1、主要內容：第一章基因操作的基本技術核酸制備；質粒及質粒載體；細菌的轉化；凝膠電泳；核酸探針；限制性內切酶、酶切圖譜及分子克隆用酶第二章PCR技術第三章核酸分析與合成第四章噬菌體載體及粘粒第五章目的基因的準備和重組及重組子的鑒定第六章基因在原核及真核體系中的表達真核基因在大腸桿菌中的表達；哺乳動物基因工程；研究DNA與蛋白質相互作用的方法第七章植物基因工程第八章基因工程研究進展人類基因組計劃；基因診斷、基因治療和轉基因；反義技術序言：1什么是基因工程？基因工程是如何誕生的？答：在體外將核酸分子插入病毒、質粒或其他載體分子中，構成遺傳物質的新組合，并使之摻入到原先沒有這類分子的宿主細胞中，并能持續

2、穩定的繁殖。2. 基因工程的兩個基本特征？答：(1)跨越天然的物種屏障(2)確定的DNA擴增基因工程的步驟和內容？答：酶切分離目的基因-重組DNA分子-轉移至受體細胞增殖-獲得篩選目的重組子(T提取目的基因供進一步研究-重組目的基因功能表達)基因工程可以應用于哪些方面？答:(1)帶來體外蛋白質化學的革命：甲型干擾素，紅細胞生成素。(2) 對檢測技術的貢獻：提供大量高純靶，提高準確性；病原體檢出(HCVHBVHIV);遺傳病診斷。(3) 直接的遺傳性疾病治療和生物體改造：轉基因動植物。（4）促進對生命現象本質機理的研究：胰島素基因與糖尿病、癌基因與抗癌基因。3. 什么是“安全”的宿主一載體體系？

3、答：失去自我遷移能力，可以是營養缺陷性，在自然環境下無法生存。第一章基因操作基本技術1、提取細胞總RNA的原則是什么？如何實施？為什么？答：原則：抑制RNA酶活性實施：（1）高溫：180C,2小時，滅活RNase（2）二乙基焦炭酸乙酯（DEPC），油狀有毒，是一種強烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它使蛋白質變性，從而抑制酶的活性。（3）使用對RNase有強烈乙酯作用的細胞裂解劑，如鹽酸胍、異硫氰胍（裂解細胞、抑制酶活性、解聚核糖體）（4）帶手套、口罩：阻斷RNA酶來源，加少污染機會。（5）季節因素（溫度）：RNase降解RNA溫度高活性高，需要低溫進行。2. 如何進行總RNA制品質量控制？答：1）

4、RNA的濃度和純度測定A260nm1OD=40切/mlRNA要求A260nm/A280nm=或>2.0）A260nm/A230nm>2.02）RNA的完整性變性瓊脂糖凝膠電泳檢查28S18S2：13）總RNA制品的保存溶液法（TE或0.5%SDS方便但不穩定）懸液法（溶液加3V乙醇可靠但不方便）染色體DNA制備的原則是什么？各有哪些主要試劑？作用？答：原則：祛除蛋白及細胞碎片，祛除RNA，保持DNA分子完整。主要試劑及作用：SDS（破壞細胞膜結構、變性蛋白質、解聚）EDTA（抑制酶活性）ProteinaseK（蛋白酶消化蛋白質）3. 如何進行DNA樣品的鑒定？答：A260nm1OD

5、=50g/mlDNA要求A260nm/A280nm>1.7A260nm/A230nm>2.04. 有哪些方法可以進行DNA片段的制備？是如何進行的？答：（1）低熔點瓊脂糖（羥乙基60C-65C熔化，結果較純）（2）透析袋法：需要把樣品濃縮，把核酸沉淀，而去掉緩沖液。（3）苯酚抽提法（4）反復凍融法：多次凍融使凝膠收到破壞，釋放其中DNA，但回收率低（5）電洗脫法（6）硝酸纖維素膜離心法（7）試劑盒什么是質粒？質粒有幾類？答：質粒是一類亞細胞有機體，存在于細胞質中獨立于染色體的遺傳成分，由環狀雙鏈DNA組成的復制子。分為： F質粒（致育質粒，可以通過接合，在供體和受體間傳遞遺傳物質）

6、R質粒（抗性質粒，帶有抗性基因，可使宿主菌對某些抗菌素產生抗性） Col質粒：帶有編碼大腸桿菌素的基因。 降解質粒：可使宿主代謝特殊分子侵入性質粒：使宿主菌具有致病能力5. 什么是質粒的轉移？什么是質粒的遷移？遷移原理？答：質粒的轉移：從一個細胞自我的轉移到原來不存在這種質粒的另一個細胞去。質粒的遷移：由共存的接合型質粒引發非接合型質粒的轉移過程。原理：當相容性的接合質粒和非接合質粒在同一細胞中，非接合質粒中mob編碼的核酸酶作用其特異位點bom，使bom位點發生單鏈斷裂而出現缺口，構象轉變為缺口環狀構象。當有接合性質粒中F因子能夠導致性須的合成，提供轉移裝置，則可以轉移。如果沒有，缺口可能還

7、原維持兩種構象的動態平衡。6. 掌握質粒拷貝數的定義？質粒的復制類型？答：定義：生長在標準培養條件下，每個細菌細胞中所含有的質粒DNA分子的數目。非標準培養條件下，每個細菌細胞染色體平均具有的質粒DNA分子的數目。類型：一類是嚴緊型質粒，當細胞染色體復制一次時，質粒也復制一次,每個細胞內只有12個質粒；另一類是松弛型質粒，當染色體復制停止后仍然能繼續復制，每一個細胞內一般有20個左右質粒。7. 什么是質粒的不相容性？答：在沒有選擇壓力的情況下，兩種親源關系密切的不同質粒不能在同一個宿主細胞中穩定存在。10掌握用作克隆載體的基本條件是什么？為什么？答：（i）具若干限制酶單一識別位點：可提供多種選

8、擇，具有多個同一種酶切位點則可能被切碎（ii）具有復制起點：可導入宿主細胞，也是質粒自我增值必不可少條件（iii）具有選擇標記：便于篩選（iv）具有較小的分子量和較高的拷貝數：操作簡單，可攜帶較大片段的基因，并有利于載體的穩定。11掌握LacZ的篩選原理是什么？答：是重組子篩選的一種方法：是根據載體的遺傳特征篩選重組子，如a互補、抗生素基因等。現在使用的許多載體都帶有一個大腸桿菌的DNA的短區段，其中有B-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調控序列和前146個氨基酸的編碼信息。在這個編碼區中插入了一個多克隆位點（MCS）,它并不破壞讀框，但可使少數幾個氨基酸插入到B-半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能，

9、這種載體適用于可編碼B-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細胞。因此，宿主和質粒編碼的片段雖都沒有酶活性，但它們同時存在時，可形成具有酶學活性的蛋白質。這樣，lacZ基因在缺少近操縱基因區段的宿主細胞與帶有完整近操縱基因區段的質粒之間實現了互補，稱為a互補。由a-互補而產生的LacZ+細菌在誘導劑IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在時產生藍色菌落，因而易于識別。然而，當外源DNA插入到質粒的多克隆位點后，幾乎不可避免地導致無a-互補能力的氨基端片段，使得帶有重組質粒的細菌形成白色菌落。這種重組子的篩選，又稱為藍白斑篩選。如用藍白斑篩選則經連接產物轉化的鈣化菌平板37C溫箱倒置培養12-16hr

10、后，有重組質粒的細菌形成白色菌落。12、掌握以堿裂解法提取質粒主要用什么試劑？各有什么作用？幾大步驟中各會發生怎樣的現象？答：溶液I（溶液呈黃色懸濁液）：葡萄糖（維持滲透壓，保持結構完整性、用于懸浮）、Tris（維持一定粒子強度及PH值）、EDTA（螯合金屬離子，抑制DNA酶的作用）。溶液II（溶液變粘稠，流動性下降）：NaOH（高濃度，釋放出的物質在強堿條件下變性形成沉淀）、SDS（去膜劑，使膜溶解，釋放細胞內物質）溶液III（很多白色沉淀，流動性較好）：KACpH4.8（中和溶液II的堿性，染色體DNA不能復性，而質粒是小分子可以復性重新溶解，以此來分離染色體DNA與質粒，剩下的沉淀是細胞

11、碎片和不能溶解的DNA）進一步：CsCI（密度梯度離心）、NaCI（密度梯度離心）、Sepharose（凝膠過濾）。14、掌握什么是感受態？什么是轉化？ca2+誘導感受態的原理是什么？答：感受態：在特殊處理或正常生長的某個時期，細胞的一種敏化的可以接受外源DNA的狀態。自然條件下的轉化：一種細菌菌株由于捕獲了來自另一種細菌菌株的DNA而導致性狀特征發生遺傳性改變的生命過程。原理：Ca2+誘導的完整細胞的轉化適用于革蘭氏陰性細菌（如大腸桿菌等），其原理是Ca2+與細菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結構，后者經熱脈沖發生收縮作用，使細胞膜出現空隙。15什么是電泳？如何制備RNA變性凝膠？答：（1）蛋白質

12、核酸等大分子在電場的作用下，在緩沖液中涌動的現象。原理：由于合算分子帶負電，置于電場中的分子以一定的速度移向適當電極。遷移率（遷移速度）與電場強度和分子攜帶電荷成正比，與分子的摩擦系數成反比（與分子的大小、極性、介質粘度有關），從而把不同分子分開。（2）甲酰胺凝膠尿素凝膠羥甲基汞凝膠16掌握聚丙烯酰胺凝膠電泳的特點。答：分辨力高、容量大（10ug）、回收片段純度高。但制備時間長。17掌握PFGE的原理和應用。答：脈沖電場凝膠電泳。原理：制備染色體長片段加在瓊脂糖凝膠上的電場方向、電流大小及作用時間交替變化，兩電場方向垂直，DNA分子的遷移方向隨所用的電場方向周期性變化而不斷改變。特點：施加交變

13、電場，分離分子大小范圍一5kb2Mb,脈沖時間定向時間18影響瓊脂糖凝膠DNA電泳的因素有哪些？答：（1）DNA分子的大小（2）瓊脂糖濃度（3）DNA的構象：I超螺旋II開環III線狀（4）電壓（5）嵌入染料（6）離子強度19、什么是核酸探針？用核酸作探針的原因。核酸探針的特性。答：定義：能識別特異堿基序列的有標記的一段單鏈DNA（或RNA）分子，一段與被測定的核苷酸序列（靶序列）互補的帶標記的單股核苷酸。原因：信息量豐富，不同生物含可區別的DNA序列，穩定性（不像蛋白等不易保存）特性：一般為單鏈探針：雜交速度快/效率高，濃度高，可進行標記，可檢測點突變。敏感性高、特異性強、簡便。20、掌握核

14、酸探針的標記方法及其原理。答：（1）切口平移：限量DNaseI在待標記的雙連DNA的每一條連上產生若干個單連缺口在DNA聚合酶I的作用下5'宀3外切，并在5'宀3'合上新底物（探針），標記一條鏈。（2）末端轉移。（T4DNA聚合酶特性：在無dNTP時，可以從任何3'-OH外切；在四中dNTP均存時，聚合活性占主導地位）首先在無dNTP時，用T4DNA聚合酶作用下，序列降解產生的兩個突出的末端；然后終止加入dNTP,有些加標記，有些不加，則T4DNA聚合酶表現聚合作用。（3）隨機引物標記：弓I物很短，僅留個堿基，這樣在引物上找到的接合位點多，呈現隨機性；DNA聚合

15、酶不具有從頭合成的能力，必須要有引物添加在3'端羥基上，標記出來的探針是雙鏈。（4）體外轉錄：非細胞狀態下完成轉錄，借助一定的載體及外源DNA插入載體的克隆位點，采用合適的限制性內切酶將載體線性化，上游啟動子起始轉錄，在RNA聚合酶的作用下以帶標記的dNTP為底物合成新鏈。21、掌握核酸探針的分子雜交類型、原理及其比較和適用性。答：原理：分子雜交是通過配對堿基對之間的非共價鍵（主要是氫鍵）結合，從而形成穩定的雙鏈區。分類：Southern印跡雜交（DNA）、Northern印跡雜交（RNA）、斑點雜交（操作快，較為粗略）、原位雜交（針對總DNA，可用于菌落、噬菌斑、組織）22、非放射性

16、標記物質有什么？非放射性顯示體系是如何工作的？答：光促生物素標記、酶促生物素標記、酶促半抗原標記、化學催化酶標記24、掌握II型限制性內切酶的識別特性和切割特性。什么是同尾酶？答：識別特性:識別由4-8個核苷酸組成的呈回文結構的特定序列。切割特性：產生粘性端或鈍端。粘性末端分為5'突出（5'有幾個游離堿基）、3突出。同尾酶（isocaudomer）:來源不同的限制酶，識別及切割序列各不相同，但卻能產生出相同的粘性末端，這類限制酶稱為同尾酶。25、掌握II型限制性內切酶的識別特性與切割片段大小之間的關系。28、什么是星號活力？產生星號活力的原因。答:星號活力（staractivi

17、ty:非標準反應條件下，內切酶識別切割能力下降，識別特異性下降產生原因：甘油（限制性內切酶保存在甘油中）、鹽（來自于樣品，一般可以被除去）、PH、有機試劑（可能在粗提樣品時被加入而未除凈）；酶濃度大于10%時會引起星號活力，故不能多加；酶質量不好也易產生星號活力。30、T4DNA連接酶的功能及其用途。答：（連接單位定義：16°C0'內能使20l體系中5g/HindIII的6個片段有50%連接成DNA的量。）功能：5-P+3'-OH需Mg2+ATP用途：（1）同酶或同尾酶切產物的連接（2）接頭與連接子的連接（3）末端改造后的平端連接31、什么是接頭，什么是連接子？答：接

18、頭：指的是連接兩個分子或同一個分子兩末端的一段DNA序列,是人工合成的寡核苷酸，兩端有限制酶識別序列。連接子：指的是合成的具有限制性酶識別序列的核苷酸片段，利用連接子時，將其與外源DNA片段連接后，用相應的酶切割，則可產生粘性末32、堿性磷酸酶、S1酶、Bal31酶、32、堿性磷酸酶、S1酶、Bal31酶、Klenow酶的功能及其用途是什么?答:堿性磷酸酶：去磷酸化防止載體自連S1酶：切割單鏈一一末端修飾、切開回折、RNA作圖Bal31酶：5-3/3-5外切一一誘發基因的缺失突變、酶譜Klenow酶：末端放射性標記一一DNA聚合酶I大片段，只是從DNA聚合酶I全酶中去除5'-3'

19、;外切酶活性。有dNTP情況下，呈現DNA聚合酶活性，在沒有dNTP情況下呈現外切酶活性第二章PCR技術1什么是PCR?其原理什么？PCR反應的典型過程怎樣？答：定義：聚合酶鏈反應又稱為PCR擴增技術，是一種高效、快速、特異性的體外DNA聚合程序。在體外的無細胞體系中模擬天然DNA復制過程的使目的DNA的量增加的反應。原理:類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核糖核苷酸引物。PCR由變性一一退火一一延伸三個基本反應步驟構成。步驟：（1）模板DNA變性：模板DNA經加熱至94C左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物

20、接合，為下輪反應作準備。（2）模板DNA與引物的退火：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55C左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對接合。（3）引物的延伸：DNA模板引物結合物在TapDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈。重復循環變性退火延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”。2、PCR反應中的引物設計有什么樣的原則？答：（1）引物間配對堿基不能超過六個，尤其是3端引物間配對堿基不能超過2個；（2）引物內配對堿基不超過6個；（3）GC%，所占比低，則Tm低（4）末端保守性：引物3端必須與模板完

21、全匹配（5）兼并堿基（可用次黃嘌呤代替任意堿基）3、什么是熱啟動？答：指在PCR反應中，由于Taq聚合酶在常溫下也具有延伸引物的活性，因此為保證擴增產物的純度，PCR反應的主要成分（模板和引物等）在延伸前才加入。6、難于擴增得到長片段產物的原因及其解決辦法？答：原因：（1）3端得錯配：此種情況在生物體內也存在，但體內的DNA聚合酶具有校正功能，而用于PCR擴增的Taq酶不具這種功能。（2）高溫下脫嘌呤或脫嘧啶、而使Taq酶不能通過（3）反應添加劑、PCR循環參數、模板的完整性（模板越長越不穩定）等影響（4）TaqDNA聚合酶會自動脫落。解聚方法：發展新酶或合成能力強的酶；三羥甲基甘氨酸可增加P

22、H穩定性。&如何進行PCR污染的控制？答：設陰陽對照；操作分區；材料分裝（小包裝）；加樣順序；使用專門儀器；重復實驗。9、如何判斷PCR產物的特異性？答：PCR產物是否為特異性擴增，其結果是否準確可靠，必須對其進行嚴格的分析與鑒定，才能得出正確的結論。PCR產物的分析，可依據研究對象和目的不同而采用不同的分析方法。凝膠電泳分析：PCR產物電泳，EB染色紫外成像儀下觀察，初步判斷產物的特異性。PCR產物片段的大小應與預計的一致，特別是多重PCR,應用多對引物，其產物片段都應符合預計的大小，這是起碼條件。瓊脂糖凝膠電泳：通常應在1-2%的瓊脂糖凝膠，供檢測用。聚丙烯酰胺凝膠電泳：6-10%

23、聚丙烯酰胺凝膠電泳分離效果比瓊脂糖好，條帶比較集中，可用于科研及檢測分析。酶切分析：根據PCR產物中限制性內切酶的位點，用相應的酶切、電泳分離后，獲得符合理論的片段，此法既能進行產物的鑒定，又能對靶基因分型，還能進行變異性研究。分子雜交：分子雜交是檢測PCR產物特異性的有力證據，也是檢測PCR產物堿基突變的有效方法。Southern印記雜交：在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈（內部寡核苷酸）標記后做探針，與PCR產物雜交。此法既可作特異性鑒定，又可以提高檢測PCR產物的靈敏度，還可知其分子量及條帶形狀，主要用于科研。斑點雜交：將PCR產物點在硝酸纖維素膜或尼膜薄膜上，再用內部寡核苷酸探針雜交，觀

24、察有無著色斑點，主要用于PCR產物特異性鑒定及變異分析。核酸序列分析：是檢測PCR產物特異性的最可靠方法。10、利用PCR技術如何進行點突變？答:DNA分子中單個或幾個堿基的變化可以使遺傳的結構發生改變。11什么是錨定PCR?應用于怎樣的研究？答：用于擴增已知一端序列的目的DNA。在未知序列一端加上一段多聚dG的尾巴，然后分別用多聚dC和已知的序列作為引物進行PCR擴增。錨定PCR(AnchoredPCR,A-PCR主要用于分析具有可變末端的DNA序列，Loh等用A-PCR對人外周血淋巴細胞T細胞受體a-鏈的mRNA的多變性進行了分析。先可用于T細胞、腫瘤及其它部位抗體基因的研究。12、什么是

25、不對稱PCR?應用于怎樣的研究？答：用不等量的一對引物，PCR擴增后產生大量的單鏈DNA(SSDNA).這對引物分別稱為非限制引物與限制性引物，其比例一般為100：1。得到單鏈，更適宜測序，單鏈還可作為探針。13、什么是表達子PCR?應用于怎樣的研究？答：弓I入酶切位點，將PCR產物克隆；引入噬菌體啟動子，制備單鏈探針。14、什么是反向PCR?應用于怎樣的研究？答:PCR只能擴增兩端序列已知的基因片段，反向PCR可擴增中間一段已知序列，而兩端序列未知的基因片段不擴增。反向PCR的目的在于擴增一段已知序列旁側的DNA，也就是說這一反應體系不是在一對引物之間而是在引物外側合成DNA。15、什么是原

26、位PCR?應用于怎樣的研究？答：就是在組織細胞里進行PCR反應，它結合了具有細胞定位能力的原位雜交和高度特異敏感的PCR技術的優點。原位PCR既能分辯鑒定帶有靶序列的細胞，又能標出靶序列在細胞內的位置，分子和細胞水平上研究疾病的發病機理和臨床過程及病理的轉歸有重大的實用價值。16、什么是RAPD?應用于怎樣的研究？答:RAPD即隨即擴增多態DNA分析：兩個物種的個體之間，親緣關系越近其相應PCR擴增的帶型就越相似，繁殖差異懸殊，利用這種原理的技術成為RAPD,應用于生物多樣性分析。(單個人工合成的隨機多態核苷酸序列為引物)。第三章核酸分析與合成3、末端終止法進行DNA測序的原理。答：DNA鏈中

27、核苷酸以3',5-磷酸二酯鍵連接，合成DNA所用的底物是2'-脫氧核苷三磷酸。2',3ddNTP與普通dNTP不同，它們在脫氧核糖的3'位置缺少一個羥基。在DNA聚合酶作用下通過三磷酸基團摻入到延伸的DNA鏈中，但由于沒有3羥基,不能同后續的dNTP形成磷酸二酯鍵，因此，正在延伸的DNA鏈不能繼續延伸。在DNA合成反應混合物的4種普通dNTP中加入少量的一種ddNTP，鏈延伸將與偶然發生但卻十分特異的鏈終止競爭，產物是一系列的核苷酸鏈，其長度取決于引物末端到出現過早鏈終止位置間的距離。在4組獨立酶反應中分別采用4種不同的ddNTP，結果將產生4組寡核苷酸，它們將

28、分別終止于模板鏈的A、C、G或T位置。6、核酸的化學合成都有哪些方法？現在常用的是哪種？其原理和過程是什么？答：（1）磷酸二酯法：付產物多、產率低、操作復雜（2）磷酸三酯法:核苷間的磷酸基以三酯存在。付產物少、磷酸基被保護可用硅膠柱分離、產率高、反應時間短速度快（3）亞磷酸三酯法：反應速度快、可固相合成原理：末端核苷（3'的第一個堿基）固定在高分子化合物上（聚苯乙烯纖維、硅膠、微孔玻璃珠）循環反應洗滌除去未反應物和付產物、簡化分純、加快速度7、合成寡核苷酸純化方法有哪些？各有怎樣的應用范圍和局限？答：脫鹽：（乙醇沉淀、分子篩、反相柱C18）純度低OPC柱純化：（DMT）有短鏈、不適合基

29、因合成和DNA序列分析、不宜純化多于40me啲oligoHPLC純化：吸附于反相柱的差異、用于PCR反應；基因合成和DNA序列分析（較純，40mer、Grich不適用、設備要求高）PAGE純化：可用于任何反應（最純、無限制、但費事、有毒）&寡核苷酸化學合成的實際用途？答：（1）基因合成的元件（2）核苷酸序列分析的引物（3）核酸分子雜交的探針（4）突變研究第四章噬菌體載體及粘粒1、，噬菌體載體的類型及其比較。答：（1）插入型載體:只有一個位點外源基因在此插入。（2）替代性載體:具有兩個插入位點兩個位點之間的序列在外源基因插入后被取代。主要區別是容量不同和插入位點的不同，替代性載體容量較大

30、。4、什么是柯斯質粒載體？有怎樣的特點？答：一類由人工構建的含有入DNA的cos序列和質粒復制子的特殊類型的質粒載體。（容量：3145kb）特點：具有'噬菌體的特性（環化）；具有質粒載體的特性；咼容量。柯斯克隆優點：容量大、非重組體少問題：分子內重組成多聚體（堿性磷酸酶處理）基因間連接（電泳分級分離）6、噬菌體展示載體的工作原理。答：在絲狀噬菌體顆粒一端的表面，存在3-5個基因III編碼的蛋白質（功能：噬菌體顆粒的正確組裝，作用于大腸桿菌雄性細胞F性須的吸附過程）。當外源DNA片段被插入在噬菌體展示載體的基因III編碼序列中，在兩者讀碼結構保持一致的情況下，就會產生由克隆基因與基因II

31、I聯合編碼的融合蛋白。用于構建噬菌體表面展示文庫等。第五章目的基因的準備和重組及重組子的鑒定1、什么是cDNA文庫和基因組DNA文庫？各有怎樣的優缺點？答：cDNA文庫：以mRNA為模板，經反轉錄酶催化，在體外反轉錄成cDNA，與適當的載體（常用噬菌體或質粒載體）連接后轉化受體菌，則每個細菌含有一段cDNA，并能繁殖擴增，這樣包含著細胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合稱為該組織細胞的cDNA文庫。cDNA文庫具有組織細胞特異性，比基因組DNA文庫小的多，從中獲得的是已經過剪接、去除內含子的cDNA。基因組DNA文庫：指將某生物的全部基因組DNA用限制性內切酶或機械力量切割成一定長度的DNA片

32、段，再與適合的載體在體外重組并轉化相應的宿主細胞獲得的所有陽性菌落。整個克隆群體就包含基因組的全部基因片段總和。cDNA基因文庫的優點：病毒RNA的研究（只能構建cDNA文庫）、篩選簡單、cDNA文庫直接是表達序列、可用于測定基因結構（內含子外顯子）、時間調節基因表達特征分析。缺點：無調節序列、低豐度mRNA克隆難（從文庫中難以獲得）2、如何計算構建文庫時的規模？其影響因素有哪些？答：Clerke&Carbor公式：N=ln（1-p）/ln（1-f/g）N:文庫的規模，即想要獲得某一DNA片段所需文庫大小。P：概率，獲得某一片段的可能性。f/g:特異mRNA拷貝數/總mRNA種類可克隆

33、片段大小/基因組總長度影響因素：mRNA豐度、克隆基因的大小（載體容量）3、cDNA文庫構建過程及其關鍵步驟的處理和分析。答：（1）RNA的制備及純化 總RNA的提取mRNA的純化-oligodT纖維素柱層析 特異mRNA的富集（mRNA分級分離、蔗糖密度梯度離心）特異mRNA的分析鑒定*mRNA體外翻譯（麥胚、兔網織紅細胞）*RNA電泳-NorthernBlot（2）cDNA兩鏈的合成（RNA酶H法、自身引物法、試劑盒）（3）雙鏈cDNA分子與載體的連接：同聚物加尾、inker連接子（4）重組體導入宿主：轉化、轉染、電脈沖、4、cDNA雙鏈合成過程。答：（1）利用RNA酶H，以oligo（d

34、T）作為引物進行逆轉錄合成RNA-DNA雜合體。（2）自身引物法：以oligo（dT）作為引物，合成3-OH，自身作為引物合成另一條鏈、用S1切開使平端化。（3）運用試劑盒5、什么是同聚物加尾？答：在載體和要插入的DNA片段分別加上polyA和polyT,形成粘性末端；使片段練到載體上。6、cDNA文庫的檢測方法及其原理？答：、遺傳檢測：利用載體提供的表型特征、插入基因功能表達、物理檢測：凝膠電泳（重組體插入片段分子量增大，但此方法操作麻煩）、免疫化學檢測：*標記抗體探針*免疫沉淀（免疫沉淀是利用抗體特異性反應純化富集目的蛋白的一種方法。） 、轉譯篩選法*雜交抑制的轉譯-豐富mRNA*雜交選擇

35、的轉譯-低豐度mRNA-insulin、正負篩選法：組織特異性、發育階段特異性、特殊處理后基因表達差異7、基因組DNA文庫如何制備?隈制H內切晦處理機械剪切從mRNA令威ONAJL閣比學合展PCR法平端連挾連按子連軽ONA片段與A體r>NA分子連理枯性未端連按垂蛆噬藹休PNA韓集那組噬菁體袒華我粘社希導&基因組DNA文庫構建時，為防止外源DNA片段之間的連接，可采用哪些措施？答：（1）將待連接的DNA片段根據載體的裝載量分級分離（2）用堿性磷酸單酯酶除去DNA片段的末端磷酸基團（3）用TdT酶在DNA片段的末端上增補同聚尾末端第六章基因在原核及真核體系中的表達1、真核基因在大腸桿

36、菌中的表達存在的問題及其解決辦法。答：理論上的困難：遺傳機制的差異基因結構（cDNA代替基因組DNA）轉錄信號（SD）（使用原核啟動子及SD序列）細菌蛋白酶（引入突變體-抑制基因mRNA結構、蛋白的后加工（無法解決）2、真核克隆基因在大腸桿菌中表達的基本條件答：(1)啟動子(含啟動子才能表達)、含有SD序列、(2) 正確插入方向(起始密碼子靠近啟動子)4、提高克隆基因在大腸桿菌中表達效率的途徑。答：、啟動子的結構對表達效率的影響(-35與-10間17bp最高活性)、轉譯起始序列對表達效率的影響一一轉錄不翻譯區轉譯起始的保守序列：AUG、SD(UAAGGAGGU的部分或全部)、核糖體的結合位點有

37、一個或幾個終止密碼子、含全部或部分PuPuUUUPuPu其他：SD后的4堿基4A或4T(GC則25%-50%)、起始密碼子左邊UAU、CUU最好，UUCUCAAGG下降20倍、啟動子同克隆基因間距離對表達效率的影響(不確定，與通過探測得知。、質粒拷貝數對表達效率的影響(條件致死型載體)一一一般越多越好、轉錄終止區對克隆基因表達效率的影響終止區存在的必要性：(1) 轉錄產物越長，RNA聚合酶轉錄一分子mRNA所需的時間就相應增加，外源基因本身的轉錄效率下降；(2) 如果外源基因下游緊接有載體上的其它重要基因或DNA功能區域，如選擇性標記基因和復制子結構等，則RNA聚合酶在此處的轉錄可能干擾質粒的

38、復制及其它生物功能，甚至導致重組質粒的不穩定性；(3) 過長的mRNA往往會產生大量無用的蛋白質，增加工程菌無謂的能量消耗(4) 過長的轉錄物往往不能形成理想的二級結構，從而大大降低外源基因編碼產物的翻譯效率、質粒分離的不穩定性對效率的影響*質粒分配由par控制*克隆該基因*保持選擇壓力*反選擇：質粒含CI,宿主是溶源化細菌，其噬菌體啟動子缺陷、密碼子的使用頻率(bias)密碼子的偏愛性6、外源DNA導入哺乳動物細胞的方法及其原理和特點。答：（i）磷酸鈣轉染技術；（ii）DEAE-葡聚糖轉染技術；（iii）聚陽離子-DSMO專染技術；（iv）電穿孔技術；（v）顯微注射技術；（Vi）原生質體融合

39、技術。7、什么是電穿孔法？什么是脂質載體法？有怎樣的特點？（1）電穿孔（electroporation是指在高壓電脈沖的作用下使細胞膜上出現微小的孔洞。從而導致不同細胞之間的原生質膜發生融合作用的細胞生物學過程。（幾乎所有類型的細胞，都可以成功地使用電穿孔技術進行基因轉移。此項技術具有操作簡便，基因轉移效率高等優點。）（2）脂質體（liposomes是一種人造的脂質小泡（lipidvesicles）外周是脂雙層，內部是水腔。用它作載體可以把外源DNA導入培養的哺乳動物細胞。（制備簡單，易消毒；包裝的DNA4C長期不失活;毒性低，包裝容量大;保護DNA免受核酸酶降解;效率低）9、研究DNA與蛋白

40、質相互作用的方法及其原理。答： 凝膠阻滯試驗（gelretardationassay）原理：DNA結合蛋白運動變緩應用：研究轉錄因子及DNA的作用；突變對該作用的影響DNasel足跡試驗（footprintingassay）原理：DNaseI隨機切割，相差一個核苷酸，產生10類片段（在不同分子上）應用：研究轉錄因子與DNA作用的確切位點及突變對該作用的影響 甲基化干擾試驗原理：甲基化作用干擾蛋白與DNA的作用，硫酸二甲酯（DMS冋使G甲基化，利于六氫吡啶切割應用：研究作用的確切位點；同理可研究A，但不能研究T、C體內足跡試驗（DMS自然滲透）酵母雜交系統（yeasthybridsystems體

41、內識別編碼與目標蛋白作用的蛋白基因方法一一天然狀態，弱，短（1）雙雜交系統在細胞內檢查兩種蛋白質是否相互作用結合的實驗系統。構建這兩種蛋白質分別與反式激活轉錄因子的DNA結合結構域（BD）及轉錄激活結構域（AD）相連的融合蛋白表達載體，轉入同一個細胞中表達，如果這兩種蛋白質能夠相互結合，就會將AD帶到BD所識別結合的轉錄序列位置上，激活下游特定報道基因的表達而被檢測。應用：受體-抗體作用，免疫反應，細胞結構缺陷：bait有內在DNA結合及激活活性時蛋白不能穩定表達或定位于核蛋白不能正確折疊或后加工（2）單雜交系統（one-hybridsystem）分離與一個順式作用元件結合的蛋白基因（3）三雜

42、交系統（three-hybridsystem）由蛋白、激酶、小分子、RNA介導的BD-X與AD-Y的作用10、什么是酵母雜交系統其工作原理及特點。答：體內識別編碼與目標蛋白租用的蛋白基因方法。酵母雙雜交系統是將待研究的兩種蛋白質的基因分別克隆到酵母表達質粒的轉錄激活因子（如GAL4等）的DNA結合結構域基因和GAL4激活結構域基因，構建成融合表達載體，從表達產物分析兩種蛋白質相互作用的系統。第七章植物基因工程1、什么是Ti質粒？什么是轉座子示蹤技術及其原理。答：（1）Ti是在根瘤土壤桿菌細胞中存在的一種染色體外自主復制的環形雙鏈DNA分子。它控制根瘤的形成，可作為基因工程的載體。（2）轉座子示

43、蹤技術：根據植物或細胞的表型變異進行基因分離的有效手段。其方法是：用帶有轉座子的隱性純合植物材料與所需分離的顯性基因純系親本雜交，篩選因轉座子插入而表現為隱性性狀的突變品系。然后用已克隆的轉座子為探針，對突變株系進行Southem分析，通過常規分子克隆（如構建基因文庫）分離目的基因片段。接著再以該基因片段為探針，從正常的顯性基因純系親本中克隆出相應系列。2、什么是基因挽救技術？什么是cDNA差異顯示技術？答：（1）有選擇壓力性狀植株基因組-；連入穿梭載體轉入農桿菌，轉化受體細胞，在選擇壓力下選擇抗性植株>以T-DNA為探針選擇目標基因（2）cDNA差異顯示技術：該實驗方法是針對從特定細胞或組織類型的mRNA池來源的樣品用PCR技術對其中許多的cDNA基因一起進行擴增和顯示的實驗方法。原理：將錨定cDNA的3'末端引物與隨機引物加入反應混合液，用PCR技術進行雙鏈cDNA產物的擴增。過比較兩種不同細胞類型或在不同生長條件下同種細胞類型來源的擴增cDNA產物的電泳帶譜，能夠用于鑒定其表達基因圖譜的差異。3、植物的遺傳轉化方法。答：A以載體為媒介的基因轉化(1) 土壤農桿菌Ti質粒介導的遺傳