1、質(zhì)粒提取的原理、操作步驟、各溶液的作用細菌質(zhì)粒是一類雙鏈、閉環(huán)的DNA，大小范圍從1kb至200kb以上不等。各種質(zhì)粒都是存在于細胞質(zhì)中、獨立于細胞染 色體之外的自主復制的遺傳成份，通常情況下可持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外的游離狀態(tài)，但在一定條件下也會可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體的復制而復制， 并通過細胞分裂傳遞到后代。質(zhì)粒已成為目前最常用的基因克隆的載體分子，重要的條件是可獲得大量純化的質(zhì)粒DNA分子。目前已有許多方法可用于質(zhì) 粒DNA的提取，本實驗采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA。堿裂解法是一種應用最為廣泛的制備質(zhì)粒DNA的方法，其基本原理為：當菌體在NaOH和 SDS溶液中裂解時，蛋白質(zhì)與D

2、NA發(fā)生變性，當加入中和液后，質(zhì)粒DNA分子能夠迅速復性，呈溶解狀態(tài)，離心時留在上清中；蛋白質(zhì)與染色體DNA不變性 而呈絮狀，離心時可沉淀下來。純化質(zhì)粒DNA的方法通常是利用了質(zhì)粒DNA相對較小及共價閉環(huán)兩個性質(zhì)。例如，氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心、離 子交換層析、凝膠過濾層析、聚乙二醇分級沉淀等方法，但這些方法相對昂貴或費時。對于小量制備的質(zhì)粒DNA，經(jīng)過苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀 等簡單步驟去除殘余蛋白質(zhì)和RNA，所得純化的質(zhì)粒DNA已可滿足細菌轉化、DNA片段的分離和酶切、常規(guī)亞克隆及探針標記等要求，故在分子生物學實驗室 中常用。 一、試劑準備1. 溶液: 50mM葡萄糖，2

3、5mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。1M Tris-HCl<!-if !supportAnnotations->t1<!-endif-> (pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在10 lbf/in2高壓滅菌15min ，貯存于4。任何生物化學反應，首先要控制好溶液的pH，因此用適當濃度的和適當pH值的Tris-Cl溶液。50 mM葡萄糖最大的好處只是懸浮后的大腸桿菌不會快速沉積到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其實對質(zhì) 粒的抽提本身而言，幾

4、乎沒有任何影響。所以說溶液I中葡萄糖是可缺的。EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二價金屬離子的螯合劑，配 在分子生物學試劑中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生長。在溶液I中加入高達 10 mM 的EDTA，無非就是要把大腸桿菌細胞中的所有二價金屬離子都螯合掉。如果不加EDTA，其實也沒什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太長的時間里完 成質(zhì)粒抽提，就不用怕DNA會迅速被降解，因為最終溶解質(zhì)粒的TE緩沖液中有EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提質(zhì)粒呢？實話告訴你， 只要用等體積的水，或LB培養(yǎng)基來懸浮菌體就可以了。這是用新鮮的0.4 N的NaOH

5、和2的SDS等體積混合后使用的。要新從濃NaOH稀釋制備0.4N的NaOH，無非是為了保證NaOH沒有吸收空氣中的CO2而減弱了堿 性。很多人不知道其實破細胞的主要是堿，而不是SDS，所以才叫堿法抽提。事實上NaOH是最佳 的溶解細胞的試劑，不管是大腸桿菌還是哺乳動物細胞，碰到了堿都會幾乎在瞬間就溶解，這是由于細胞膜發(fā)生了從bilayer（雙層膜）結構向 micelle（微囊）結構的相變化所導致。用了不新鮮的0.4 N NaOH，即便是有SDS也無法有效溶解大腸桿菌（不妨可以自己試一下），自然就難高效率抽提得到質(zhì)粒。如果只用SDS當然也能抽提得到少量質(zhì)粒，因為 SDS也是堿性的，只是弱了點而已

6、。很多人對NaOH的作用誤以為是為了讓基因組DNA變性，以便沉淀，這是由于沒有正確理解一些書上的有關DNA變性復 性的描述所導致。有人不禁要問，既然是NaOH溶解的細胞，那為什么要加SDS呢？那是為下一步操作做的鋪墊。這一步要記住兩點：第一，時間不能過長，千 萬不要這時候去接電話，因為在這樣的堿性條件下基因組DNA片斷會慢慢斷裂；第二，必須溫柔混合（象對待女孩子一樣），不然基因組DNA也會斷裂。基因組 DNA的斷裂會帶來麻煩。3. 溶液：醋酸鉀（KAc）緩沖液，pH 4.8。5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml。4保存?zhèn)溆谩Ｈ芤篒II加入后就會有大量的沉淀，

7、但大部分人卻不明白這沉淀的本質(zhì)。最容易產(chǎn)生的誤解是，當SDS碰到酸性后發(fā)生的沉淀。如果你這樣懷疑，往1%的 SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是這么回事了。大量沉淀的出現(xiàn)，顯然與SDS的加入有關系。如果在溶液II中不加SDS會怎樣呢，也會有少量 的沉淀，但量上要少得多，顯然是鹽析和酸變性沉淀出來的蛋白質(zhì)。既然SDS不是遇酸發(fā)生的沉淀，那會不會是遇鹽發(fā)生的沉淀呢？在1的SDS溶液中慢慢加 入5 N的NaCl，你會發(fā)現(xiàn)SDS在高鹽濃度下是會產(chǎn)生沉淀的。因此高濃度的鹽導致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你會發(fā)現(xiàn)沉淀的量 要多的多。這其實是十二烷基硫酸鈉（sodium d

8、odecylsulfate）遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此發(fā)生了沉淀。如此看來，溶液III加入后的沉淀實際上是鉀離子置換了SDS中的鈉離子形成了不溶性的PDS，而高濃度 的鹽，使得沉淀更完全。大家知道SDS專門喜歡和蛋白質(zhì)結合，平均兩個氨基酸上結合一個SDS分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì) 沉淀了，讓<!-if !supportAnnotations->t3<!-endif-> 人高興的是大腸桿菌的基因組DNA也一起被共沉淀了。這個過程不難想象，因為基因組D

9、NA太長了，長長的DNA自然容易被PDS給共沉淀了，盡 管SDS并不與DNA分子結合。1.為什么用無水乙醇沉淀DNA？ 用無水乙醇沉淀DNA，這是實驗中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的優(yōu)點是可以任意比和水相混溶，乙醇與核酸不會起任何化學反應，對DNA很安全，因此是理想的沉淀劑。 DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當加入乙醇時，乙醇會奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般實驗中，是加2倍體積的無水乙醇與DNA相混合，其乙醇的最終含量占67左右。因而也可改用95乙醇來替代無水乙醇（因為無水乙醇的價格遠遠比95乙醇昂貴）。但是加95的乙醇使總體積增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶

10、解，因而DNA損失也增大，尤其用多次乙醇沉淀時，就會影響收得率。折中的做法是初次沉淀DNA時可用95乙醇代替無水乙酵，最后的沉淀步驟要使用無水乙醇。也可以用0.6倍體積的異丙醇選擇性沉淀DNA。一般在室溫下放置1530分鐘即可。 2.在用乙醇沉淀DNA時，為什么一定要加NaAc或NaCl至最終濃度達0.10.25mol/L？ 在pH為8左右的溶液中，DNA分子是帶負電荷的，加一定濃度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的負電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀，當加入的鹽溶液濃度太低時，只有部分DNA形成DNA鈉鹽而聚合，這樣就造成DNA沉淀不完全

11、，當加入的鹽溶液濃度太高時，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于過多的鹽雜質(zhì)存在，影響DNA的酶切等反應，必須要進行洗滌或重沉淀8.1ml預冷的70%乙醇洗滌沉淀1-2次，4離心8000g×7min，棄上清，將沉淀在室溫下晾干。9. 沉淀溶于20l TE（含RNase A 20g/ml），37水浴30min以降解RNA分子，-20保存?zhèn)溆谩Ｈ①|(zhì)粒DNA的電泳 檢測觀察瓊脂凝膠中DNA的最簡單方法是利用熒光染料溴化乙錠進行染色。構建目的基因的真核表達載體目的:構建目的基因的真核表達載體 歷時整整一學期,期間經(jīng)歷了很多挫折,遇到很多問題,也從中學到很多經(jīng)驗.借寒假的時間寫了寫我一學期構

12、建的經(jīng)歷,把我的一點經(jīng)驗拿出來和大家分享討論. 分步來說: 一.PCR擴增得到目的片段1.引物的設計與合成: 這里有很多血與淚的教訓。我前后一共送過九個載體測序，其中居然有五個是引物出錯。最后一次挑的兩個克隆都是上游引物出錯（此上游引物40個堿基） ，后來和這家引物公司交涉，他們拿走了我的板子，一次送了五個克隆測序，三個是上游引物出錯，兩個是正確的克隆，60的出錯率。現(xiàn)在想想，有幾點教訓：(1)盡量避免長引物的合成。越長意味著出錯的幾率越大，哪家公司都這樣(2)選擇一家質(zhì)量可靠的公司，千萬別在這省錢，引物再貴也花不了多少錢，可一輪構建下來，一測序發(fā)現(xiàn)引物錯了，不知白扔了多少錢不說，那種心情實在

13、是難以收拾（3）一旦發(fā)現(xiàn)引物有問題，及時換公司，我就讓他們拿回去又是純化又是重新合成過，結果還是錯，時間咱耽誤不起2.Pfu酶擴增：（1）擴增效率低的問題：往往taq酶擴的很好，一換成pfu就是擴不出來。解決辦法：a延長延伸時間(我1.2kb用3分15秒才擴出來)，并適當增加循環(huán)數(shù);b多試幾家的pfu，總有一家能擴出來;c多設計幾對引物試試，總有一對能擴出來，因為pfu有外切活性，可否適當?shù)难娱L引物的3互補端；d構建中間載體：一旦用某一對引物能擴出來，把此目的片段連接teasy中間載體，測序正確后，即可以此中間載體做pcr擴增的模板。實踐證明以此中間載體為模板的pfu擴增效率遠遠高于以cDNA

14、為模板。（2）pfu保真性的問題：即使是pfu，也會出錯。現(xiàn)在各家公司都有號稱高保真的pfu酶出售，價格不一。雖然都是pfu，但質(zhì)量不不見得一樣，在都能擴增出來的情況下，選擇信譽好的公司的pfu。我用的是一家小公司的pfu，很便宜，100u才80塊錢，但我1.2kb的片段卻頻頻出錯。所以萬不可在酶上省那百十塊錢，最后花了大錢不說，還浪費了時間精力。3cDNA模板的問題：在pfu摸條件這一步往往要耗費大量cDNA模板,因此在開始要準備足夠的cDNA。100ul，200ul都不為過。新提取的RNA證明很好的話，就再多逆轉錄幾管，我的RNA在80放了兩個月再逆轉錄就擴增不出目的片段了。當然這其中可能

15、有很多原因，酶的問題，RNA的降解等等，但是當你做PCR做到很煩的時候，發(fā)現(xiàn)cDNA模板不夠了，又重新養(yǎng)細胞提RNA是一件非常痛苦的事情。二酶切的問題：用于構建的酶切一定要非常充分！新買回來的酶要分裝，用于“酶切后回收”和“酶切鑒定”的酶要分開。因為用于“酶切鑒定”時，只要能切出來就行了，而用于“酶切后回收再做連接”的酶一定要保證切的充分，才能提高連接效率，更重要的是減少篩選時的麻煩！我有一段時間連挑了三十多個克隆都是空載體，當然一方面怪我沒有做載體自連的陰性對照，及時發(fā)現(xiàn)這一問題，另一方面酶反復從冰箱拿出來活性下降酶切效率降低，導致大量的載體自身連接。我覺得內(nèi)切酶這東西還是挺嬌氣的，所以還是

16、建議大家新酶分裝，用于“酶切鑒定”的可稍放松，用于“酶切后回收”的酶一定要盡量減少凍融次數(shù)，并盡量減少在室溫放置的時間。三PCR產(chǎn)物直接酶切：我設計引物時保護堿基時隨意的在酶切位點兩側加上了兩三個g或者c的組合，做到后來才知道加保護堿基也是有說法的，不同的保護堿基會影響酶切的效率。以我隨意加上的保護堿基，理論上酶切效率將極低。但做下來，前后酶切了四條不同的PCR產(chǎn)物，我并沒有再這一步上遇到問題，我一般37切30到35個小時，酶切效率都不錯。可見關于保護堿基的問題并不是那么絕對。四連接：再這一步上我最深刻的教訓就是關于做對照的問題。第一次酶切的載體做載體自連的陰性對照，僅長出了幾個克隆。為了省事，以后都省去了這一步。有兩周，我連續(xù)做了兩輪酶切連接篩選，總共挑了三十多個克隆，居然全是空載體！這時再補一個載體自連對照，滿板子都是菌落。再換兩支新酶重新切載體，回收后再自連，板子上僅有幾個菌落。為了省一點小事費了大力氣，后悔莫及。從此以后，認認真真做對照。另外，關于連接，我是用電泳的方法大概確定載體和目的片段濃度，然后一1：58左右的比例配連接體系，感覺還不錯。五粗篩：有很多種方法，我主要用過兩種：堿裂解粗提質(zhì)粒后酶切，費時費