1、篇一：培養(yǎng)基的制備與滅菌實驗報告陜西師范大學遠程教育學院生物學實驗報告報告題目培養(yǎng)基的制備與滅菌姓名劉偉學 號精品文檔，你值得期待專業(yè)生物科學批次/層次指導教師學習中心培養(yǎng)基的制備與滅菌一、目的要求1. 掌握微生物實驗室常用玻璃器皿的清洗及包扎方法。2. 掌握培養(yǎng)基的配置原則和方法。3. 掌握高壓蒸汽滅菌的操作方法和注意事項。二、基本原理牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：是一種應用最廣泛和最普通的細菌基礎培養(yǎng)基，有時又稱為普通培養(yǎng)基。由于這種培養(yǎng)基中含有一般細胞生長繁殖所需要的最基本的營養(yǎng)物質，所以可供細菌生長繁殖之用。高壓蒸汽滅菌：主要是通過升溫使蛋白質變性從而達到殺死微生物的效果。將滅菌的物品放在一個密

2、閉和加壓的滅菌鍋內，通過加熱，使滅菌鍋內水沸騰而產生蒸汽。待蒸汽將鍋內冷空氣從排氣閥中趨盡，關閉排氣閥繼續(xù)加熱。此時蒸汽不溢出，壓力增大，沸點升高，獲得高于100的溫度導致菌體蛋白凝固變性，而達到滅菌的目的。三、實驗材料1. 藥品：牛肉膏、蛋白胨、 nacl 、瓊脂、 1mol/l的 naoh 和 hcl 溶液。2. 儀器及玻璃器皿：天平、高壓蒸汽滅菌鍋、移液管、試管、燒杯、量筒、三角瓶、培養(yǎng)皿、玻璃漏斗等。3. 其他物品：藥匙、稱量紙、 ph 試紙、記號筆、棉花等。四、操作步驟（一）玻璃器皿的洗滌和包裝1玻璃器皿的洗滌玻璃器皿在使用前必須洗刷干凈。 將三角瓶、試管、培養(yǎng)皿、量筒等浸入含有洗滌

3、劑的水中 用毛刷刷洗，然后用自來水及蒸餾水沖凈。移液管先用含有洗滌劑的水浸泡，再用自來水及蒸餾水沖洗。洗刷干凈的玻璃器皿置于烘箱中烘干后備用。2滅菌前玻璃器皿的包裝（ 1） 培養(yǎng)皿的包扎：培養(yǎng)皿由一蓋一底組成一套，可用報紙將幾套培養(yǎng)皿包成一包，或者將幾套培養(yǎng)皿直接置于特制的鐵皮圓筒內，加蓋滅菌。包裝后的培養(yǎng)皿須經滅菌之后才能使用。（ 2） 移液管的包扎：在移液管的上端塞入一小段棉花( 勿用脫脂棉 ) ，它的作用是避免外界及口中雜菌進入管內，并防止菌液等吸入口中。塞入此小段棉花應距管口約0.5cm 左右， 棉花自身長度約11.5cm。塞棉花時 可用一外圍拉直的曲別針、將少許棉花塞入管口內。棉花要

4、塞得松緊適宜，吹時以能通氣而又不使棉花滑下為準。先將報紙裁成寬約5cm 左右的長紙條， 然后將已塞好棉花的移液管尖端放在長條報紙的一端，約成 45角，折疊紙條包住尖端，用左手握住移液管身，有手將移液管壓緊在桌面上向前搓轉，以螺旋式包扎起來。上端剩余紙條，折疊打結，準備滅菌。（二）液體及固體培養(yǎng)基的配制過程1液體培養(yǎng)基配制（ 1）稱量（假定配制1000ml 培養(yǎng)基）按培養(yǎng)基配方比例依次準確地稱取 3.0g 牛肉膏、10.0 g 蛋白胨、5.0gnacl 放入燒杯（或 1000ml 刻度搪瓷杯）中牛肉膏常用玻棒挑取，放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水溶化后倒入燒杯。（ 2）溶化在上述燒杯中先加入少于

5、所需要的水量（如約700ml），用玻棒攪勻，然后，在石棉網上加熱使其溶解，將藥品完全溶解后，補充水到所需的總體積（1000ml）；如果配制固體培養(yǎng)基時，將稱好的瓊脂放人已溶的藥品中，再加熱溶化，最后補足所損失的水分。（ 3）調 ph調 ph：一般用ph 試紙測定培養(yǎng)基的ph。用剪刀剪出一小段ph 試紙，然后用鑷子夾取此段ph 試紙，在培養(yǎng)基中蘸一下，觀看其ph 范圍，如培養(yǎng)基偏酸或偏堿時，可用1mol/l naoh或 1mol/lhcl 溶液進行調節(jié)。調節(jié)ph 時，應逐滴加入naoh 或 hci 溶液，防止局部過酸或過堿，破壞培養(yǎng)基中成分。邊加邊攪拌，并不時用ph 試紙測試，直至ph 達 7.

6、4-7.6。反之，用 1mol lhcl進行調節(jié)。2固體培養(yǎng)基的配制配制固體培養(yǎng)基時，應將已配好的液體培養(yǎng)基加熱煮沸，再將稱好的瓊脂(1.52 ) 加入，并用玻棒不斷攪拌，以免糊底燒焦。繼續(xù)加熱至瓊脂全部融化，最后補足因蒸發(fā)而失去水分。（三）培養(yǎng)基的分裝根據(jù)不同需要，可將已配好培養(yǎng)基分裝入試管或三角瓶內，分裝時注意不要使培養(yǎng)基沾污管口或瓶口， 造成污染。 如操作不小心， 培養(yǎng)基沾污管口或瓶口時， 可用鑷子夾一小塊脫脂棉，擦去管口或瓶口的培養(yǎng)基，并將脫脂棉棄去。1試管的分裝取一個玻璃漏斗，裝在鐵架上，漏斗下連一根橡皮管，橡皮管下端再與另一玻璃管相接，橡皮管的中部加一彈簧夾。分裝時，用左手拿住空試

7、管中部，并將漏斗下的玻璃管嘴插入試管內，以右手拇指及食指開放彈簧夾， 中指及無名指夾佐玻璃管嘴， 使培養(yǎng)基直接流入試管內。裝入試管培養(yǎng)基的量視試管大小及需要而定， 若所用試管大小為 15 150 mm時，液體培養(yǎng)基可分裝至試管高度1 4 左有為宜； 如分裝固體或半固體培養(yǎng)基時，在瓊脂完全融化后，應趁熱分裝于試管中。用于制作斜面的固體培養(yǎng)基的分裝量為管高1 5( 約 3-4mi) ，半固體培養(yǎng)基分裝量為管高的1 3 為宜。2三角瓶的分裝用于振蕩培養(yǎng)微生物時，可在250 m1 用于制作平板培養(yǎng)基用時，可在250 m1三角瓶中加入150ml被融化。粉 ( 按2計算) ，滅菌時瓶中瓊脂粉同時（四）棉塞

8、的制作及試管、三角瓶的包扎為了培養(yǎng)好氣性微生物，需提供優(yōu)良通氣條件，同時為防止雜菌污染，則必須對通入試管或三角瓶內空氣預先進行過濾除菌。通常方法是在試管及三角瓶口加上棉花塞等。1試管棉塞的制作制棉塞時，應選用大小、厚薄適中的普通棉花一塊，鋪展于左手拇指和食指扣成的團孔上，用右手食指將棉花從中央壓入團孔中制成棉塞然后直接壓入試管或三角瓶口。也可借用玻璃棒塞入，也可用折疊卷塞法制作棉塞。制作的棉塞應緊貼管壁，不留縫隙，以防外界微生物沿縫隙侵入，棉塞不宜過緊或過松，塞好后以手提棉塞，試管不下落為準。棉塞的 2 3 在試管內， 1 3 在試管外。目前也有采用硅膠塞代替棉塞直接蓋在試管口上。將裝好培養(yǎng)基

9、并塞好棉塞或硅膠塞的試管捆成一捆，外面包上一層牛皮紙。用記號筆注明培養(yǎng)基名稱及配制日期，滅菌待用。2三角瓶棉塞制作通常在棉塞外包上一層紗布，再塞在瓶口上。有時為了進行液體振蕩培養(yǎng)加大通氣量，則可用 8 層紗布代替棉塞包在瓶口上，目前也有采用硅膠塞直接蓋在瓶口上。在裝好培養(yǎng)基并塞好棉塞或包扎八層紗布或蓋好硅膠塞的三角瓶口上，再包上一層牛皮紙并用線繩捆好，滅菌待用。（五）培養(yǎng)基的滅菌將上述培養(yǎng)基以 0.103mpa， l21 ， 20min 高壓蒸氣滅菌。滅菌過程：1. 加水：首先將內層鍋取出，再向外層鍋內加入適量的水，使水面沒過加熱蛇管，與三角擱架相平為宜。切勿忘記檢查水位，加水量過少，滅菌鍋會

10、發(fā)生燒干引起炸裂事故。2. 裝料：放回內層鍋，并裝入待滅菌的物品。注意不要裝得太擠，以免妨礙蒸汽流通而影響滅菌效果。裝有培養(yǎng)基的容器放置時要防止液體溢出，三角瓶與試管口端均不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包扎的紙而透入棉塞。3. 加蓋：將蓋上與排氣孔相連的排氣軟管插入內層鍋的排氣槽內，擺正鍋蓋，對齊螺口，然后以對稱方式同時旋緊相對的兩個螺栓，使螺栓松緊一致，勿使漏氣，并打開排氣閥。4. 排氣：打開電源加熱滅菌鍋，將水煮沸，使鍋內的冷空氣和水蒸汽一起從排氣孔中排出。一般認為當排出的氣流很強并有噓聲時，表明鍋內的空氣已排盡，沸騰后約需5 分鐘。5. 升壓：冷空氣完全排盡后，關閉排氣閥，繼續(xù)加熱，鍋內

11、壓力開始上升。6. 保壓：當壓力表指針達到所需壓力時，控制電源，開始計時并維持壓力至所需的時間。如本實驗中采用 0.1mpa， 121.5 ， 20 分鐘滅菌。滅菌的主要因素是溫度而不是壓力，因此鍋內的冷空氣必須完全排盡后，才能關閉排氣閥，維持所需壓力。7. 降壓：達到滅菌所需的時間后，切斷電源，讓滅菌鍋溫度自然下降，當壓力表的壓力降至 0 后，方可打開排氣閥，排盡余下的蒸汽，旋松螺栓，打開鍋蓋，取出滅菌物品，倒掉鍋內剩水。壓力一定要降到 0 后，才能打開排氣閥，開蓋取物。否則就會因鍋內壓力突然下降，使容器內的培養(yǎng)基或試劑由于內外壓力不平衡而沖出容器口， 造成瓶口被污染，甚至灼傷操作者。（六）

12、斜面和平板的制作1斜面的制作將已滅菌裝有瓊脂培養(yǎng)基的試管， 趁熱置于木棒或玻棒上， 使成適當斜度， 凝固后即成斜面。斜面長度不超過試管長度 l 2 為宜。如制作半團體或固體深層培養(yǎng)基時， 滅菌后則應垂直放置至凝固。2平板的制作將裝在三角瓶或試管中已滅菌的瓊脂培養(yǎng)基融化后，待冷至 50左右傾入無菌培養(yǎng)皿中。度過高時，皿蓋上的冷凝水太多；溫度低于50，培養(yǎng)基易于凝固而無法制作平板。溫平板的制作應在火旁進行，左手拿培養(yǎng)皿，右手拿三角瓶的底部或試管，左手同時用小指和手掌將棉塞打開，灼燒瓶口，用左手大拇指將培養(yǎng)皿蓋打開一縫，至瓶口正好伸入，傾入 1015ml 培養(yǎng)基，迅速蓋好皿蓋，置于桌上，輕輕旋轉平皿

13、，使培養(yǎng)基均勻分布于整個平皿中，冷凝后即成平板。（七）培養(yǎng)基的滅菌檢查滅菌后的培養(yǎng)基， 一般需進行無菌檢查。 最好取出 12 管 ( 瓶 ) ，置于 37溫箱中培養(yǎng) 12 天，確定無菌后方可使用。篇二：微生物實驗報告膿汁和糞便標本中病原菌的檢測專業(yè)：學號：姓名：一、實驗目的探究檢測其病原菌的類型并通過一系列的觀察與鑒定從而確定其病原菌的名稱和性質。在實踐中學習培養(yǎng)基的制備、 消毒和滅菌， 細菌的分離與培養(yǎng)， 細菌群體和個體形態(tài)特征的觀察，細菌生化反應鑒定等技巧。 從而掌握微生物實驗的各種操作方法， 培養(yǎng)對微生物實驗的興趣。二、實驗材料器材打火機、油性筆、酒精燈、接種環(huán)、接種針、污物盤、普通冰柜

14、、隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱、奧林巴斯 cx21 型生物顯微鏡、電爐、試管（帶棉塞） 、稱量紙、藥勺、牛皮紙、硫酸紙、橡皮筋、尺子、錐形瓶、高壓蒸汽滅菌器、鑷子、玻片、吸水紙、拭鏡紙試劑藥品普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、蒸餾水、膿汁標本、糞便標本、石蠟油、生理鹽水、結晶紫、盧戈碘液、 95%乙醇、稀釋復紅、葡萄糖微量發(fā)酵管（2 支）、乳糖微量發(fā)酵管（2 支）、青霉素抗菌素紙片、鏈霉素抗菌素紙片、慶大霉素抗菌素紙片、血漿、福氏志賀菌診斷血清三、方法與步驟干粉培養(yǎng)基蒸餾水加熱溶化分裝集中放在試管筐里罩上硫酸紙、牛皮紙用橡皮筋扎好放入講臺邊的滅菌桶或滅菌筐內送到高壓蒸汽滅菌室（洗刷室）滅菌（ 1）平板培養(yǎng)基：傾注平

15、板 10ml瓊脂完全凝固后，平板倒放4冰箱保存?zhèn)溆?。?2）斜面培養(yǎng)基：培養(yǎng)基趁熱斜放瓊脂凝固以后， 4冰箱保存?zhèn)溆?。貼上標簽后滅菌使用?？諝獾募毦鷮W檢查每組 1 個營養(yǎng)瓊脂平板，選擇采樣地點（實驗室、衛(wèi)生間或任選地點）將平板蓋打開，蓋朝下放置在平板旁邊平板暴露于空氣中15min 平板倒扣蓋上作標記37溫箱培養(yǎng)24h觀察結果。人體體表的細菌學檢查甲乙常規(guī)洗手，丙丁標準洗手。甲和乙、丙和丁共用1 個平板按規(guī)定在普通平板上接種手指上的細菌。第1 格為洗手前，第2 格為洗手后，第3 格為消毒后，第 4 格空白對照。接種環(huán)燒灼滅菌分別取膿汁標本與糞便標本點在普通平板和依紅美藍平板上，各做兩份，燒掉接種

16、環(huán)上多余的標本冷卻后，應用分區(qū)劃線分離法，將膿汁標本接種于營養(yǎng)瓊脂平板（ 2 份），糞便標本接種于伊紅美藍平板（2 份）接種環(huán)燒灼滅菌將平板倒置37培養(yǎng)18 24h觀察結果。接種環(huán)燒灼滅菌挑選平板上典型的四種單菌落（白色、黃色、紫黑色、粉紅色）進行斜面接種純培養(yǎng)做好標記接種環(huán)燒灼滅菌斜面培養(yǎng)基置于37培養(yǎng)過夜保存?zhèn)溆酶锾m氏染色：取潔凈載玻片用滅菌操作后的接種環(huán)取生理鹽水1-2 環(huán)于玻片上挑取細菌培養(yǎng)物少許與鹽水輕輕抹勻待涂片干燥后在酒精燈火焰外側快速來回2-3 回合結晶紫初染1min水洗盧戈碘液媒染1min水洗 95乙醇脫色約20s 水洗稀釋品紅復染1min水洗吸干, 鏡檢。肉湯接種法:接種環(huán)

17、燒灼滅菌分別在斜面培養(yǎng)物中挑取菌苔少許立即移入肉湯培養(yǎng)基管中在接近液面的管壁上輕輕研磨沾取少量肉湯調和混勻試管口通過火焰 2-3 次滅菌塞好棉塞 35培養(yǎng) 46h接種環(huán)燒灼滅菌分別取之前實驗中得到的四種菌液在普通平板密集涂布接種環(huán)燒灼滅菌標記 : 青、鏈、慶鑷子火焰消毒貼青霉素、鏈霉素、慶大霉素紙片按壓鑷子消毒倒置37培養(yǎng) 18 24h 觀察結果取干凈玻片一張在左右兩邊分別滴加兔血漿1-2滴，生理鹽水1 滴接種環(huán)燒灼滅菌冷卻分別用接種環(huán)取之前實驗所得到的白色和黃色菌苔 (2 3 個菌落的菌量) 與血漿研磨混合邊混勻邊觀察結果接種環(huán)燒灼滅菌稍等片刻，觀察結果接種針燒灼滅菌用滅菌接種針分別刮取實驗

18、所得到的紫黑色和粉紅色菌苔分別接種在葡萄糖發(fā)酵微量管中和乳糖發(fā)酵微量管內接種環(huán)燒灼滅菌將微量管平放在平板內37培養(yǎng)過夜后觀察結果。接種針燒灼滅菌分別用接種針在紫黑色和粉紅色的斜面取菌從半固體培養(yǎng)基中心垂直刺入，可刺達近底管處，但不要到達管底循原來的路線退出接種針試管口迅速通過火焰2-3 次滅菌塞好棉塞燒灼滅菌接種針37培養(yǎng) 24h觀察結果取潔凈的載玻片一張將磨面近端設為對照區(qū)滴加生理鹽水15ul 遠端設為試驗區(qū)滴加福氏志賀菌診斷血清15ul 接種環(huán)燒灼滅菌用接種環(huán)分別取粉紅色菌苔研磨于鹽水或血清內，混合均勻接種環(huán)燒灼滅菌載玻片來回傾側觀察結果四、結果與討論對膿汁中細菌的分析討論1、用普通平板，

19、從膿汁標本中分離出金黃色和白色兩種菌落。2、在顯微鏡下觀察時，這兩種細菌均為g+球菌，排列不規(guī)則，呈葡萄串狀，是典型的葡萄球菌。3、結合菌落的顏色，可以初步斷定，這是金黃色葡萄球菌和白色葡萄球菌。4、通過血漿凝固酶試驗，觀察到黃色菌落的細菌能使血漿產生顆粒性物質，說明為凝固酶陽性；白色菌落則沒有凝集反應，說明其為凝固酶陰性。5、最后進行的是藥敏試驗，從培養(yǎng)基上可以觀察到，不同的抗生素所形成的抑菌圈不同。其中青霉素對金黃色葡萄球菌最敏感。對糞便中細菌的分析討論1、用伊紅美藍平板分離菌落時，可以從糞便標本中分離出紫黑色具有金屬光澤的菌落和粉紅色半透明菌落。2、在顯微鏡下觀察時，這兩種菌均為g- 桿

20、菌，排列不規(guī)則， 從形態(tài)上不能鑒別是什么細菌。3、經糖發(fā)酵試驗， 可以觀察到， 紫黑色的細菌能使葡萄糖和乳糖的試管變色和產生氣體；粉紅色的細菌只能使葡萄糖的試管變色。4、經半固體動力試驗，觀察到紫黑色的細菌使半固體培養(yǎng)基成渾濁狀態(tài)，粉紅色的細菌只在接種針插入的方向聚集。5、綜上所述，紫黑色的細菌為大腸埃希菌，粉紅色的細菌為志賀菌。6、最后進行藥敏試驗時，發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌對青霉素不敏感，對慶大霉素和鏈霉素都敏感。綜上所述，膿汁標本中分離得黃色菌落為金黃色葡萄球菌，白色菌落為白色葡萄球菌，致病菌為金黃色葡萄球菌； 糞便標本中分離得紫黑色菌落為大腸埃希菌， 粉紅菌落為福氏志賀菌，致病菌為福氏志賀菌。篇

21、三：微生物實驗報告動物微生物及免疫學實驗報告一、實驗目的（一）掌握一般培養(yǎng)基的制備原理及要求，掌握培養(yǎng)基酸堿度的測定，熟悉一般培養(yǎng)基的制備過程和各種器皿滅菌方法。（二）掌握細菌分離培養(yǎng)的基本要領和方法，掌握細菌抹片的制備方法和革蘭氏染色法及油鏡的使用方法，并認識革蘭氏染色的反應特性。（三）掌握學習用微生物學原理診斷疾病的一般方法及步驟。二、實驗用品（一）器材量筒、燒杯、電子天平、漏斗、三角燒瓶、空試劑瓶、玻璃棒、玻璃平皿、刻度吸管、ph 試紙、紗布、脫脂棉、天平、電爐、試劑瓶瓶塞、扎繩、放大鏡、包裝紙、洗耳球、酒精燈、載玻片、火柴、吸水紙、剪刀、記號筆、接種環(huán)、注射器、鑷子、鉗子、毫米尺、培養(yǎng)

22、箱、水浴培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌鍋、油鏡（二）試劑及材料肘胨、蛋白胨、豬膽鹽、氯化鈉、瓊脂、乳糖、0.01%結晶紫水溶液、0.5%中性紅水溶液、血清、胰化蛋白胨、 酵母提取物、 氫氧化鈉、 鹽酸、 牛血清、 革蘭氏染色液、 蒸餾水、 小白鼠、病豬內臟三、實驗步驟（一）培養(yǎng)基的制備（所有用到的器皿都已121高壓滅菌1530min，傾注平板在無菌操作臺內完成，并放在無菌操作臺內）1、麥康凱培養(yǎng)基（ 1） 組成：蛋白胨17g、肘胨 3g、豬膽鹽5g、氯化鈉5g、瓊脂 17g、乳糖10g、 0.01%結晶紫水溶液10ml、0.5%中性紅水溶液5ml 、蒸餾水 1000ml（ 2） 方法：將蛋白胨、肘胨、豬

23、膽鹽和氯化鈉溶解于400ml 蒸餾水中，調節(jié)液混合，分裝于燒瓶內，用紗布、扎繩等捆好后，121高壓滅菌1530min 。待冷卻至50 55 時，加入結晶紫和中性紅水溶液，搖勻后傾注平板。注：結晶紫和中性紅水溶液配好后需經高壓滅菌。2、血清平板（ 1） 組成：營養(yǎng)瓊脂、牛血清（ 2） 方法：將滅菌的營養(yǎng)瓊脂加熱熔化，冷卻至 4550時，加入牛血清，并混勻，傾注平板。注：不得將牛血清一并加入后再滅菌。3、 lb 培養(yǎng)基（ 1） 組成：胰化蛋白胨 10g、酵母提取物 5g、氯化鈉 10g、瓊脂 15g（ 2） 方法：在 950ml 蒸餾水中加入胰化蛋白胨、酵母提取物、瓊脂和氯化鈉，調節(jié) ph 至 7

24、.4 ，加熱熔化， 分裝于瓶中， 用紗布、 扎繩等捆好后， 121高壓滅菌1530min 。待冷卻至50 55 時，傾注平板。4、液體培養(yǎng)基（在lb 培養(yǎng)基的基礎上，裝入大試劑瓶中，不加瓊脂，不分裝）（二）病料取材在病豬死亡后，首先用顯微鏡檢查其末梢血液膜片中是否有炭疽桿菌存在，未發(fā)現(xiàn)，則立即用消毒的器械對其進行生理解剖，觀察其病理特征現(xiàn)象，取出病豬的十二指腸、胃、肝臟三處的組織物，并注意組織的完整性，用儲物袋密封保存。（三）細菌粗培養(yǎng)1、消毒滅菌： 操作人員先用消毒水清洗手或戴好實驗手套，再用消毒水對無菌操作臺內桌面及用酒精燈外焰對待用器械進行火焰滅菌。2、接種（ 1） 在無菌操作臺酒精燈旁

25、打開用儲物袋密封保存的病料，先左手持鑷子右手持剪刀，把病料剪出一個小口。（ 2） 右手持滅過菌的接種環(huán)，左手持平板，并用拇指、食指及中指將平皿揭開約 20 左右，然后將接種環(huán)前端插入小口旋轉一下后，再用劃線接種的方法接種到一個血清平板上。（ 3） 用記號筆在平板底部作好日期、操作人員、部位等標記，并將平板倒放。以此方法，分別接種十二指腸、胃粘膜、肝臟于血清平板上，各接種2 個血清平板。3、培養(yǎng)：將接種好的血清平板倒扣放入37培養(yǎng)箱中，反向培養(yǎng)24 小時。注：劃線接種時盡量劃開，以保證長出單個菌落，且劃線時接種環(huán)應盡量傾斜，以免劃破培養(yǎng)基（后同）待接種完畢后熄滅無菌操作臺內酒精燈，關閉好無菌操作

26、臺窗口，打開無菌操作臺內的紫外燈。 。；（四）細菌純培養(yǎng)1、菌落特征判斷待粗培養(yǎng)的細菌培養(yǎng) 24 小時后，取出用放大鏡觀察記錄單個小菌落的形態(tài)特征并用實驗報告紙記錄好，并在平板底部上做好觀察標記，其形態(tài)特征包括大小、形狀、菌落邊緣、表面構造、隆起度、濕潤度、透明度、顏色等。2、取單個菌落進行革蘭氏染色鏡檢（ 1） 取干凈的載玻片，用記號筆在其一面做好正反面標記，再在載玻片另一面中央滴上一小滴蒸餾水。（ 2） 將接種環(huán)在火焰上滅菌，待冷卻后，在酒精燈旁從標記的單個小菌落中取少許細菌置于蒸餾水中混勻（同時蓋好平板倒扣置于一旁），用接種環(huán)涂成直徑約1.5cm的菌膜，再在酒精燈火焰上方以鐘擺速度通過固

27、定好細菌，待冷卻進行染色。（ 3） 先滴加草酸結晶紫溶液染色12min，再水洗；然后滴加革蘭氏碘液溶液染色 12min，再水洗；隨后滴加95%的酒精脫色3060s，再水洗；最后滴加稀釋的品紅進行復染 3060s，再水洗；待干燥或吸水紙吸干后鏡檢。（ 4） 將干燥的載玻片放在 1000 倍油鏡下，滴加一滴松柏油進行鏡檢，觀察其形態(tài)特征，判斷細菌的種屬。3、細菌接種培養(yǎng)（ 1） 消毒滅菌：操作人員先用消毒水清洗手或戴好實驗手套，再用消毒水對無菌操作臺內桌面及用酒精燈外焰對待用器械進行火焰滅菌。（ 2） 接種：右手持滅過菌的接種環(huán)，左手持平板，并用拇指、食指及中指將平皿揭開約20 左右，然后將接種環(huán)

28、插入揭開的平板口內蘸去一下鏡檢標記的小菌落，再用劃線接種的方法接種到一個血清平板、lb 平板或麥康凱平板上。并用記號筆在平板底部作好日期、操作人員、菌種、部位等標記，將平板倒放。（ 3） 將接種好的平板倒扣放入37培養(yǎng)箱中，反向培養(yǎng)24 小時。注：油鏡用完后應立即清理物鏡上的松柏油；劃線接種時盡量劃開，以保證長出單個菌落；待接種完畢后熄滅無菌操作臺內酒精燈，關閉好無菌操作臺窗口，打開無菌操作臺內的紫外燈。（五）菌液的制備1、鏡檢：用革蘭氏染色法在1000 倍油鏡下鏡檢，觀察并記錄是否為純培養(yǎng)的細菌。2、分裝液體培養(yǎng)基：先對無菌操作臺及需要使用的器械進行消毒滅菌，然后用鉗子揭開一個空試劑瓶，用傾

29、倒的方法在酒精燈旁從液體培養(yǎng)基大試劑瓶中分裝于空試劑瓶內，并立即蓋上液體培養(yǎng)基大試劑瓶瓶塞。3、接種：右手持接種環(huán)，用火焰對其進行滅菌，待冷卻后，取出純培養(yǎng)的平板，在無菌操作臺內酒精燈旁，蘸去少許細菌，左手傾斜液體培養(yǎng)基，將接種環(huán)，伸入液體培養(yǎng)基內攪動，然后取出對接種火焰環(huán)滅菌，并用滅菌的包裝紙捆綁好后，用記號筆做好相應標記，置于一旁。4、培養(yǎng)搖菌： 將接種好的液體培養(yǎng)基置于水浴培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 小時。注：分裝一個培養(yǎng)基就接種一個培養(yǎng)基，不得全部分裝完后再一個一個接種。（六）小鼠致病性實驗1、保定：選擇健康的青壯年小白鼠，先用右手抓住尾巴，旋轉數(shù)周讓其眩暈，然后用左手的拇指和食指捏住兩耳及頭部皮膚，并翻轉左手，使其頭部朝下，以達到內臟前移的目的。2、接種：先用酒精棉球蘸取酒精對注射部位擦洗消毒，再用注射器注射吸取0.2ml 菌液注射于小白鼠腹腔中。3、觀察：將接種的小白鼠放在適宜的環(huán)境下生活，并在鼠籠處用記號筆標記好接種時間、菌種等。4、再培養(yǎng)鑒定：待小白鼠死亡后，對其進行解剖，觀察其內臟病變情況，并取肝臟直接涂在相應培養(yǎng)基上，在適宜條件下反向培養(yǎng)24 小時后，取菌落細菌進行鏡檢觀察判斷。注：在注射小白鼠2 小時候需要觀察小白鼠是否因注射時傷害到內臟而死亡。（七）生化