1、1. 原核生物 DNA 具有哪些不同于真核生物 DNA 的特征？真核生物：真核基因組龐大。存在大量的重復序列。大局部為非編碼序列90 %。 轉錄產物為單順反子。 是斷裂基因， 有內含子結構。 存在大量的順式作用 元件啟動子、增強子、沉默子。存在大量的DNA多態性。具有端粒telomere 結構原核生物：基因組很小，大多只有一條染色體，且DNA含量少。 主要是單拷貝基因，只有很少數基因如rRNA基因以多拷貝形式存在。 整個染色體 DNA 幾乎全部由功能基因與調控序列所組成； 幾乎每個基因序列都與它所編碼的蛋白質序列呈線性對應狀態1. 試述基因克隆載體進化過程。 pSC101質粒載體，第一個基因克

2、隆載體 ColEI質粒載體，松弛型復制控制的多拷貝質粒 pBR322質粒載體，具有較小的分子量4363 bp。能攜帶6-8 kb的外源DNA片段，操 作較為便利 pUC質粒載體，具有更小的分子量和更高的拷貝數 pGEM-3Z質粒，編碼有一個氨芐青霉素抗性基因和一個lacZ'基因 穿梭質粒載體， 由人工構建的具有原核和真核兩種不同復制起點和選擇標記，可在不同的寄主細胞內存活和復制的質粒載體 pBluescript噬菌粒載體，一類從 pUC載體派生而來的噬菌粒載體2. 試述 PCR 擴增的原理和步驟。比照DNA 體內復制的差異。原理：首先將雙鏈 DNA 分子在臨近沸點的溫度下加熱別離成兩條

3、單鏈 DNA 分子， DNA 聚 合酶以單鏈 DNA 為模板并利用反響混合物中的四種脫氧核苷三磷酸、適宜的Mg2+ 濃度和實驗中提供的引物序列合成新生的 DNA 分子。步驟：將含有待擴增 DNA樣品的反響混合物放置在高溫94 C環境下加熱1分鐘， 使雙鏈 DNA 變性，形成單鏈模板 DNA 降低反響溫度退火，約50C，約1分鐘，使寡核苷酸引物與兩條單鏈模板DNA結合在靶 DNA 區段兩端的互補序列位置上 將反響混合物的溫度上升到 72C左右保溫1-數分鐘，在DNA聚合酶的作用下，從 引物的3'-端參加脫氧核苷三磷酸， 并沿著模板分子按 5't3'方向延伸，合成新生DNA

4、 互補鏈與體內復制的差異：PCR不產生岡崎片段在高溫條件下反響，不需要DNA解旋酶PCR可經過多個循環在體外進行，可調控1. 基因敲除原理：又稱基因打靶，通過外源 DNA 與染色體 DNA 之間的同源重組，進行精確的定點修 飾和基因改造，具有專一性強、染色體 DNA 可與目的片段共同穩定遺傳等特點 方法：高等動物基因敲除技術，植物基因敲除技術2. 完全基因敲除和條件型基因敲除完全基因敲除是指通過同源重組法完全消除細胞或者動植物個體中的靶基因活性，條件型基因敲除是指通過定位重組系統實現特定時間和空間的基因敲除3. 基因定點突變 原理：通過改變基因特定位點核苷酸序列來改變所編碼的氨基酸序列，用于研

5、究某個些氨基酸殘基對蛋白質的結構、 催化活性以及結合配體能力的影響， 也可用于改造 DNA 調控元件特征序列、修飾表達載體、引入新的酶切位點等方法：重疊延伸技術和大引物誘變法第七章1乳糖操縱子的正負調控一阻遏蛋白的負調控當細胞內有誘導物時， 誘導物結合阻遏蛋白， 此刻聚合酶與啟動 子形成開放式啟動子復合物轉錄乳糖操縱子結構基因。當無誘導物時，阻遏蛋白結合與啟動子與蛋白質局部重疊不轉錄。=CAP正調控當細胞內缺少葡萄糖時ATPt CAMP結合，CRP生成CAP與CAP位點結合，增前RNA聚合酶轉錄活性。當有葡萄糖存在時CAMP分解多合成少，CAP不與啟動子上的CAP位點結合RNA聚合酶不與操縱區

6、結合無法起始轉錄結構基因表達下降 2色氨酸可阻遏、可誘導操縱子3真核與原核生物基因轉錄有哪些差異？1只有一種 RNA聚合酶參與所有類型的原核生物基因轉錄，而真核生物有3種以上的RNA聚合酶來負責不同類型的基因轉錄，合成不同類型的、在細胞核內有不同定位的RNA2轉錄產物有差異。原核生物的初級轉錄產物大多數是編碼序列，與蛋白質的氨基酸序列呈線性關系；而真核生物的初級轉錄產物很大，含有內含子序列，成熟的mRNA只占初級轉錄產物的一小局部3原核生物的初級轉錄產物幾乎不需要剪接加工，就可直接作為成熟的 mRNA進一步行使翻譯模板的功能；真核生物轉錄產物需要經過剪接、修飾等轉錄后加工成熟過程才能成為成熟的

7、mRNA4在原核生物細胞中，轉錄和翻譯不僅發生在同一個細胞空間里，而且這兩個過程幾乎是同步進行的，蛋白質合成往往在 mRNA剛開始轉錄時就被引發了。真核生物mRNA的合成和蛋白質的合成那么發生在不同的空間和時間范疇內7蛋白質有哪些翻譯后的加工修飾？其作用機制和生物學功能是什么？ N端fMet或Met的切除細菌蛋白質氨基端的甲酰基能被脫甲酰化酶水解，不管是原核生物還是真核生物，N端的甲硫氨酸往往在多肽鏈合成完畢之前就被切除。 二硫鍵的形成mRNA中沒有胱氨酸的密碼子，而不少蛋白質都含有二硫鍵，這是蛋白質合成后通過兩個 半胱氨酸的氧化作用生成的。二硫鍵的正確形成對穩定蛋白的天然構象具有重要的作用。

8、 特定氨基酸的修飾氨基酸側鏈的修飾作用包括磷酸化、糖基化、甲基化、乙酰化、泛素化、羥基化和羧基化等。 切除新生肽鏈中的非功能片段由多個肽鏈及其他輔助成分構成的蛋白質，在多肽鏈合成后還需經過多肽鏈之間以及多肽鏈與輔基之間的聚合過程，才能成為有活性的蛋白質簡述大腸桿菌基因組和真核生物基因組的主要區別答：1、真核生物基因組指一個物種的單倍體染色體組 1n所含有的一整套基因。還包括葉 綠體、線粒體的基因組。原核生物一般只有一個環狀的 DNA分子，其上所含有的基因為一 個基因組。2、 原核生物的染色體分子量較小，基因組含有大量單一順序unique-sequences ，DNA僅有少量的重復順序和基因。真

9、核生物基因組存在大量的非編碼序列。包括：.內含子和外顯子、基因家族和假基因、重復 DNA序列。真核生物的基因組的重復順序不但大量，而且存在復雜譜系。3、原核生物的細胞中除了主染色體以外，還含有各種質粒和轉座因子。質粒常為雙鏈環狀DNA，可獨立復制，有的既可以游離于細胞質中，也可以整合到染色體上。轉座因子一般都是整合在基因組中。真核生物除了核染色體以外，還存在細胞器 DNA，如線粒體和葉綠體的 DNA，為雙鏈環狀,可自主復制。有的真核細胞中也存在質粒，如酵母和植物。4、原核生物的 DNA位于細胞的中央，稱為類核nucleoid丨。真核生物有細胞核，DNA序列壓縮為染色體存在于細胞核中。5、 真核

10、基因組都是由 DNA序列組成，原核基因組還有可能由RNA組成，如RNA病毒。試迷大腸桿鬧基國組和其核生物基肉組的仝婆&別一 ()一大腸FI満基爾I基舊璽很小，丈零貝右條集色體2茫構面煉3存左轉錄単止4零贖反予5竹垂產墓岡(一揆生物早問紐1真檢基閔爼紅構庚大2單販反了3基陽不11藝性4非褊礙區較霽5雷仃大區垂且序列第七章1簡述代謝物對基因表達調控的兩種方式。答： 轉錄水平上的調控；轉錄水平上的調控，包括mRNA加工成熟水平上的調控和翻譯水平上的調控3簡述乳糖操縱子的調控模型。答：A、乳糖操縱子的組成：大腸桿菌乳糖操縱子含Z、Y、A三個結構基因，分別編碼半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰轉移酶

11、，此外還有一個操縱序列 0, 個啟動子P和一個調節基因I。B、阻遏蛋白的負性調節： 沒有乳糖存在時，I基因編碼的阻遏蛋白結合于操縱序列0處，乳糖操縱子處于阻遏狀態，不能合成分解乳糖的三種酶；有乳糖存在時，乳糖作為誘導物誘 導阻遏蛋白變構，不能結合于操縱序列， 乳糖操縱子被誘導開放合成分解乳糖的三種酶。所以，乳糖操縱子的這種調控機制為可誘導的負調控。C、CAP的正性調節：在啟動子上游有 CAP結合位點，當大腸桿菌從以葡萄糖為碳源的環 境轉變為以乳糖為碳源的環境 時，cAMP濃度升高，與CAP結合，使CAP發生變構，CAP結 合于乳糖操縱子啟動序列附近的CAP結合位點，激活RNA聚合酶活性，促進結

12、構基因轉錄，調節蛋白結合于操縱子后促進結構基因的轉錄，對乳糖操縱子實行正調控，加速合成分解乳糖的三種酶。D、協調調節：乳糖操縱子中的I基因編碼的阻遏蛋白的負調控與CAP的正調控兩種機制，互相協調、互相制約。5什么是弱化作用？答：1.當培養基中色氨酸的濃度很低時，負載有色氨酸的tRNATrp也就少，這樣翻譯通過兩個相鄰色氨酸密碼子的速度就會很慢，當4區被轉錄完成時，核糖體才進行到1區或停留在兩個相鄰的trp密碼子處，這時的前導區結構是 2-3配對，不形成3-4配對的終止結構， 所以轉錄可繼續進行，直到將trp操縱子中的結構基因全部轉錄。2當培養基中色氨酸濃度較高時，核糖體可順利通過兩個相鄰的色氨

13、酸密碼子，在4區被轉錄之前就到達2區，使2-3區不能配對，3-4區自由配對形成基一環終止子結構，轉錄被終 止，trp操縱子被關閉。怎么去掉模板呢？再簡單的方法就是用Dpnl酶，Dpnl能夠識別甲基化位點并將其酶切，我們用的模板一般都是雙鏈超螺旋質粒，從大腸桿菌里提出來的質粒一般都被甲基化保護起來除非你用的是甲基化缺陷型的菌株，而PCR產物都是沒有甲基化的，所以Dpnl酶能夠特異性地切割模板質粒而不會影響PCR產物，從而去掉模板留下 PCR產物，所以提質粒時那些菌株一定不能是甲基化缺陷株,不會那么湊巧吧，哈哈。關于第三個問題：直接把通過 Dpnl處理的PCR產物拿去做轉化就行了，呵呵，然后再篩選

14、出陽性克隆，并 提出質粒，拿去測序這個就不用我多說了吧，驗證突變結果，一般都沒問題的啦，我做了幾十個突變了，到目前為止還沒有做不出來的，呵呵，不要砸我啊。要使動物中編碼激素的基因在 大腸桿菌中表達，通常遇到的問題有：(1) 細菌的RNA聚合酶不能識別 真核生物的啟動子。(2) 大多數真核基因有內含子，這些內含子在轉錄后從前體 mRNA中被切除而形成成熟mRNA。細菌細胞沒有這樣的機制來去除內含子。(3) 有些真核生物的蛋白質是通過前體分子加工而來的，例如胰島素就是通過加工去除前體分子內部的33個氨基酸殘基 而來，剩下的兩段 肽鏈分別形成胰島素的a、b鏈。(4) 產生的真核生物的蛋白質產物可以被

15、細菌的 蛋白酶所識別和降解。針對上述可能出現的問題，建議在克隆的過程中采取以下措施： 應將激素的編碼序列置于含有核糖體結合位點和起始密碼子ATG的細菌強啟動子的 附近(含有這種序列的載體稱表達載體)。 可以以激素的mRNA為模板用 反轉錄酶 合成激素的基因。這種 DNA不含內含子可插入到載體中進行克隆。此外，如果蛋白質序列短那么可通過化學合成得到該基因。合成的基因應含起始密碼 ATG、通過該激素蛋白的 氨基酸序列推測而來的 編碼序列，以及12個終 止密碼：ATG編碼序列TGA TAG現在，這個合成基因可被插入載體中。 有時加工過程可以在離體條件下進行。如果加工有困難，可以用合成基因，從而免除 加工過程。 選