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文檔簡介

1、RT-PCR全過程步驟一試劑材料準備1、塑料制品：（包括槍頭、EP管、勻漿管等）先將DEPC水從容量瓶中倒入瓷缸中，將塑料制品逐個浸泡其中，其中小槍頭需要吸管打入DEPC水，過夜，然后高壓，再烤干備用，實驗前將槍頭等放入吸頭臺，再高壓一次（EP管）2、玻璃制品：泡酸過夜，沖洗干凈，蒙錫紙烤干備用（DEPC水泡）（洗凈后先泡1DEPC過夜，再烤干）3、勻漿器：（包括剪刀、鑷子）先洗凈后，再高壓（不需要泡DEPC）三、試劑配制：1、DEPC水：吸出1ml放在1000ml雙蒸水中配成1DEPC水，放在1000ml容量瓶中靜置4小時備用。2、75%乙醇：用無水乙醇 DEPC水配，然后放-20保存（其中

2、DEPC水需先高壓）3、異丙醇：放入棕色瓶中4、氯仿：放入棕色瓶中5、瓊脂糖二總RNA提取1. 取100mg組織，放到1.5mlEP管中，加入1mlTrizol剪碎。(1)液氮研磨，組織塊直接放入研缽中，加入少量液氮，迅速研磨，待組織變軟，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按 50-100mg 組織/ml Trizol 加入 Trizol，轉入離心管進行第 2 步操作。(2) 勻漿：組織樣品按 50-100mg/mlTrizol 加入 Trizol。另外，組織體積不能超過 Trizol 體積的 10%，否則勻漿效果會不好，用電動勻漿器充分勻漿約需 1-2 分鐘。2. 震蕩30s，室溫放置 5mi

3、n，使其充分裂解。12,000rpm 離心 5min，棄沉淀。3. 加0.2ml氯仿，搖動30s，室溫5-10min。注：禁用漩渦振蕩器，以免基因組 DNA 斷裂。4. 12000×g，4離心，15min。5. 吸上層無色水相，移入另一EP管中（約0.5ml）。6. 加等體積異丙醇，室溫放置 5-10min。7. 12000×g，4離心，10min。在管底部可見微量RNA沉淀8. 棄上清，加冰預冷75%乙醇1ml，溫和振蕩，懸浮沉淀。9. 8000×g，4離心，10min。10. 棄上清，用濾紙小心吸取殘留液體，室溫干燥5-10min。11. 沉淀溶于20lDEP

4、C水(可用20ul H2O，TE buffer或 0.5%SDS溶解RNA樣品，55-60,5-10min。注：H2O、TE或 0.5%SDS均須用DEPC處理并高壓。)，取1l加入79lDEPC水測OD260/OD28012. 計算濃度與純度，-70保存。三、逆轉錄合成cDNA第一鏈反應體系如下總體系20l約3gRNA量+1l Oligo dT+water=12l5*RTbuffer 4ldNTP 2lRNase inhibitor 1lAMV Reverse Transpase 1l溫度42 1小時冰上配制混勻快速離心一次反應條件如下-20 冰箱凍存四、PCR反應混勻快速離心一次反應條件如下PCR產物-20冰箱保存取PCR產物8l 加5×

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