態鹽度在23.8-26.8的范圍之內（何義朝和張福綏，1990），對于不同附著基對毛蚶幼蟲附著變態影響的研

44、究表明深色的附著基附著效果要優于相同材質的淺色附著基的效果，不同材料的附著基的幼蟲附苗量也不同（高霄龍等，2013），于瑞海等的研究表明KCI可以影響海灣扇貝的附著變態，影響效果的溶液濃度及處理時間都相關， 30mmol/L的KCI溶液處理12h可以顯著的促進海灣扇貝的附著變態（于瑞海等，2001）。對于羊鮑的研究也表明氨基丁酸（GABA）、氯化鉀溶液都可以影響羊鮑的附著變態，經過濃度為10-4mol/L的GABA誘導72h后羊鮑的附著率和變態率分別可以達到26.27%和22.26%，而10-5mol/L的5-羥色胺誘導72h后，羊鮑附著率為20.73%變態率為20.18%，氯化鉀溶液雖然對羊

45、鮑的變態沒有促進作用但是可以促進羊鮑的附著過程（丁敬敬，2016），對西施舌附著變態的研究也證明了腎上腺素、氨基丁酸、左旋多巴、Ca2+可以影響到附著其變態過程（高如承和劉文彪，2006），對葡萄牙牡蠣的研究表明K+、Ca2+、Mg2+等金屬陽離子可以影響到葡萄牙牡蠣的附著變態（祁劍飛，2013）。 2單體牡蠣的研究現狀目前牡蠣育種及養殖過程中，普遍以扇貝殼作為附著基，使牡蠣幼蟲固著在扇貝殼上，再將苗種轉移至海區進行養成，在收獲時需要將牡蠣從附著基上剝離下來，并將在生長過程中固著到一起的牡蠣分離開，這需要大量的勞動給牡蠣的收獲帶來了不便。而且數量較多的牡蠣固著在一起生長，導致其生長空間受到限制

46、，牡蠣之間相互擠壓導致其殼形不規則不美觀，同時由于對食物空間等的競爭，使養殖牡蠣的生長速度不同，個體間的差異較大。而單體牡蠣在養殖過程中，可充分利用水體，在適宜的養殖密度下不存在對空間的競爭，個體能充分生長，殼形規則美觀，對食物的競爭也比較小，可以充分發揮牡蠣的生長潛力，這些條件都利于提高牡蠣的經濟效益，因此人們開始探索單體牡蠣的生產方法，目前常用的生產單體牡蠣的方法有：腎上腺素（EPI）或去甲腎上腺素（NE）處理法、顆粒固著基采苗法、先固著后脫基法三種。國外對于單體牡蠣的研究較早，1974年Hidu H等使用拋光大理石作為牡蠣附著基然后將附著的稚貝剝離下來形成單體（Hidu H et al，

47、1974），1981年Breber P.等對單體牡蠣的養成設備進行了研究（Breber P，1981），隨著對雙殼貝類附著變態機理的研究人們發現腎上腺素和去甲腎上腺素可以只誘導牡蠣幼蟲變態而不誘導其附著，在1986年Steven L.Coon等研究了使用腎上腺素和去甲腎上腺素誘導生產太平洋牡蠣及美洲牡蠣單體苗種的方法（Coon S L. et al，1986；Coon, S. L,王昭萍,1989）。目前太平洋牡蠣、美洲牡蠣、歐洲牡蠣等品種的單體牡蠣養殖模式在歐洲和美洲已為一種常見的養殖方式（楊愛國等，1995），且市場對單體牡蠣的需求量較大，創造了很高的經濟價值。而我國單體牡蠣的研究開始較晚

48、，1987年有報道從美國引進單體牡蠣在威海試養成功，我國也有養殖戶將自然海區中固著到巖石上的牡蠣苗剝離后作為單體牡蠣進行養成，在乳山灣一帶,人們將海邊巖石上自然固著的褶牡蠣苗剝下,進行灘涂播養，播養的牡蠣生長速度快于自然狀態下的牡蠣,但是剝離自然苗種需要大量的勞動力，而且在操作過程中容易對幼苗造成損傷，導致幼蟲的死亡率較高（李石磊和常亞青，2007）。腎上腺素及去甲腎上腺素在牡蠣附著變態過程中的作用被發現后，我國科研工作者也逐步開始這方面的研究，1991年于瑞海探究了有關單體苗種的生產技術（于瑞海，1991），1992年王昭萍等研究了腎上腺素和去甲腎上腺素對褶牡蠣的誘導效果（王昭萍等，1992

49、），1993楊愛國等通過先附著后脫基，腎上腺素誘導兩種方式獲得了太平洋牡蠣單體（楊愛國等，1993）。對單體牡蠣的后期養成也有研究報道（王華青等，2013；李石磊等，2013；姚瑤等2016），如姚振剛等對太平洋牡蠣單體籠養高產技術進行了研究，成功摸索出了一套高產技術（姚振剛和劉頗賢，1998），對單體三倍體牡蠣的培育也多有報道和研究（于瑞海，2005；李奕雯，2013；王昭萍，2003；于瑞海，2006；于瑞海，2008），對葡萄牙牡蠣（陳亨，2016）、熊本牡蠣（王昌勃，2016）、近江牡蠣（丘廣艷，2016）、香港巨牡蠣（陳洪發，2015）等不同品種牡蠣誘導單體研究也相繼開展。目前我國單

50、體牡蠣還沒有規?；酿B殖，主要原因在單體牡蠣苗種的供應較少，而且單體牡蠣的育種養成和傳統牡蠣的養成方式有很大的區別，單體牡蠣的中間培育技術還不成熟，在養殖過程中特別是在牡蠣個體較小時的死亡率較高，限制了單體苗種的數量，同時養殖戶也缺乏相關的配套設施及養成經驗。雖然誘導單體牡蠣的研究已經開展多年，但是多集中于將牡蠣誘導為單體這一過程，對后續的培育方法鮮有研究，因此探索一種適宜的養殖模式，實現單體牡蠣養殖的規?；梢詷O大的促進牡蠣養殖業的發展，創造巨大的經濟效益。3獲取單體牡蠣的常用方法目前常用的單體牡蠣生產方法主要有：腎上腺素（EPI）和去甲腎上腺素（NE）處理法、顆粒固著基采苗法、先固著后脫

51、基法三種。 3.1腎上腺素去甲腎上腺素處理法：腎上腺素和去甲腎上腺素可以只誘導牡蠣幼蟲變態而不誘導其附著，在牡蠣幼蟲即將附著變態時使用一定濃度腎上腺素或者去甲腎上腺素誘導一定時間可以使牡蠣幼蟲直接變態而無需附著，從而直接獲得單體牡蠣。Steven L Coon 等的研究表明，腎上腺素和去甲腎上腺素誘導太平洋牡蠣和美洲牡蠣的最適濃度為10-4mol/L，處理1小時后幼蟲變態率基本接近最大值，但是隨著誘導時間延長至24小時，變態率還會有一定的升高，實驗中使用腎上腺素誘導24小時幼蟲變態率大于90%，同時實驗發現去甲腎上腺素的效果比腎上腺素誘導的效果差一些，在Steven L Coon實驗的基礎上楊

52、愛國等人對腎上腺素誘導太平洋牡蠣單體的條件進行了進一步的實驗，實驗使用腎上腺素濃度梯度為5×10-6 mol/L，10×10-6 mol/L，20×10-6 mol/L，30×10-6 mol/L，誘導時間梯度設定為0.5h至2h在實驗中發現在隨著腎上腺素藥物濃度由低到高牡蠣幼蟲的不固著變態率也逐漸升高，而20×10-6 mol/L，30×10-6 mol/L組的不固著變態率基本相同，而對于處理時間的實驗表明處理0.5h的不固著變態率明顯較低，當處理時間延長至1h后不固著變態率有顯著的增加，而處理1-2小時的效果基本相同，所以認為較適

53、宜的腎上腺素濃度為20×10-6 mol/L而較適宜的處理時間為1h，同時通過進一步的分析認為如果藥物濃度降低需適當的增加處理時間，隨著藥物濃度的增加誘導時間可以相應縮短，王昭萍對單體褶牡蠣的研究表明，腎上腺素和去甲腎上腺素誘導的最適濃度為10-4 mol/L，最適處理時間為3h，幼蟲的的不固著變態率分別達到47.7%和46.6%，延長誘導時間不固著變態率增加的不明顯，在誘導褶牡蠣不固著變態的實驗中腎上腺素和去甲腎上腺素的誘導效果差異不明顯，誘導過程對稚貝的生長發育沒有明顯的影響，王昌勃等對腎上腺素誘導熊本牡蠣單體的實驗中發現，腎上腺素誘導的最適濃度為10-4mol/L最佳誘導時間為

54、1h，實驗還探究了熊本牡蠣適宜的誘導密度，最佳誘導密度為1000ind/ml，同時研究發現腎上腺素誘導的濃度過高，誘導的時間過長會對稚貝的存活造成影響，陳亨等誘導葡萄牙及太平洋牡蠣單體時發現葡萄牙牡蠣對腎上腺素耐受性較強，最適宜誘導濃度為5×10-4mol/L，在此最適濃度下最佳處理時間為12h，對太平洋牡蠣的實驗中發現腎上腺素濃度為5×10-5mol/L及 10-4mol/L兩者誘導效果差異不顯著，綜合考慮認為適宜誘導濃度為5×10-4mol/L，在此濃度下最佳誘導時間為8h。3.2顆粒固著基采苗法：采用微細顆粒作為牡蠣幼蟲的固著基，使每個顆粒上固著少一個牡蠣，

55、這樣獲得的牡蠣苗種還是單個的游離的。王昭萍等利用貝殼粉做為固著基獲得單體時發現在0.15-0.35mm的顆粒固著基中，幼蟲只固著與偏大的顆粒上，且單體率大100%，小于此范圍的顆粒上未見有幼蟲附著，而大于此范圍顆粒上雖然幼蟲固著較多，但存在同時固著兩個稚貝的現象，Hidu等的研究也表明用0.30ram的顆粒做幼蟲固著基較好，因此在使用顆粒固著基時應當選用與幼蟲大小相仿的顆粒，可以使幼蟲順利的固著同時也避免多個幼蟲附著到同一顆粒的情況。3.3先固著后脫基法：是使幼蟲先固著后脫離固著基成為單體牡蠣的方法，1974年Hidu H等使用拋光大理石作為牡蠣附著基，然后將牡蠣剝離獲得單體，我國部分地區也有

56、將天然生長的牡蠣剝離開作為單體養殖的記錄，在牡蠣的人工育苗過程中也有采用合適的附著基進行固著后脫基處理獲得單體的生產方式，材料要求適宜牡蠣幼蟲附著變態，同時應有一定的光滑度或應易彎折以方便牡蠣單體的剝離，當牡蠣幼體生長到一定規格時進行再進行脫基處理，以減少脫基處理對牡蠣造成的損傷。楊愛國等使用聚丙烯扁條包裝帶編織成固著基供牡蠣附著并在后期進行脫基處理獲得單體，實驗發現幼蟲在剛固著時或固著后不久不宜進行脫基處理，此時幼蟲個體較小，次生殼薄且脆弱，脫基處理對幼蟲的損害嚴重，當牡蠣生長至殼高達0.5cm時適宜進行脫基處理，王昭萍等探索過使用淺灰色塑料板、貝殼、波形瓦片等不同材料附著基然后獲得單體褶牡

57、蠣的方式，對于貝殼等材質較硬且表面較粗糙的固著基而言脫基處理較為困難，對于塑料板，網片等較柔軟的材料可以采用彎折揉搓的方法使牡蠣幼蟲脫離固著基，但仍需待牡蠣殼長達1-2cm時進行，王昌勃等在熊本牡蠣單體苗種的發現使用灰色聚乙烯波紋板作為固著基時，幼蟲易附著，剝離方便，獲得的單體顯著高于篩絹網，塑料薄膜，網衣等材料，是一種較理想的固著基。第二章“海大1號”四倍體的誘導 二倍體牡蠣雖然可以通過抑制第一極體釋放、同時抑制兩個極體釋放、細胞融合、抑制細胞卵裂等多種方式誘導獲得四倍體的胚胎或者幼蟲，但是少有報道稱獲得存活的四倍體成體，而Guo等利用三倍體太平洋牡蠣的卵子和正常二倍體太平洋牡蠣精子受精后抑

58、制第一極體釋放的方式首次獲得了具有成活力的四倍體牡蠣，并且所獲四倍體能夠發育至性腺成熟具有繁殖力。因此本實驗將使用“海大1號”三倍體牡蠣為材料進行四倍體的誘導。 Desrosiers 等使用新的誘導劑6-二甲基氨基嘌呤誘導獲得了太平洋牡蠣三倍體（Desrosiers R R et al，1993），之后6-而甲氨基嘌呤逐漸成為誘導貝類多倍體的常用化學藥物，它的毒性較低，對受精卵和胚胎造成的損傷相對較小，且易溶于水方便操作，被認為是能夠替代細胞松弛素B的理想誘導劑；近年來王昭萍等發現低滲可以抑制極體的釋放從而產生多倍體，低滲能夠誘導貝類三倍體的產生以被多個實驗證實，使用低滲誘導貝類多倍體操作方便

59、，成本低廉，可以避免傳統誘導方式中化學藥物對操作者的潛在威脅，是一種理想的手段。在本次實驗中將對滲透壓、6-二甲基氨基嘌呤誘導“海大1號”四倍體的效果進行探究，探尋它們適宜的誘導強度、誘導時機、誘導時間的組合以獲得海大1號誘導四倍體的最佳條件。1實驗材料和方法1.1實驗材料與器材實驗材料：實驗于山東省萊州市長漁水產有限公司進行，實驗用“海大1號”三倍體親貝全部經流式細胞術確定倍性為三倍體，和 “海大1號” 二倍體親貝一起在育苗車間內進行促熟培育，培育過程中進行投餌換水等日常管理，待性腺發育較好時待用實驗器材與藥品：6-二甲基氨基嘌呤，海鹽，純凈水，鹽度計，20L塑料桶，50ml、100ml、500ml、2000ml燒杯，吸管，胚胎皿，顯微鏡，500目篩絹，解剖刀，蓋玻片，計時器等。 1.2試驗方法1.2.1精卵的獲取和授精卵子的獲得：選取“海大1號”三倍體進行解剖，通過顯微鏡檢查區分雌雄，鏡檢過程中需特別注意觀察有無雌雄同體個體