1、第一章細胞培養的基本原理與技術現代生物技術一般認為包括基因工程技術、細胞工程技術、酶工程技術和發酵工程技術，而這些技術的發展幾乎都與細胞培養有密切關系，特別是在醫藥領域的發展，細胞培養更具有特殊的作用和價值。比如基因工程藥物或疫苗在研究生產過程中很多是通過細胞培養來實現的。基因工程乙肝疫苗很多是以CHO細胞作為載體；細胞工程中更是離不細胞培養，雜交瘤單克隆抗體，完全是通過細胞培養來實現的，既使是現在飛速發展的基因工程抗體也離不開細胞培養。正在倍受重視的基因治療、體細胞治療也要經過細胞培養過程才能實現，發酵工程和酶工程有的也與細胞培養密切相關。總之，細胞培養在整個生物技術產業的發展中起到了很關鍵

2、的核心作用。第一節體外培養的概念一、基本概念體外培養（in vitro culture），就是將活體結構成分或活的個體從體內或其寄生體內取出，放在類似于體內生存環境的體外環境中，讓其生長和發育的方法。組織培養：是指從生物體內取出活的組織（多指組織塊）在體外進行培養的方法。細胞培養：是指將活細胞（尤其是分散的細胞）在體外進行培養的方法。器官培養：是指從生物體內取出的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在體外進行培養的方法。二、體內、外細胞的差異和分化1. 差異：細胞離體后，失去了神經體液的調節和細胞間的相互影響，生活在缺乏動態平衡相對穩定環境中，日久天長，易發生如下變化：分化現象減弱；

3、形態功能趨于單一化或生存一定時間后衰退死亡；或發生轉化獲得不死性，變成可無限生長的連續細胞系或惡性細胞系。因此，培養中的細胞可視為一種在特定的條件下的細胞群體，它們既保持著與體內細胞相同的基本結構和功能，也有一些不同于體內細胞的性狀。實際上從細胞一旦被置于體外培養后，這種差異就開始發生了。2. 分化：體外培養的細胞分化能力并未完全喪失，只是環境的改變，細胞分化的表現和在體內不同。細胞是否表現分化, 關鍵在于是否存在使細胞分化的條件，如Friend細胞（小鼠紅白血病細胞）在一定的因素作用下可以合成血紅蛋白，血管內皮細胞在類似基膜物質底物上培養時能長成血管狀結構，雜交瘤細胞能產生特異的單克隆抗體，

4、這些均屬于細胞分化行為。第二節細胞培養的一般過程一、準備工作 準備工作對開展細胞培養異常重要，工作量也較大，應給予足夠的重視，推備工作中某一環節的疏忽可導致實驗失敗或無法進行。準備工作的內容包括器皿的清洗、干燥與消毒，培養基與其他試劑的配制、分裝及滅菌，無菌室或超凈臺的清潔與消毒，培養箱及其他儀器的檢查與調試。二、取材 在無菌環境下從機體取出某種組織細胞（視實驗目的而定） ，經過一定的處理（如消化分散細胞、分離等）后接入培養器血中，這一過程稱為取材。如是細胞株的擴大培養則無取材這一過程。機體取出的組織細胞的首次培養稱為原代培養。理論上講各種動物和人體內的所有組織都可以用于培養，實際上幼體組織（

5、尤其是胚胎組織）比成年個體的組織容易培養，分化程度低的組織比分化高的容易培養，腫瘤組織比正常組織容易培養。取材后應立即處理，盡快培養，因故不能馬上培養時，可將組織塊切成黃豆般大的小塊，置 4的培養液中保存。取組織時應嚴格保持無菌，同時也要避免接觸其他的有害物質。取病理組織和皮膚及消化道上皮細胞時容易帶菌，為減少污染可用抗菌素處理。三、培養 將取得的組織細胞接入培養瓶或培養板中的過程稱為培養。如系組織塊培養，則直接將組織塊接入培養器皿底部，幾個小時后組織塊可貼牢在底部，再加入培養基。如系細胞培養，一般應在接入培養器皿之前進行細胞計數，按要求以一定的量（以每毫升細胞數表示）接入培養器皿并直接加入培

6、養基。細胞進入培養器皿后，立即放入培養箱中，使細胞盡早進入生長狀態。正在培養中的細胞應每隔一定時間觀察一次，觀察的內容包括細胞是否生長良好，形態是否正常，有無污染，培養基的PH 是否太酸或太堿（由酚紅指示劑指示），此外對培養溫度和CO2濃度也要定時檢查。原代培養一般有一段潛伏期（數小時到數十天不等），在潛伏期細胞一般不分裂，但可貼壁和游走。過了潛伏期后細胞進入旺盛的分裂生長期。細胞長滿瓶底后要進行傳代培養，將一瓶中的細胞消化懸浮后分至兩到三瓶繼續培養。每傳代一次稱為“一代”。二倍體細胞一般只能傳幾十代，而轉化細胞系或細胞株則可無限地傳代下去。轉化細胞可能具有惡性性質，也可能僅有不死性（ Imm

7、ortality）而無惡性。四、凍存及復蘇（可參閱后面有關章節）為了保存細胞，特別是不易獲得的突變型細胞或細胞株，要將細胞凍存。凍存的溫度一般用液氮的溫度196，將細胞收集至凍存管中加入含保護劑（一般為二甲亞砜或甘油）的培養基，以一定的冷卻速度凍存，最終保存于液氮中。在極低的溫度下，細胞保存的時間幾乎是無限的。復蘇一般采用快融方法，即從液氮中取出凍存管后，立即放入37 水中，使之在一分鐘內迅速融解。然后將細胞轉入培養器皿中進行培養。凍存過程中保護劑的選用、細胞密度、降溫速度及復蘇時溫度、融化速度等都對細胞活力有影響。五、常用儀器設備無菌室 , 超凈工作臺, 三重純水蒸餾器, 抽氣泵 , 壓力蒸

8、氣消毒器, 電熱恒溫培養箱 , 培養器具， CO2 培養箱 , 恒溫水浴鍋 , 倒置顯微鏡 , 離心機 , 無菌過濾器 , 洗刷裝置 , 細胞計數板和電子細胞技術儀等等。第三節 細胞培養的無菌環境一、無菌室無菌室的結構：一般由更衣間、緩沖間、操作間三部分組成。無菌室的消毒和防污染：為保持無菌狀態，經常消毒是必要的，通常采用每日（使用前）紫外照射（ 1 2 小時），每周甲醛、乳酸、過氧乙酸熏蒸（ 2 小時）和每月新潔爾滅擦拭地面和墻壁一次的方式進行消毒。實際工作中，要根據無菌室建筑材料的差異來選擇合適的消毒方法。此外，還應注意防止無菌室的污染。造成無菌室污染的可能包括：送入無菌室的風沒有被過濾除

9、菌；進出無菌室時，能使外界空氣直接對流進無菌室的操作間；等。二、超凈工作臺工作原理：鼓風機驅動空氣通過高效過濾器得以凈化，凈化的空氣被徐徐吹過臺面空間而將其中的塵埃、細菌甚至病毒顆粒帶走，使工作區構成無菌環境。根據氣流在超凈工作臺的流動方向不同，可將超凈工作臺分為側流式、直流式和外流式三種類型。超凈臺的使用與保養：超凈臺的平均風速保持在-0.48米秒為宜，過大、過小均不利于保持凈化度；使用前最好開啟超凈臺內紫外燈照射10 30 分鐘，然后讓超凈臺預工作10 15 分鐘，以除去臭氧和使用工作臺面空間呈凈化狀態；使用完畢后， 要用 70%酒精將臺面和臺內四周擦拭干凈，以保證超凈臺無菌。還要定期用福

10、爾馬林熏蒸超凈臺。第四節常用培養器皿及清洗消毒細胞培養需要大量消耗性物品，如玻璃器皿、金屬器皿、塑料、橡膠制品、布類、紙類等，因此掌握清洗、消毒知識，學會清洗、消毒方法是從事細胞培養工作必須的。一、清洗 離體條件下，有害物質直接同細胞接觸，細胞對任何有害物質十分敏感，極少殘留物都可以對細胞產生毒副作用。因此，新的或重新使用的器皿都必須認真清洗，達到不含任何殘留物的要求。（一）玻璃器皿的清洗一般經過浸泡、刷洗、浸酸、和清洗四個步驟。1. 浸泡 : 新的或用過的玻璃器皿要先用清水浸泡，軟化和溶解附著物。新玻璃器皿使用前得先用自來水簡單刷洗，然后用 5鹽酸浸泡過夜；用過的玻璃器皿往往附有大量蛋白質和

11、油脂，干涸后不易刷洗掉，故用后應立即浸入清水中備刷洗。2. 刷洗 : 將浸泡后的玻璃器皿放到洗滌劑水中，用軟毛刷反復刷洗。不要留死角，并防止破壞器皿表面的光潔度。將刷洗干凈的玻璃器皿洗凈、晾干，備浸酸。3. 浸酸 : 浸酸是將上述器皿浸泡到清潔液中，又稱酸液，通過酸液的強氧化作用清除器皿表面的可能殘留物質。浸酸不應少于六小時，一般過夜或更長。放取器皿要小心。4. 沖洗 : 刷洗和浸酸后的器皿都必須用水充分沖洗，浸酸后器皿是否沖洗的干凈，直接影響到細胞培養的成敗。手工洗滌浸酸后的器皿，每件器皿至少要反復“注水倒空”15次以上，最后用重蒸水浸洗 2 3 次，晾干或烘干后包裝備用。（二）橡膠制品清洗

12、新的橡膠制品洗滌方法：L NaOH 煮沸 15分鐘，流水沖洗， L HCl煮沸 15 分鐘，流水沖洗，自來水煮沸 2 次，蒸餾水煮沸20 分鐘， 50烤干備用。（三）塑料制品的清洗塑料制品特點：質軟、易出現劃痕；耐腐蝕能力強、但不耐熱。清洗程序：使用器皿后立即用清水清洗，浸于自來水過夜，用紗布或棉簽和50清洗液刷洗，流水沖洗， 晾干， 浸于清潔液 15 分鐘， 流水沖洗 （ 15 20 遍） , 蒸餾水浸洗三次，雙蒸水泡 24 小時，晾干備用。（四） 包裝 : 對細胞培養用品進行消毒前，要進行嚴密包裝， 以便于消毒和貯存。常用的包裝材料：牛皮紙、硫酸紙、棉布、鋁飯盒、較大培養皿等，近幾年用鋁箔

13、包裝，非常方便，適用。培養皿、注射器、金屬器械等用牛皮紙包裝后再裝入飯盒內，較大的器皿可以進行局部包扎。二、消毒和滅菌微生物污染是造成細胞培養失敗的主要原因（一）物理消毒法1. 紫外線消毒 : 紫外線是一種低能量的電磁輻射，可殺死多種微生物。革蘭陰性菌最為敏感，其次是陽性菌，再次為芽孢，真菌孢子的抵抗力最強。紫外線的直接作用是通過破壞微生物的核酸及蛋白質等而使其滅活，間接作用是通過紫外線照射產生的臭氧殺死微生物。直接照射培養室消毒，用法簡單，效果好。紫外燈的消毒效果同紫外燈的輻射強度和照射劑量呈正相關，輻射強度隨燈距離增加而降低，照射劑量和照射時間呈正比。因此紫外燈同被照射物的距離和照射時間要

14、適合。燈可照射9 平方米房間，每天照射2 3 小時，期間可間隔30 分鐘。燈管離地面離地面2 米的 30W2 米以外要延長照射時間，2.5 米照射效果較差。紫外燈照射工作臺的距離不應超過1.5 米，照射時間30 分鐘為宜。紫外燈不僅對皮膚、眼睛傷害，且對培養細胞與試劑等也產生不良影響，因此，不要開著紫外等操作。2. 高溫濕熱滅菌 : 壓力蒸汽滅菌是最常用的高溫濕熱滅菌方法。對生物材料有良好的穿透力，能造成蛋白質變性凝固而使微生物死亡。布類、物、璃器皿、屬器皿、膠和某些培養液都可以用這方法滅菌。不同壓力蒸汽所達到的溫度不同，不同消毒物品所需的有效消毒壓力和時間不同。從壓力蒸汽消毒器中取出消毒好的

15、物品（不包括液體），應立即放到60-70 烤箱內烘干，再貯存備用，否則，潮濕的包裝物品表面容易為微生物污染。煮沸消毒也是常用的濕熱消毒方法，它具有條件簡單、使用方便等特點。3. 高溫干熱消毒 : 干熱滅菌主要是將電熱烤箱內物品加熱到160 以上，并保持90 120 分鐘，殺死細菌和芽孢，達到滅菌目的。主要用于滅菌玻璃器皿（如體積較大的燒杯、培養瓶）、金屬器皿以及不能與蒸汽接觸的物品（如粉劑、油劑）。干熱滅菌后要關掉開關并使物品逐漸冷卻后在打開，切忌立即打開，以免溫度驟變而使箱內的玻璃器皿破裂。干烤箱內物品間要有空隙，物品不要靠近加熱裝置。燒灼也是滅菌方法之一，常利用臺面上的酒精燈的火焰對金屬器

16、皿及玻璃器皿口緣進行燒灼消毒。4. 過濾除菌：是將液體或氣體用微孔薄膜過濾，使大于孔徑的細菌等微生物顆粒阻留，從而達到除菌目的。在體外培養時，過濾除菌大多用于遇熱容易變性而失效的試劑或培養液。目前，大多實驗室采用微孔濾膜濾器除菌。關鍵步驟是安裝濾膜及無菌過濾過程。（二）化學消毒：新潔而滅，其水溶液可對器械、皮膚、操作表面進行擦拭和浸泡消毒。（三）抗生素消毒：抗生素主要用于消毒培養液，是培養過程中預防微生物污染的重要手段，也是微生物污染不嚴重時的“急救”方法。不同抗生素殺滅微生物不同，應根據需要選擇。可用于細胞培養的消毒滅菌方法很多，但每種方法都有一定的適應范圍。如常用的過濾除菌系統、紫外照射、

17、電子殺菌燈、乳酸、甲醛熏蒸等手段消毒實驗室空氣；多用新潔而滅消毒實驗室地面；常用干熱、濕熱消毒劑浸泡、紫外照射等方法消毒培養用器皿；采用高壓蒸汽滅菌或過濾除菌方法消毒培養液。第二章細胞培養液現代生物技術均通過細胞作為載體來進行，無論是基因治療、干細胞、克隆技術都在細胞內進行的。 細胞的生長需要一定的營養環境，用于維持細胞生長的營養基質稱為培養基，即指所有用于各種目的的體外培養、保存細胞用的物質，就其本意上講為人工模擬體內生長的營養環境，使細胞在此環境中有生長和繁殖的能力。它是提供細胞營養和促進細胞生長增殖的物質基礎。細胞培養基其組成成分主要有：水、氨基酸、維生素、碳水化合物、無機離子及其他一些

18、入核酸降解物、激素等。隨著動物細胞大規模培養技術的迅速發展，作為細胞培養領域中最基本的原料細胞培養基的用量也迅速增加，被廣泛應用于細胞生物學科和醫學研究的各個領域，如疫苗生產 （人用疫苗如乙腦、狂犬、甲肝、乙肝、出血熱、麻疹等，獸用疫苗如口蹄、馬立克、偽狂犬等），基因藥物生產（如EPO、 TPA等），臨床用單抗（如抗人肝癌單抗、抗人肺單抗、WT3）等。第一節水與平衡鹽溶液1. 培養用水 : 體外培養的細胞對水質特別敏感，對水的純度要求較高。培養用水中如果含有一些雜質，即使含量極微，有時也會影響細胞的存活和生長，甚至導致細胞死亡。 用金屬蒸餾器制備的蒸餾水， 可能會含有某些金屬離子， 一般不作為

19、培養用水。 配制培養用液應使用經石英玻璃蒸餾器三次蒸餾的三蒸水或超純水凈化裝置制備的超純水。 最好用龍頭瓶貯存， 存放時間一般不應超過2 周。2. 緩沖溶液、生理鹽水、平衡鹽溶液：稍后介紹。第二節 細胞培養基的基本要求體外培養的細胞直接生活在培養基中，因此培養基應能滿足細胞對營養成分、促生長因子、激素、滲透壓、一、營養成分pH等諸多方面的要求。維持細胞生長的營養條件一般包括以下幾個方面：1. 氨基酸：是細胞合成蛋白質的原料。所有細胞都需要12 種必須氨基酸：纈氨酸、亮、異亮、蘇、賴、色、苯丙、蛋、組、酪、精氨酸、胱氨酸。此外還需要谷氨酰胺，它在細胞代謝過程中有重要作用，所含的氮是核酸中嘌令和嘧

20、啶合成的來源，同樣也是合成三、二、一磷酸酰苷所需要的基本物質。體外培養的各種培養基內都含有必需氨基酸。2. 單糖：培養中的細胞可以進行有氧與無氧酵解，六碳糖是主要能源。 此外六碳糖也是合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料。細胞對葡萄糖的吸收能力最高，半乳糖最低。體外培養動物細胞時，幾乎所有的培養基或培養液中都以葡萄糖作為必含的能源物質。3. 維生素：主要扮演輔酶、輔基的角色，必不可少。生物素、葉酸、煙酰胺、泛酸、吡哆醇、核黃素、硫胺素、維生素 B12 都是培養基常有的成分。4. 無機離子與微量元素： 細胞生長除需要鈉、 鉀、鈣、鎂、氮和磷等基本元素， 還需要微量元素，如鐵、鋅、硒、銅、錳、鉬、釩等

21、。二、促生長因子及激素已證實： 各種激素、 生長因子對于維持細胞的功能、保持細胞的狀態 （分化或未分化）具有十分重要的作用。有些激素對許多細胞生長有促生長作用，如胰島素，它能促進細胞利用葡萄糖和氨基酸。有些激素對某一類細胞有明顯促進作用，如氫化可的松可促進表皮細胞的生長，泌乳素有促進乳腺上皮細胞生長作用等。三、滲透壓 細胞必須生活在等滲環境中，大多數培養細胞對滲透壓有一定耐受性。人血漿滲透壓 290mOsm/kg,可視為培養人體細胞的理想滲透壓。鼠細胞滲透壓在320mOsm/kg左右。對于大多數哺乳動物細胞，滲透壓在260 320mOsm/kg的范圍都適宜。四、pH 氣體也是細胞生存的必需條件

22、之一，所需氣體豐要是氧和二氧化碳。氧參與三羧酸循環，產生能量供給細胞生長、增殖和合成各種成分。一些細胞在缺氧情況下，借糖酵解也可獲取能量，但多數細胞缺氧不能生存。在開放培養時， 一般置細胞于95空氣加5二氧化碳的混合氣體環境中培養。二氧化碳既是細胞代謝產物，也是細胞所需成分，它主要與維持培養基的pH 有直接關系。動物細胞大多數需要輕微的堿性條件，pH值約在 7274在細胞生長過程中，隨細胞數量的增多和代謝活動的加強，二氧化碳不斷被釋放，培養液變酸， PH 值發生變化。 由于 NaHCO3容易分解為二氧化碳，很不穩定， 致使緩沖系統難以精確地控制。故這一緩沖系統適合密閉培養。HEPES結合碳酸氫

23、鈉使用，可提供更有效的緩沖體系，主要是防止pH 值迅速變動，但最大缺點是在開放培養或觀察時難以維持正常的pH 值。造成 pH 波動主要是代謝產生的CO2，在封閉式培養過程中 CO2與水結合產生碳酸，培養基pH 很快下降。為解決這一問題，合成培養基中使用了NaHCO3-CO2緩沖系統，并采用開放培養，使細胞代謝產生的CO2及時溢出培養瓶，再通過穩定調節溫箱中 CO2濃度（ 5），與培養基中的 NaHCO3處于平衡狀態。五、無毒、無污染體外生長的細胞對微生物及一些有害有毒物質沒有抵抗能力，因此培養基應達到無化學物質污染、無微生物污染（如細菌、真菌、支原體、病毒等）、無其他對細胞產生損傷作用的生物活

24、性物質污染（如抗體、補體）。對于天然培養基，污染主要來源于取材過程及生物材料本身，應當嚴格選材，嚴格操作。對于合成培養基，污染主要來源于配制過程，配制所用的水，器皿應十分潔凈，配制后應嚴格過濾除菌。第三節 天然細胞培養基天然培養基是指來自動物體液或利用組織分離提取的一類培養基，如血漿、血清、淋巴液、雞胚浸出液等。 組織培養技術建立早期，體外培養細胞都是利用天然培養基。但是由于天然培養基制作過程復雜、批間差異大， 因此逐漸為合成培養基所替代。目前廣泛使用的天然培養基是血清，另外各種組織提取液、促進細胞貼壁的膠原類物質在培養某些特殊細胞也是必不可少。一、血清 (serum) 細胞培養的發展，培養基

25、的質量又是關鍵，而培養基的主要成份中動物血清對細胞的生長繁殖發揮著重要甚至是難以替代的作用。在動物血清的應用中牛血清又是最為廣泛的，所以血清是醫藥生物技術產品中重要的原材料之一。保證血清質量也是促進生物制品質量提高的重要環節。1. 血清種類 : 目前用于組織培養的血清主要是牛血清，培養某些特殊細胞也用人血清、馬血清等。選擇用牛血清培養細胞的原因：來源充足、 制備技術成熟、 經過長時間的應用考驗人們對其有比較深入的理解。 牛血清對絕大多數哺乳動物細胞都是適合的，但并不排除在培養某種細胞時使用其他動物血清更合適。牛血清是細胞培養中用量最大的天然培養基，含有豐富的細胞生長必須的營養成份，具有極為重要

26、的功能。牛血清分為小牛血清、新牛血清、胎牛血清。胎牛血清應取自剖腹產的胎牛；新牛血清取自出生24 小時之內的新生牛；小牛血清取自出生10 30 天的小牛。 顯然， 胎牛血清是品質最高的，因為胎牛還未接觸外界，血清中所含的抗體、補體等對細胞有害的成分最少。2. 血清的主要成分 : 血清是由血漿去除纖維蛋白而形成的一種很復雜的混合物，其組成成份雖大部分已知，但還有一部分尚不清楚，且血清組成及含量常隨供血動物的性別、年齡、生理條件和營養條件不同而異。血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長因子、激素、無機物等， 這些物質對促進細胞生長或抑制生長活性是達到生理平衡的。究雖有很大進展，但仍存

27、在一些問題。主要是：對血清的成分和作用的研第一 : 血清的成份可能有幾百種之多，目前對其準確的成份、含量及其作用機制仍不清楚，尤其是對其中一些多肽類生長因子、激素和脂類等尚未充分認識，這給研究工作帶來許多困難；第二 : 血清都是批量生產，各批量之間差異很大，而且血清保存期至多一年，因此，要保證每批血清的相似性極為困難，從而使實驗的標準化和連續性受到限制；第三 : 不能排除血清中含有易變物質，這被認為是“瓶中惡化”的原因之一。3. 血清主要作用：提供基本營養物質：氨基酸、維生素、無機物、脂類物質、核酸衍生物等，是細胞生長必須的物質。提供激素和各種生長因子：胰島素、腎上腺皮質激素（氫化可的松、地塞

28、米松）、類固醇激素（雌二醇、睪酮、孕酮）等。生長因子如成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、血小板生長因子等。提供結合蛋白：結合蛋白作用是攜帶重要地低分子量物質，如白蛋白攜帶維生素、脂肪、以及激素等，轉鐵蛋白攜帶鐵。結合蛋白在細胞代謝過程中起重要作用。提供促接觸和伸展因子使細胞貼壁免受機械損傷。對培養中的細胞起到某些保護作用：有一些細胞，如內皮細胞、骨髓樣細胞可以釋放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。 這種作用是偶然發現的，現在則有目的的使用血清來終止胰蛋白酶的消化作用。因為胰蛋白酶已經被廣泛用于貼壁細胞的消化傳代。血清蛋白形成了血清的粘度，可以保護細胞免受機械損傷，特別是在懸浮培養攪

29、拌時，粘度起到重要作用。血清還含有一些微量元素和離子，他們在代謝解毒中起重要作用，如SeO3,硒等。4. 細胞培養中使用血清的缺點血清成分復雜， 雖含許多對細胞有利成分，也含有對細胞有害的成分，使血清有幾個明顯的缺點：對大多數細胞，在體內狀態， 血清不是它們接觸的生理學液體，只是在損傷愈合以及血液凝固過程中才接觸血清，因此使用血清有可能改變某種細胞在體內的正常狀態，血清可能促進某些細胞的生長（成纖維細胞）同時抑制另一類細胞生長（表皮細胞）。血清含一些對細胞產生毒性的物質，如多胺氧化酶，能與來自高度繁殖細胞的多胺反應（如精胺、亞精胺）形成有細胞毒性作用的聚精胺。補體、抗體、細菌毒素等都會影響細胞

30、生長，甚至造成細胞死亡。動物個體不同，血清產地、批號不同，每批質量差異甚大，其成分不能保持一致。取材中可能帶入支原體、病毒，對細胞產生潛在影響，可能導致實驗失敗或實驗結果不可靠性。血清的使用使得實驗和生產的標準化困難， 其中的蛋白質使得某些轉基因蛋白生物藥品生產中分離純化工作很難完成。大規模生產中， 血清來源越來越困難， 價格昂貴， 是構成動物細胞培養對生產成本的主要部分之一。5. 血清的質量標準 : 血清質量高低取決于兩方面因素：一是取材對象，二是取材過程。用于取材的動物應健康無病并且在指定的出生天數之內， 取材過程應嚴格按照操作規程執行， 制備出的血清要經過嚴格的質量鑒定。 WHO公布的用

31、動物細胞體外培養生產生物制品規程中的要求：牛血清必須來自有文件證明無牛海綿狀腦病的牛群或國家。并應具備適當的監測系統。有些國家還要求牛血清來自未用過反芻動物蛋白飼料的牛群。證明所用牛血清中不含對所生產疫苗病毒的抑制物。血清要通過濾膜過濾除菌，保證無菌。無細菌、霉菌、支原體和病毒的污染，有些國家要求無細菌噬菌體污染。對細胞有良好的支持繁殖作用。我國在對牛血清的質量 2000 年版中國生物制品主要原輔料質控標準中提出比較嚴格的標準要求。包括蛋白質含量，細菌、真菌、支原體、牛病毒、大腸桿菌噬菌體、細菌內毒素，支持細胞增殖檢查。血清質量的鑒定一般包括以下幾個方面：理化性質：如滲透壓、pH 值、蛋白電泳

32、圖譜、蛋白含量、激素水平、內毒素等。蛋白含量包括血清總蛋白含量（不低于35-45g/L ）、球蛋白含量（應小于20g/L) 、血紅蛋白含量等。其中球蛋白含量是一項非常重要的指標，血清中球蛋白主要是抗體，球蛋白含量越低血清質量越高。血紅蛋白也是越低越好。微生物檢測：包括細菌、真菌、支原體、病毒等。特別是對支原體、病毒的檢測，支原體是一種很小的微生物，可通過孔徑22u 的濾膜。支原體、病毒污染在光學顯微鏡下難于察覺，細胞也能生長繁殖，但會影響實驗結果。檢測支原體的方法很多，如培養法、PCR法、熒光染色法、電鏡觀察法等。促生長效果：這是血清重要的特性之一，應當以培養的細胞來檢測。有兩種方法： 克隆形

33、成率、貼瓶率測定法和連續傳代培養法。(1) 克隆形成率測定 : 一般以懸浮生長的細胞為培養對象，按有限稀釋法做克隆化培養， 將不同批號的血清配制成不同濃度的培養基，細胞也稀釋成不同濃度，接種到96孔板，每孔200ul ，培養一定時間，統計有克隆生長的孔，計算出百分比，再與對照的標準血清相比較，就可看出不同批號血清間的區別。比較低的濃度，更能觀察出血清質量間的細微差別。(2) 貼瓶率測定 : 是以貼壁細胞為培養對象，將細胞稀釋至低密度，接種至平皿，每皿200 或 100個細胞，以不同濃度的血清培養基培養，培養一定時間后棄培養基，染色后統計集落數，計算出集落數占接種細胞數的百分比，同樣再與標準血清

34、比較，判斷血清質量高低。(3) 連續傳代培養法: 是將細胞培養于3 個一定體積的培養瓶中，待測血清配制為5濃度，一般于第七天收集細胞，計數，取平均值，中間可以更換一次培養基。連續測試三個周期以上，觀察細胞生長狀況，并將每次的計數結果與標準血清的測試結果比較。對于使用者，判斷血清質量先從外觀入手。好的血清應該是透明清亮，土黃色或棕黃色，無沉淀或極少沉淀，比較粘稠。如發現血清渾濁、不透明、含許多沉淀物，說明血清污染或血清中的蛋白質變性；若血清呈棕紅色，說明血清中的血紅蛋白含量太高， 取材時有溶血現象；時感覺液體稀薄， 說明血清中摻入的生理鹽水太多。 如果要進一步了解血清的質量，如果搖晃則應連續培養

35、某些細胞，觀察細胞生長狀況。6. 血清的使用與儲存 : 正確的使用及保存血清，才能使血清發揮應有的作用。使用前處理：大部分血清在使用前必須滅活處理，即56 30 分鐘。滅活的目的是去除血清中的補體成分， 避免補體對細胞產生毒性作用。血清經過滅活也會損失一些對細胞有利的成分，如生長因子， 因此也有人提出血清不經滅活直接用于培養，這樣做的前提是確認血清中不含補體成分。對于一些品質高的胎牛血清和新牛血清可以考慮不經滅活直接用于細胞培養。儲存條件：血清一般儲存于20 ，同時應避免反復凍融。購買大包裝的血清后，首先要滅活處理，然后分裝成小包裝，儲存于20，使用前融化。融化時最好現置于4。融化后的血清在

36、4不宜長時間存放，應盡快使用。使用濃度： 自從有了合成培養基，血清就是作為一種添加成分與合成培養基混合使用，使用濃度一般為 5 20，最常用是10。過多血清容易使培養中的細胞發生變化，特別是一些二倍體的無限細胞系，迅速生長之后容易發生惡性轉化。采購血清時，最好先從供應商處索取樣品進行試驗，選定一批后就要保留足夠使用6個月至 1年的量，直至用另一批經過預先試驗的樣品代替。二、胚胎浸出液胚胎浸出液 (embryonicextract)是早期動物細胞培養中應用的天然培養基，現已很少使用。三、水解乳蛋白水解乳蛋白 (lactalbumin hydrolysate)為乳白蛋白經蛋白酶和肽酶水解的產物，含

37、有豐富的氨基酸，是常用的天然培養基，可用于許多細胞和原代細胞的培養。第四節 合成細胞培養基合成培養基是根據天然培養基的成分，用化學物質模擬合成、人工設計、 配制的培養基。 它有一定的配方，是一種理想的培養基。目前合成培養基多達10 多余種，有的培養基仍在不斷進行改良。 早期組織培養是利用天然培養基，目前合成培養基已經成為一種標準化的商品，從最初的基本培養基發展到無血清培養基、無蛋白培養基， 并且還在不斷發展。合成培養基的出現極大的促進了組織培養技術的普及發展。一、基本組分基本培養基包括四大類物質：無機鹽、氨基酸、維生素、碳水化合物。無機鹽： CaCl2 KCl MgSO4 NaCl NaHCO

38、3 NaH2PO4。對調節細胞滲透壓、某些酶的活性及溶液的酸堿度都是必須的。氨基酸：纈氨酸、亮、異亮、蘇、賴、色、苯丙、蛋、組、酪、精氨酸、胱氨酸(L 型)。它們都是細胞用以合成蛋白質的必需原料，不能由其他氨基酸或糖類轉化合成。除此之外， 還需要谷氨酰胺 (glutamine) 。谷氨酰胺具有特殊的作用，對細胞的培養特別重要，能促進各種氨基酸進入細胞膜； 它所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶的來源，還是合成磷酸腺苷、二磷酸腺甘和三磷酸腺苷的原料。 細胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質，谷氨酰胺缺乏可導致細胞生長不良甚至死亡。在配制各種培養液中都應補加一定量的谷氨酰胺。值得注意的是：谷氨酰胺在溶液中很不穩定

39、，故 4下放置 1 周可分解50%，使用中最好單獨配制，置-20 冰箱中保存，用前加入培養液中。維生素： 是維持細胞生長的一種生物活性物質，在細胞中大多形成酶的輔基或輔酶，對細胞代謝有重大影響。脂溶性維生素(A 、D、E、K) 常從血清中得到補充。水溶性維生素包括牛物素、葉酸、煙酰胺、泛酸、吡哆醇、核黃素、硫胺素和B12。維生素 C也是不可缺少的，對具有合成膠原能力的細胞更為重要。碳水化合物： 是細胞生命的能量來源，有的是合成蛋白質和核酸的成分。主要有葡萄糖、 核糖、脫氧核糖和丙酮酸鈉等。體外培養動物細胞時，幾乎所有培養基或培養液中都以葡萄糖作為必含的能源物質。葡萄糖和谷胺酰胺的合理使用：乳酸

40、是葡萄糖不完全氧化的產物。研究表明， 體外培養條件下95的葡萄糖轉變為乳酸，這降低了營養物質的代謝效率，降低培養基pH 值，增加滲透壓。在氧氣供給不足的情況下，NADH轉運系統蘋果酸天冬氨酸穿梭系統活性低而不能將糖酵解產生的 NADH氧化磷酸化為 NAD+，細胞只得以降低能量需求的方式如激活乳酸脫氫酶將糖酵解產生的丙酮酸與 NADH反應生產乳酸和 NAD+，從而保證了糖酵解的順利進行。另一個可能的解釋是連接糖酵解與 TCA循環的特異性酶如丙酮酸脫氫酶復合物、磷酸丙酮酸羧化酶激酶和丙酮酸羧化酶活性低下，直接導致糖酵解與TCA循環的失衡。因此體外培養條件下，葡萄糖主要經糖酵解降解，產生過量的乳酸。

41、減少乳酸生產最常用的方法是限制培養基中葡萄糖的含量，但葡萄糖含量過低可造成細胞營養供應不足，細胞生長抑制。該方法需要對葡萄糖的消耗與需求、乳酸的生產速率以及目的蛋白的表達量等參數進行綜合考慮方可應用。在目前常用的培養基中，葡萄糖和谷胺酰胺是體外培養動物細胞的主要能源，其能量代謝通路與體內完全不同，表現為葡萄糖主要經糖酵解途徑為細胞提供能量，谷胺酰胺大部分通過不完全氧化途徑，另一小部分通過完全氧化為細胞供能。因此，適當的調整細胞內的代謝途徑，使之能促進細胞的快速生長和產物合成，同時減少代謝抑制物的生成是行之有效的一種策略。許多動物細胞如CHO、 BHK和雜交瘤細胞對營養物質葡萄糖和谷氨酰胺的消耗

42、利用很快。然而對于細胞生長而言，二者的快速利用并非細胞必需；相反相當一部分轉化為代謝廢物乳酸和氨，以及一些非必需氨基酸如丙氨酸，脯氨酸。其中，乳酸和氨是兩種主要代謝廢物，其積累可影響細胞生長以及產品質量。減少這兩種代謝產物的積累，是大規模細胞培養技術研究的重要方向。氨是由谷氨酰胺和天冬酰胺產生的。限制培養基中谷氨酰胺的含量亦是減少氨生成的常用方法。除了以上與細胞生長有關的物質以外，培養基中一般還要加入酚紅（當溶液酸性時pH 小于呈黃色；當溶液堿性時pH 大于呈紅色） ，一種 pH 指示劑。在較為復雜的培養液中還包括核酸降解物( 如嘌呤和嘧啶兩類) 以及氧化還原劑( 如谷胱甘肽 )等。有的培養液

43、還直接采用了三磷酸腺苷和輔酶A。二、常用細胞培養基(1).MEM 細胞培養基系列（參看本網站- 產品展示）(2).DMEM 細胞培養基系列（參看本網站- 產品展示）(3)RPMI-1640 細胞培養基系列（參看本網站- 產品展示）(4).199 細胞培養基系列（參看本網站- 產品展示）(5). 水解乳蛋白細胞培養基（參看本網站- 產品展示）(6) 歐氏平衡鹽（參看本網站 - 產品展示）(7)F-10,F-12細胞培養基系列（參看本網站- 產品展示）(8) 其它類型細胞培養基三、干粉培養基的配制配制培養基要注意以下問題：認真閱讀說明書。說明書都注明干粉不包含的成分，常見的有NaHCO3、谷氨酰胺

44、、丙酮酸鈉、HEPES等。這些成分有些是必須添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些根據實驗需要決定。配制是要保證充分溶解，NaHCO3、谷氨酰胺等物質都要等培養基完全溶解之后才能添加。配制所用的水應是三蒸水，離子濃度很低。所用器皿應嚴格消毒。配制好的培養基應馬上過濾，無菌保存于4 度。液體培養基主要是為了科研工作的方便而設計的培養基，它是一種滅菌后保證無菌的溶液，必要時可制成無內毒素等的溶液，可節省科研人員的工作量。配制方法在一個盡可能接近總體積的容器中加入比預期培養基總體積少5的雙蒸水。在室溫（ 20到 30）的水中加入干粉培養基，輕輕攪拌，不要加熱。水洗包裝袋的內部，轉移全部的痕量干粉到容

45、器內。加 NaHCO3到培養基中。用雙蒸水稀釋到想要的體積，攪拌溶解。注意不要過分攪拌。通過緩慢攪拌加入1N NaOH 或 1N HCL調節 pH值，由于 pH值在過濾時會上升到， 因而調節 pH值使它比最終想要的pH 值低到。培養基在過濾前要保持密封。第五節 無血清技術及其培養基經歷了天然培養基、合成培養基后， 無血清培養基和無血清培養成為當今細胞培養領域的一大趨勢。采用無血清培養可降低生產成本，簡化分離純化步驟，避免病毒污染造成的危害。無血清培養基 (serumfree medium,SFM): 是不需要添加血清就可以維持細胞在體外較長時間生長繁殖的合成培養基。但是它們可能包含個別蛋白或大

46、量蛋白組分。雖然基礎培養基加少量血清所配制的完全培養基可以滿足大部分細胞培養的要求，但對有些實驗卻不適合，如觀察一種生長因子對某種細胞的作用，這時需要排除其他生長因子的干擾作用。而血清中可能含有各種生長因子；又如需要測定某種細胞在培養過程中分泌某種物質（抗體、生長因子）的能力；或者要大規模的培養某種細胞，以獲得它們的分泌產物。 因此研制出無血清培養基一直是生物科學工作者努力的目標。 上海恒利安生物科技有限公司已成功開發了商業化的多種無血清培養基，可滿足眾多廠商的需求。一、無血清培養基的基本配方: 基本成分為基礎培養基及添加組分兩大部分。用于生物制藥和疫苗生產的細胞在體外培養時，多數呈貼壁生長或

47、兼性貼壁生長；而當其在無血清、 無蛋白培養基中生長時， 由于缺乏血清中的各種粘附貼壁因子如纖粘連蛋白、白、膠原、玻表粘連蛋白，細胞往往以懸浮形式生長。層粘連蛋添加組分包括以下幾大類物質：(1 ）促貼壁物質：許多細胞必須貼壁才能生長，這種情況下無血清培養基中一定要添加促貼壁和擴展因子，一般為細胞外基質，如纖連蛋白、層粘連蛋白等。 它們還是重要的分裂素以及維持正常細胞功能的分化因子， 對許多細胞的繁殖和分化， 起著重要作用。 纖連蛋白主要促進來自中胚層細胞的貼壁與分化，這些細胞包括成纖維細胞、肉瘤細胞、粒細胞、腎上皮細胞、腎上腺皮質細胞、 CHO細胞、成肌細胞等。(2 ）促生長因子及激素：針對不同

48、細胞添加不同的生長因子。激素也是刺激細胞生長、維持細胞功能的重要物質，有些激素是許多細胞必不可少的，如胰島素。(3 ）酶抑制劑：培養貼壁生長的細胞，需要用胰酶消化傳代，在無血清培養基中必不可少須含酶抑制劑，以終止酶的消化作用，達到保護細胞的目的。最常用的是大豆胰酶；抑制劑。(4 ）結合蛋白和轉運蛋白：常見如轉鐵蛋白和牛血清白蛋白。 牛血清白蛋白的添加比較大，可增加培養基的粘度， 保護細胞免受機械損傷。 許多旋轉式培養的無血清培養基都含有牛血清白蛋白。(5) 微量元素：硒是最常見的。二、使用方法: 目前，血清仍是動物細胞培養中最基本的的添加物，尤其是在原代培養或者細胞生長狀況不良時，常常會先使用

49、有血清的培養液進行培養，待細胞生長旺盛以后，再換成無血清培養液。細胞轉入無血清培養基培養要有一個適應過程，一般要逐步降低血清濃度，從10%減少到 5%， 3%， 1%，直至無血清培養。在降低過程中要注意觀察細胞形態是否發生變化，是否有部分細胞死亡， 存活細胞是否還保持原有的功能和生物學特性等。在實驗后這些細胞一般不再繼續保留，很少有細胞能夠長期培養于無血清培養基而不發生改變的。細胞轉入無血清培養之前，要留有種子細胞，種子細胞按常規培養于含血清的培養基中，以保證細胞的特性不發生變化。為了使細胞適應無血清培養，關鍵的是使所培養細胞：處于對數生長中期 >90% 活細胞率適應時以較高的起始細胞接

50、種有兩種方法使細胞適應無血清培養基（SFM） :1.直接適應細胞從添加血清的培養基轉換到無血清培養基（SFM）中。一些類型細胞可直接從包含血清的培養基適應無血清培養基。對于直接適應，接種細胞密度應該: ×105×105細胞 /ml。當細胞密度達到1×1063×106細胞 /ml時，傳代培養細胞。當細胞密度在培養4 到 7 天后達到2×1064×106細胞 /ml 時，細胞完全適應了無血清培養基。每隔天，當細胞密度達到1×1063×106細胞 /ml ，細胞活率在90時，貯備的適應了無血清培養基35的細胞培養物應該再次傳代培養。2.連續適應分好幾步把細胞從添加血清的培養基轉換到無血清培養基（ SFM）中，與直接適應相比較，連續適應趨向對于細胞更加溫和一些。以 2 倍正常接種密度接種