1、通脈丸中竹節香附素A及總皂苷含量測定ThedeterminationofRaddeaninAandtotalsaponinsinTongmaipillCHENTianchao1,WANGJunjie21.DepartmentofPharmacy,TheFirstAffiliatedHospitalofHenanUniversityofTraditionalChineseMedicine,HenanProvince,Zhengzhou450000,China;2.PharmaceuticalCollege,HenanCollengeofTraditionalChineseMedicine,Hen

2、anProvince,Zhengzhou450008,ChinaObjective:ToestablishamethodforthedeterminationofRaddeaninAandtotalsaponinsinTongmaipill.Methods:AHPLCdeterminationofRaddeaninA,Chromatographicconditions:AgilentSB-AQchromatographiccolumn,GradientelutionbyAcetonitrileand0.1%phosphoricacidwaterasmobilephase,velocity0.8

3、ml/min,wavelengthwas206nm;ColorimetricmethodusedtoRaddeaninAasreference,5%vanillin-aceticacid-60%sulfuricacidasthecolorreagent,absorbancewasmeasuredat531nmtocalculatethetotalsaponincontent.Results:DeterminationofliquidReferencestandardofRaddeaninAqualitywaslinearintherangeof0.573-3.820g(R2=0.9996).T

4、heaveragerecoverywas99.63(RSD=1.05);ColorimetricmethoddeterminationRaddeaninAqualitywaslinearintherangeof0.0242-0.2178mg(R2=0.9996).Theaveragerecoverywas100.05(RSD=1.69).Conclusion:EstablishedTongmaipillofRaddeaninAandtotalsaponinsmethodforthedetermination,thismethodissimple,accurate,stable,forquali

5、tycontrolandpreparationofthesecondarydevelopmentofnewagentstoprovidetechnicalsupport.通脈丸是由附子、黃芪、兩頭尖、制馬錢子、當歸、赤芍、甘草等中藥組成的純中藥制劑，是本院名老中醫、全國周圍血管專業主任委員崔公讓教授的經驗處方，已有30余年的使用歷史。具祛風濕，通經絡，消痛腫之功效。用于風寒濕痹，四肢痙攣，骨節疼痛，癰腫，動脈硬化閉塞癥、血栓閉塞性脈管炎，大動脈炎等動脈缺血性疾病所致寒凝脈絡型脫疽。現代研究表明，處方中主要含有皂苷類、黃酮類、多糖類等有效成分，其中，皂苷類成分是通脈丸發揮藥理效應的主要成分之一，

6、文獻1-3表明：兩頭尖具有“祛風除濕，消癰腫”之功效；現代臨床用于風寒濕痹，四肢拘攣，骨節疼痛，癰疽潰爛；其竹節香附素A等皂苷類成分是發揮藥效的物質基礎。筆者采用HPLCf比色法對竹節香附素A及總皂苷進行含量測定，對其制劑的質量控制及新制劑的開發具有重要意義。1 儀器與試藥1.1 儀器高效液相色譜系統Waterse2695、Waters2998PDA檢測器（美國），TU-1800PC紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器XX公司），AEL-200電子天平（日本島津），HH-S4型電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器XX公司），KDMfe子控溫電熱套（山東鄴城新華儀器廠）。1.2 試藥竹節香附素A對照

7、品（批號：201008,純度98%四川維克奇生物科技XX公司），實驗中所用藥材均購于河南中醫學院第一附屬醫院中一公司，經鑒定均符合中國藥典2010年版各品種項下規定，娃哈哈純凈水，甲醇、乙腈、磷酸為色譜純，其他均為分析純。2 方法與結果2.1 竹節香附素A含量測定2.1.1 色譜條件AgilentSB-AQ色譜柱（4.6mmx250mm5以m）,流動相乙睛-0.1%磷酸溶液，梯度洗脫程序：020min（乙睛39%-44%,2025min（乙睛44%,2529min（乙睛44唳39%,2939min（乙睛39%,流速0.8ml/min,柱溫30，檢測波長206nm。2.1.2 對照品溶液的制備精

8、密稱取竹節香附素A對照品1.91mg，置10ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制成濃度為0.191mg/ml對照品溶液。2.1.3 供試品溶液的制備按通脈丸1/4處方量稱取各味藥材共計155.375g，置圓底燒瓶中加7倍量70%乙醇溶液，加熱回流3次，每次80min，合并提取液，備用。2.1.4 陰性對照溶液的制備按處方比例稱取除兩頭尖外其余藥材，按2.1.2供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。2.1.5 陰性干擾試驗取上述對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液，分別注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定，記錄色譜圖，供試品與對照品在相同保留時間處有色譜峰，陰性對照在此保留時間處無干擾峰(圖

9、13)。2.1.6 線性關系考察取對照品溶液3、5、10、15、20按上述的色譜條件，注入液相色譜儀，測得峰面積，以對照品進樣量為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程Y=71649X+13696(R2=0.9996)，表明竹節香附素A在0.5733.82011g呈良好線性關系。2.1.7 精密度試驗精密吸取竹節香附素A供試品溶液，重復進樣6次，竹節香附素A峰面積的RS防0.72%(n=6),表明儀器精密度良好。2.1.8 穩定性試驗精密吸取通脈丸醇提供試品溶液，分別在0、1、2、4、8、12、24h進行測定，記錄色譜圖，測得竹節香附素A含量RS防1.26%,表明供試品溶液穩定性

10、良好。2.1.9 重復性試驗平行吸取 6 份同一批供試品溶液，按上述色譜條件連續測定6次，結果RS防0.76%(n=6),表明此方法的重復性良好。1.1.10 加樣回收率試驗精密量取已知含量的樣品9份，每份10ml，分別精密加入不同體積竹節香附素A對照品溶液，混勻。按上述色譜條件測定竹節香附素A含量，計算回收率，結果見表1。1.1.11 驗證試驗按處方比例平行取三份樣品按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定，計算竹節香附素A含量，分別為0.0748、0.0739、0.0720mg/ml。2.2 總皂苷含量測定2.2.1 對照品溶液的制備精密稱取竹節香附素A對照品2.2.2

11、mg于10ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成濃度為0.242mg/ml的對照品溶液。2.2.3 供試品溶液的制備按通脈丸1/4處方量稱取各味藥材共計155.375g，置圓底燒瓶中加7倍量70%乙醇溶液，加熱回流3次，每次80min，合并提取液，放冰箱中備用。精密量取醇提液(室溫)20ml于蒸發皿中，水浴蒸干，用10ml水溶解殘渣，置分液漏斗中用水飽和正丁醇萃取3次，每次20ml，合并正丁醇液置蒸發皿中蒸干，甲醇溶解殘渣并轉移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，再精密量取甲醇定容液1ml于25ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。2.2.4 測定波長的選擇精密量取0.5ml竹節香附素A對照品溶

12、液與1ml供試品溶液置具塞試管中，水浴蒸干，加入5%香草醛-冰乙酸（臨用新配）0.5ml，60%硫酸溶液3ml，搖勻，60水浴顯色20min后取出立即冰水浴5min，搖勻。立即在紫外-可見分光光度計于440660nm波長范圍下掃描，同時以空白溶液作參比。對照品及供試品均在531nm有特征吸收，故選531nm為檢測波長。吸收光譜見圖4、5。2.2.5 線性關系考察精密量取竹節香附素A對照品溶液0.10、0.30、0.50、0.70、0.90ml,置具塞試管中，水浴蒸干，加入5%香草醛-冰乙酸（臨用新配）0.5ml，60%硫酸溶液3ml，搖勻，60水浴顯色20min后取出立即冰水浴5min，搖勻。

13、以同法平行處理的空白溶液為空白對照，在531nm處測定吸光度。以對照品質量（m（g）為橫坐標，吸光度A為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程：Y=4.3368X-0.0008，（R2=0.9990），在0.02420.2178mg范圍內線性關系良好。2.2.6 精密度試驗精密量取供試品溶液0.5ml于具塞試管中，依“2.2.4”項下顯色方法在531nm測定吸光度，連續測定6次，結果RS肪0.36%（n=6）,表明儀器精密度良好。2.2.7 穩定性試驗精密量取供試品溶液0.5ml于具塞試管中，依“2.2.4”項下方法顯色，并分別在顯色后0、5、10、15、20min在531nm處測定吸光度，結果RS

14、防0.43%,可見本測定方法在顯色20min內，吸光度值比較穩定，因此，測定最好在20min內完成。2.2.8 重復性試驗平行制備6份供試品溶液，依“2.2.4”項下顯色方法在531nm測定吸光度，連續測定6次，結果RSD為0.56%(n=6),表明此方法的重復性良好。2.3 加樣回收率試驗精密量取已知總皂苷含量供試品9份，每份0.5ml，分別加入不同體積的竹節香附素A對照品溶液，混勻，依“2.2.4”項下顯色方法在531nm測定吸收度，計算回收率，結果如表2。3討論色譜方法及梯度條件選擇：本法依據2010年版中國藥典2中竹節香附素A含量測定方法，但藥典中方法并不理想，更適合藥材中竹節香附素A的含量測定；復方中成分復雜，干擾程度大，藥典方法需改進。筆者考察了甲醇-水4、乙腈-冰醋酸溶液、乙腈-磷酸溶液等不同流動相及不同梯度條件，結果表明使用乙腈-0.1%磷酸溶液梯度洗脫分離效果最好，出峰時間適宜。通脈丸醇提液中主要含有竹節香附素A、黃黃甲甘、甘草酸類等皂苷類成分，單一測定某一成分具有片面性，不能有效代表處方中發揮藥理效應的化學成分，因此采用比色法測定復方中總皂苷，從整體上把握處方中有效成分。文獻5-7供選擇的顯色劑有香草醛-高氯酸、濃硫酸-甲醇、茴香醛-高氯酸和香草醛-濃硫酸等測定