1、條件性敲除小鼠定義：條件性基因敲除小鼠（也叫Flox小鼠）是指在目的基因中含有成對的loxp位點(diǎn)的小鼠，與Cre工具小鼠交配后可在特定的組織或細(xì)胞中敲除目的基因。l CKO如何實(shí)現(xiàn)？重組酶系統(tǒng)（如：Cre-loxP）介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性重組技術(shù)。Cre是重組酶（38kDa），可識別 34bp 長的 DNA 序列l(wèi)oxP。loxP 兩側(cè)各 13bp 構(gòu)成回文結(jié)構(gòu)，中間 8bp為非回文結(jié)構(gòu)，因此loxp具有方向性。（當(dāng) DNA 分子上存在兩個同向 loxP 序列時，Cre可將兩個loxP 序列之間的DNA 片段切出并環(huán)化，同時將 loxP 兩側(cè)的序列進(jìn)行連接；當(dāng) DNA 分子上存在兩個方向相反的 lo

2、xP 序列時，Cre 可導(dǎo)致 loxP 之間的序列發(fā)生反轉(zhuǎn)。）l CKO敲除的是什么？條件性基因敲除的靶基因中必須帶有可以被 Cre 重組酶識別的 loxP 序列，這種基因稱為 floxed gene。帶有 floxed 靶基因的小鼠稱為 flox 小鼠。在這種小鼠中，通常采用 DNA 同源重組方法，在擬敲除基因片段的兩側(cè)分別放置一個同向的 loxP 位點(diǎn)。loxP 位點(diǎn)的存在應(yīng)不影響該基因的功能，故選擇對照為flox/flox小鼠l CKO敲除何時何地發(fā)生？除了 flox 小鼠以外，重組酶系統(tǒng)介導(dǎo)的條件性基因敲除還需要另一類重要的基因工程小鼠的參與Cre 工具鼠。Cre 工具鼠中，將 Cre

3、 重組酶的編碼序列置于特定的基因啟動子下，Cre 的表達(dá)特性決定了靶基因何時何地發(fā)生敲除。Cre 在哪一種組織細(xì)胞中表達(dá)，靶基因的敲除就發(fā)生在哪種組織細(xì)胞；Cre 的表達(dá)水平將影響靶基因在此種組織細(xì)胞中進(jìn)行修飾的效率；使用誘導(dǎo)型Cre 重組酶可以通過給予誘導(dǎo)劑，決定在特定的發(fā)育時期或疾病發(fā)生階段，定時地進(jìn)行基因敲除。（范衡宇老師課件）實(shí)驗(yàn)時，將 flox 小鼠和 Cre 工具鼠進(jìn)行交配，最后獲得 flox 純合且 Cre 雜合的小鼠。在這類小鼠中，凡是表達(dá) Cre 的細(xì)胞，兩個 loxP 之間的序列被切除，從而實(shí)現(xiàn)組織特異性基因敲除。（參考資料：南方模式生物官網(wǎng)）l 交配策略 將獲得的flox

4、雜合子小鼠（geneflox/+）分成兩部分：1. flox/+小鼠與Cre小鼠交配，同時獲得flox陽性且Cre陽性小鼠（該小鼠簡寫為：geneflox/+；Cre+），flox陽性且Cre陰性小鼠（geneflox/+）；2. flox小鼠自交，獲得flox純合（該小鼠簡寫為：geneflox/flox）和flox雜合小鼠（geneflox/+）。 為獲得flox純合且Cre陽性的小鼠，可有兩種繁育方法選擇：1. 將獲得的flox和Cre雙陽性雜合子小鼠（geneflox/+：Cre+）與flox雜合子小鼠（geneflox/+）交配，最終獲得flox純合且Cre陽性的實(shí)驗(yàn)組小鼠（該小鼠簡

5、寫為：geneflox/flox；Cre+，該小鼠所占后代比例為：1/8）和flox純合且Cre陰性的對照組小鼠（geneflox/flox，該小鼠所占后代比例為：1/8）；2. 將獲得的flox和Cre雙陽性雜合子小鼠（geneflox/+：Cre+）與flox純合子小鼠（geneflox/flox）交配，最終獲得flox純合且Cre陽性的實(shí)驗(yàn)組小鼠（geneflox/flox；Cre+，該小鼠所占后代比例為：1/4）和flox純合且Cre陰性的對照組小鼠（geneflox/flox，該小鼠所占后代比例為：1/4）。 后續(xù)實(shí)驗(yàn)（實(shí)驗(yàn)組：geneflox/flox；Cre+，對照組：實(shí)驗(yàn)組：g

6、eneflox/flox）為快速獲得上述所需小鼠，可將geneflox/flox；Cre+小鼠與geneflox/flox小鼠雜交l 小鼠基因型鑒定 小鼠編號原則 Flox小鼠基因型鑒定（用于鑒定flox純合、雜合和野生型）PCR鑒定引物位置示意圖（可選擇P1,P2引物對，或P3,P4，P1,P4引物對） 目的基因組織特異性敲除效果驗(yàn)證（1） DNA水平cre活性驗(yàn)證通常是取一小塊表達(dá)Cre的組織，抽提基因組DNA，通過PCR的方法對flox區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，通過flox區(qū)域的有無，定性判斷Cre是否發(fā)揮作用。（2） RNA水平cre敲除效率驗(yàn)證通常是取一小塊表達(dá)Cre的組織，抽提RNA，反轉(zhuǎn)錄成

7、cDNA后，通過Realtime-PCR的方法，利用Cre作用后的mRNA ，所設(shè)計(jì)的引物無法擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物的原理，定量判斷Cre作用效率。（3） 蛋白水平cre敲除效率驗(yàn)證目的組織western blot或免疫組化檢測。原理：表達(dá)cre的組織無法檢測到目的蛋白。 動物組織DNA抽提1) 250ul 裂解液+2.5ul proteinase K(10mg/ml) 直接消化組織，放于55恒溫?zé)嵩∵^夜2) 加入同體積（250ul）苯酚：氯仿：異戊醇混合物（使用前搖晃瓶身混勻），上下劇烈震蕩15s，12000rpm,15min常溫離心3) 轉(zhuǎn)移上清于新的EP管（期間可能會吸起白色絮狀物，無妨）4)

8、 加入等體積的異丙醇，上下劇烈震蕩15s,12000rpm,15min常溫離心5) 倒掉上清（也可用真空泵吸，小心底部沉淀），用75%乙醇（400ul），7500rpm, 5min（可多清洗2遍）6) 將管壁內(nèi)部及管蓋上的殘留乙醇吸干，沉淀相對較干，根據(jù)不同體積加入ddH2O注：因沒加RNA酶，可能會殘余RNA，A260/280會居于1.9以上，但PCR無妨lysis buffer配制（裂解液）：先加水500ml，再加各種成分，最后定容到1L成分配置（1L）1M Tris 8.0-100x10mL5M Tris 8.0-50x20mL0.5M EDTA-20x50mL10% SDS50mLl

9、小鼠飼養(yǎng)及繁殖期間遇到的問題Q：小鼠合籠后，很久都不懷孕？A：考慮換雌鼠或雄鼠，重新交配Q：小鼠合籠后，雄鼠和雌鼠比例及年齡選擇？A：雄：雌一般1：2或1：3，不要太多雌鼠。雄鼠至少8w，9-10w更為合適；而雌鼠一般選擇6w及以上。Q：什么時候分籠？A：大小鼠的哺乳期是20-22d，3周齡可離乳獨(dú)立生活，因此出生3周后即可將幼鼠與母鼠分開，獨(dú)立生活。視小鼠生長情況，可多哺乳幾天。有時為避免籠盒中同時存在兩胎幼鼠，導(dǎo)致新生的幼鼠被上一胎幼鼠踩踏致死的情況，在19d左右即可將其分籠。分籠時需要標(biāo)記新生小鼠，選擇減腳趾，或打耳釘（耳釘一定要訂的足夠好，否則后續(xù)會被小鼠抓掉）雌鼠4周齡陰腔開張，雄鼠

10、5周齡睪丸降落至陰囊，開始形成精子。因此，4周齡前一定要進(jìn)行分籠，以免發(fā)生交配Q：母鼠吃仔怎么辦？A：1. 雌鼠與雄鼠合籠交配后，雄鼠可以一直與孕鼠一起生活，這樣有利于孕鼠整個妊娠過程的穩(wěn)定以及仔鼠的出生與哺乳。2. 懷孕的雌鼠（一般兩只）一起生活，或?qū)言屑拔磻言械拇剖笤谝黄稹Ｈ欢^對不要在雌鼠分娩前幾天再在籠舍中加入新的雌鼠，這樣會打擾到孕鼠以及新生仔鼠；要等仔鼠斷奶（21天）后才能再將雄鼠放入繁殖籠內(nèi)。3. 第一胎分娩或太過于年輕的新手母鼠育成仔鼠的成功率比有經(jīng)驗(yàn)或較為年長的雌鼠要低。仔鼠出生第一天盡量不要打擾母鼠與幼仔，到第二天母鼠就比較能容忍被打擾的狀況了。4. 若一直持續(xù)吃鼠，選

11、擇換孕鼠。Q：如何準(zhǔn)確知道小鼠懷孕天數(shù)？A：傍晚5-6點(diǎn)將雌鼠雄鼠合籠，第二天早晨8點(diǎn)檢查雌鼠是否有陰道栓（下圖所示）。有陰道栓的當(dāng)天中午算為胚胎第0.5天。檢栓后，未見到栓的雌雄鼠分開，至下午再進(jìn)行合籠。不過，觀察到陰道栓只能說明發(fā)生了交配行為，并不能完全作為懷孕的標(biāo)志，見到栓以后仍可能發(fā)生未懷孕的情況。小鼠表型觀測參考點(diǎn)：體型差異、毛發(fā)、體重、活動能力，最關(guān)鍵還是要結(jié)合敲除或敲入基因的具體功能常見的肝癌模型1. 誘發(fā)性肝癌模型：DEN, DEN+CCl4，HFD+CD+CCl42. 移植性肝癌模型：異位移植即皮下成瘤，原位移植（肝臟，經(jīng)脾臟）3. 基因敲除鼠（如HBV-TG, PTEN,

12、APC, miR-122肝特異性敲除, Myc肝特異性過表達(dá)）4. 高壓尾靜脈HTVI誘發(fā)性肝癌模型Treatment( Intraperitoneal injection)Mouse strainAgePost-Intrasplenic inoculation(#tumor/# total mice)20mg/kg DENC57BL-male12day8month-8.5month 20mg/kg DENC57BL-female12day9month-10month l DENl DEN+CCl420mg/kg DEN, injected at day 12 of C57BL mice.1u

13、l/g of 20% of CCL4 (diluted by Olive), start from week 4 of mice, once a week, for 14-18 weeks (Male-16week, female-17week)移植性肝癌模型l 皮下成瘤subcutaneous tumor formation注意點(diǎn)（1） 腫瘤細(xì)胞系選擇（2） 小鼠品系選擇：Nude, NOD/SCID, NSG（3） 接種部位：腋下、腹股溝、側(cè)腹部及頸背部（血管豐富且易操作部位）操作步驟（1） 腫瘤細(xì)胞的傳代擴(kuò)增確保腫瘤細(xì)胞的活力和良好的生長狀態(tài)（病毒感染可選擇再傳代擴(kuò)增；若siRNA或質(zhì)粒

14、轉(zhuǎn)染處理細(xì)胞不建議傳代擴(kuò)增，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24小時，保證最大效率。siRNA取決于平時做實(shí)驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)。）（2）計(jì)算細(xì)胞接種量結(jié)合文獻(xiàn)來確定細(xì)胞接種量，在找不到相關(guān)資料的情況下，最高就用到1000萬/0.1ml，不可再高（因?yàn)榧?xì)胞懸液已達(dá)飽和狀態(tài)）。并且提前計(jì)算確定細(xì)胞數(shù)量，一般注射40只小鼠，至少需要準(zhǔn)備50只小鼠的細(xì)胞量。（3）準(zhǔn)備裸鼠一般選擇5-6W裸鼠，小于4W動物可能不耐受而過早死亡，大于6W免疫力會增強(qiáng)，不易成瘤；雌雄均可（4）操作步驟 預(yù)準(zhǔn)備：matrigel 4過夜融化，若1人操作可選擇使用呼吸麻醉儀，去鼠房前可考慮打一盒冰和帶上移液器和槍頭，用注射器不好重懸細(xì)胞 接種時選擇好部位進(jìn)針，

15、建議接種前酒精棉球擦拭消毒進(jìn)針位置（實(shí)驗(yàn)室選擇以后腿股）； 向前方穿行，注射前針頭稍微動一動，能動說明在皮下，否則可能在皮內(nèi)或者肌肉內(nèi)； 針頭在皮下走一段再注射，速度不可太快，一般體積為100-200L（PBS或者無血清培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞，若不易成瘤可添加matrigel促進(jìn)成瘤），可看見明顯的鼓包； 接種點(diǎn)離進(jìn)針點(diǎn)盡量較遠(yuǎn)，減少漏液和污染的可能； 注射完畢后，緩慢旋轉(zhuǎn)退出針頭（Z字型扭），盡量避免漏液； 細(xì)胞需一直置于冰上，使細(xì)胞處于比較低的代謝狀態(tài)，一般2h之內(nèi)不會有問題。（5）后續(xù)實(shí)驗(yàn)安排 分組：一般來說皮下荷瘤主要用于抗腫瘤藥物的檢測，因此我們一般分為對照組，陽性藥物組，低劑量、中劑量及高

16、劑量藥物組等； 數(shù)量：荷瘤時每組不少于10只，考慮到小鼠成瘤率和死亡原因，最終實(shí)驗(yàn)應(yīng)至少可以獲取6個有效數(shù)據(jù)； 給藥時間：一般接種7-10天后便可看到腫瘤長起，便可分組實(shí)驗(yàn)（鼠源細(xì)胞系會更快）； 人道終點(diǎn)：動物倫理學(xué)規(guī)定，小鼠腫瘤重量不可超過小鼠體重10%，平均腫瘤直徑不超過20mm，并且如果出現(xiàn)潰爛，造成感染或壞死時，應(yīng)該中止實(shí)驗(yàn)且對動物施行安樂死。（參考資料：參考劑量和處理時間Cell lineMouse strainAgeHCC formation Huh7 cell (106/flank,100ul PBS+ 100ul matrigel )BALB/c nude mice(Male)

17、5w18day(first), 25day (almost)Huh7 cell (106/flank,100ul DMEM+ 100ul matrigel )BALB/c nude mice(Male)5w14day(first), 20day (almost)HLE cell (5*106/flank,100ul PBS+ 100ul matrigel )BALB/c nude mice(Male)5wHuh7 cell (8*105/flank,100ul PBS+ 100ul matrigel )BALB/c nude mice(Male)5w14day(first)RBE cell (

18、8*105/flank,100ul PBS+ 100ul matrigel )BALB/c nude mice(Male)5w14day(first)HUCCT1 cell (8*105/flank,100ul PBS+ 100ul matrigel )BALB/c nude mice(Male)5w14day(first)Huh7 cell EpCAM+(Top8%) (5*104/flank,100ul DMEM+ 100ul matrigel )Nod SCID(Male)5w20day(first), 25day (almost)Huh7 cell CD133+(Top8%) (5*1

19、04/flank,100ul DMEM+ 100ul matrigel )Nod SCID(Male)5w15day(first), 20day (almost)l 經(jīng)脾臟注射肝癌細(xì)胞Intrasplenic inoculation操作步驟：預(yù)準(zhǔn)備：麻醉劑2%戊巴比妥鈉配置(100ml 0.9%的生理鹽水中含有2g戊巴比妥鈉，用0.22um 過濾器除菌)。加熱墊、止血鉗、prolene線1.腹腔注射麻醉劑（劑量、/kg，如小鼠體重20g，注射100ul）2.將麻醉狀態(tài)的小鼠側(cè)躺（我們的左側(cè)），有毛的老鼠需剃毛。在前肢與后肢中線靠后肢1/3處，用75%酒精棉擦拭，觀察到暗色的脾臟。3.左手用彎頭

20、鑷提起皮膚，右手操作眼科剪（彎頭朝內(nèi)）剪開小鼠的皮膚，再用鑷子提起皮膚下的肌肉組織，剪開，此時觀察到鮮紅色的脾臟，用鑷子輕輕將脾臟提出，靠近下緣2mm位置，針面朝上，慢慢推入的已備好劑量的細(xì)胞，可見脾臟被膜腫脹，顏色變稍白。4.脾臟下緣和上緣各有一條血管，中間無組織粘連，此時左手用鑷子夾住這個沒有血管和組織的脾臟，輕輕提起，能明顯觀察到血管，然后用電凝筆，靠近脾臟將連接的血管和有些許胰腺功能的組織切割下來，觀察切割下來的組織血管是否出血（最好用電凝筆再止血）當(dāng)電凝筆不能止血時，立刻用止血鉗夾住出血位置，在貼近止血鉗下方用縫合線結(jié)扎止血（剪線時留，小于2mm線頭）。用鑷子輕輕將脾臟稍微往外拉出，

21、觀察到上緣的血管，同下緣脾臟血管操作。5.用鑷子提起肌肉組織，此時胰腺較容易重回腹腔。左手用鑷子夾住肌肉和皮膚，右手拿縫合針（用離持針器前2mm位置夾住縫合針）穿過一側(cè)皮膚和肌肉，在將另一側(cè)的肌肉和皮肉夾起，縫合針穿透時，打開持針器，左手的鑷子順著針的弧度將針拔出（右手的持針器可輔助穩(wěn)定老鼠）。靠左4-0#絲線繞靠右的持針器一圈，持針器夾住另一端線頭，打結(jié)。同操作打第二個結(jié)，剪線。用浸有生理鹽水的棉花，擦拭傷口周圍血漬。6.將小鼠趴臥，再用拇指和食指捏住小鼠頸部皮膚，并輕提，右手持注射器將針頭插到皮下，注射1ml生理鹽水（防止脫水）。如果注射后出現(xiàn)皮膚起包，則注射到了皮內(nèi)。（一般情況下，兩個手

22、指可以感覺到針頭的位置，可以確定針頭是否在皮下）。7.將脾臟注射后的小鼠放置在加溫墊的鼠盒上，以維持其體溫。8.注射后第二天觀察小鼠的行為活動，生命體征。（參考資料：妮婭師姐整理）Cell lineBALB/c nude micePost-Intrasplenic inoculation(#tumor/# total mice)Huh7-ctrl, miR192KO cell (106)Male-4w8w (6/12 outside of liver, 2/12 intra-hepatic)l 肝臟原位注射肝癌細(xì)胞Intrahepatic transplantation 操作步驟（1）用50%

23、基質(zhì)膠重懸細(xì)胞，小鼠（選用Nude mice）106個/20-30ul PBS體系（2）麻醉小鼠：戊巴比妥鈉，麻醉后綁定（可用醫(yī)用膠布）（3）剃毛后沿腹中線切開皮膚，長度3cm左右，露出劍狀軟骨，將切口撐開（4）先用棉簽使用生理鹽水浸潤，然后將肝左葉（最大的一葉）用棉簽挑起（5）緩慢注射20ul細(xì)胞懸液，注射后停留5s，旋轉(zhuǎn)退出針頭，避免細(xì)胞回流。注射成功后在肝臟部位一般能看見白色突起（6）注射完畢后消毒腹腔，然后縫合傷口（參考資料：Nat Protoc. 2015 Aug;10(8):1264-74.）參考劑量：Cell lineC57BLPost-Intrasplenic inoculat

24、ion(#tumor/# total mice)Huh7-ctrl, miR192KO cell (106cell/30ul PBS)Male-4w1month 無肉眼可見結(jié)節(jié)高壓尾靜脈HTVIl Sleeping beauty system注意點(diǎn)(1) Plasmid of SB: plasmid of gene X=1:10 1:25(2) Time for injection: 5-9 seconds(3) Buffer: salin (10% mice body weight)(4) 選用小鼠最好一批出生，要設(shè)置的對照和實(shí)驗(yàn)組同一天注射操作步驟預(yù)準(zhǔn)備：所用溶劑可為生理鹽水或Ringer

25、s buffer（1L溶液中含0.42g KCl, 9.00g NaCl, 0.24g CaCl2,0.2g NaHCO3）1. 將小鼠固定，用呼吸麻醉儀持續(xù)讓小鼠吸入異氟烷2. 用熱水浸濕紙巾捂熱小鼠尾巴，使靜脈擴(kuò)張，緊靠白色尾骨兩側(cè)有清晰可見的2根紅色靜脈3. 用左手的食指、中指、無名指及大拇指將小鼠尾巴固定。手法：握住1ml注射器前面0.1mL處，右手小指搭在拽著鼠尾的左手拇指處，按此手形進(jìn)針4. 注射時左手扯尾，使尾巴緊貼桌面，一般選擇距尾尖1/4或1/3處進(jìn)針，此處皮膚較薄，血管清晰，進(jìn)針容易。將欲注射的鼠尾用左手緊緊壓在桌面上，右手進(jìn)針時針頭與桌面平行，針尖稍稍朝下，一旦進(jìn)入，將針

26、頭稍稍上挑進(jìn)入，針頭沿血管進(jìn)入，肉眼可觀察到針頭前進(jìn)。如果針頭在血管中前進(jìn)，可明顯地感覺到針行通暢，毫無阻力。若針頭不在血管中，手感針行有阻力。進(jìn)針時不要太深，針頭入皮膚后馬上把針頭略往上，平行進(jìn)針，針扎入時有落空感，推液時無阻力則說明成功了。如果推液阻力較大，甚至注射處出現(xiàn)滲液，則說明不在靜脈內(nèi)，需要重新調(diào)整注射。5. 注射結(jié)束后，用醫(yī)用棉花止血。可能會出現(xiàn)小鼠心跳驟停，采用擠按心臟部位復(fù)蘇，密切觀察。注射成功特點(diǎn)：注射到靜脈的推液幾乎沒有阻力，可快速將液體推完。如果注射到靜脈以外，強(qiáng)行推液，阻力較大，注射處周圍會出現(xiàn)露水樣滲液，而且出針后，出血較少。并且由于藥液瘀阻在尾部，導(dǎo)致血流不暢，尾

27、部缺血，易導(dǎo)致尾部炎癥和壞死。參考劑量Gene XC57BL mouseAgesplasmidPost-injection(#tumor/# total mice)c-mycMale-4w20ug c-Myc/pT3EF1a + 2ug SB in 1.5mL8w (1/6), 12w (1/8)cmyc+MCLIMale-7w2ugMyc/pT3EF1a+2ugMCLI/pT3EF1a+0.3ug SB8w (no nodule)NRasV12+myr-AKTMale-4w5ug Ras/pT3EF1a +5ug Akt/pT3EF1a +0.67ug SB in 1.5mL5w (5/5)

28、NRasV12+myr-AKTMale-6w1.5ug Ras/pT3EF1a +1.5ug Akt/pT3EF1a +0.2ug SB in 2mL8w (small nodule)Gene XFVB/N mouseAgesplasmidPost-injection(#tumor/# total mice)c-mycMale-4w20ug c-Myc/pT3EF1a + 2ug SB in 1.5mL8w (1/6), 12w (1/8)NRasV12+myr-AKTMale-4w5ug Ras/pT3EF1a +5ug Akt/pT3EF1a +0.67ug SB in 1.5mL5w (

29、5/5)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部交流問題和解答1. 當(dāng) DNA 分子上存在兩個方向相反的 loxP 序列時，Cre 可導(dǎo)致 loxP 之間的序列發(fā)生反轉(zhuǎn)，那么序列反轉(zhuǎn)的后果是什么呢？如果是讓這段序列失去功能的話，也相當(dāng)于敲除嗎？解答：序列反轉(zhuǎn)指的是目標(biāo)序列的倒位，的確失去功能，但應(yīng)該不算敲除，因?yàn)槟且欢尾恢罆l(fā)生什么作用。2. 兩個loxp之間基因的大小如果會影響敲除效率，那么基因大小的可能極限是？解答：現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)兩個因素會影響Cre-lox重組的效率。第一個因素是lox序列中不對稱區(qū)段的堿基序列。第二個影響因素是一對lox序列之間floxed序列的長度，Cre-lox重組的效率隨著其長度的增大而降低，或許

30、是因?yàn)榉磻?yīng)動力學(xué)的影響。根據(jù)這篇文獻(xiàn)，（PLoS One. 2009; 4(1): e4200）建議最長為13kb。且Cre重組酶在不同物種或者同一物種的不同類型細(xì)胞或組織中介導(dǎo)lox位點(diǎn)發(fā)生重組的效率差異較大, 目前對導(dǎo)致這種現(xiàn)象產(chǎn)生的內(nèi)在機(jī)理不清楚, 有文獻(xiàn)推測這可能是由于Cre重組酶對處于不同類型細(xì)胞和不同發(fā)育時期的染色質(zhì)中l(wèi)ox位點(diǎn)的識別能力不同所致。（參考資料：維基百科）3. Cre鼠不能鑒定純合雜合的原因？解答：判斷小鼠是否為cre,用PCR判斷只能說有這個酶，有可能是cre+/+,cre+/-,然后用同為cre陽性的2個鼠去雜交，如果后代一直穩(wěn)定為cre，則上述2只大概率為cre

31、+/+。4. Cre酶可以發(fā)揮效應(yīng)去切割loxp的是嗎？然后切割完loxp兩側(cè)的序列還是連接上的嗎？解答：Cre 酶作用后，切除部分為兩個同向Loxp位點(diǎn)中間的部分和其中一個Loxp位點(diǎn)，在DNA酶的作用下發(fā)生環(huán)化，剩下部分相連。5. 當(dāng)兩個loxp位點(diǎn)方向相同的時候Cre可將兩個loxP 序列之間的DNA 片段切出并環(huán)化，那環(huán)化的這個片段會對小鼠有影響嗎？解答：留下那段環(huán)化的loxp序列，因?yàn)轶w內(nèi)有DNA酶，不受保護(hù)，會被降解掉，對體內(nèi)不會有太大影響。6. 如果需要檢cre的敲除效果，一般取的是什么組織呢？能和基因型鑒定一樣用鼠尾嗎？解答：檢測Cre的敲檢效率需使用條件性敲除的臟器組織（如我

32、們實(shí)驗(yàn)室使用的是肝臟）。一般在最初建立品系時會檢測一次，從蛋白和RNA的水平（如果是miRNA只能是RNA水平），確定確實(shí)已經(jīng)敲除。在完成實(shí)驗(yàn)小鼠死亡后，再次取肝臟組織鑒定敲除效率。如果是全身性敲除的話，鼠尾鑒定是可以從基因組上看出來的，那一段是缺失的。7. 親本可用Cre，loxp純陽性替代嗎？解答：cre是雜合或純和都會顯示cre陽性，而loxp最早公司提供給你的就是loxp+/-,等后續(xù)拿到純和，需要大批量實(shí)驗(yàn)組的時候，可以采取均純陽性。但推薦有雜合的繼續(xù)進(jìn)行繁殖。8. 鼠尾基因型鑒定一般進(jìn)行幾次？解答：鼠尾基因型鑒定一般在小鼠分籠時和小鼠死亡后各做一次。9. 實(shí)驗(yàn)室所用NASH的模型解

33、答：DEN+HFCD，12天DEN 20mg/kg, HFCD三周開始喂食，27周有小結(jié)節(jié)形成。10. 如果是質(zhì)粒或siRNA處理細(xì)胞去做皮下成瘤，一般細(xì)胞處理多久呢？會取一部分再做個鑒定嗎，比如有沒有過表達(dá)或者敲減？解答：留一部分細(xì)胞做檢驗(yàn)，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24小時，保證最大效率。siRNA取決于平時做實(shí)驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)，若24h有效果即可收細(xì)胞皮下注射。病毒加足夠量確保過表達(dá)或敲減，可以再細(xì)胞傳代的。11. 選擇皮下成瘤的細(xì)胞系？解答：常見有HepG2SMMC-7721Huh7Hep3BHCCLM3。不推薦HepG2，需要劑量太大且細(xì)胞堆疊生長。12. 皮下注射、肝臟原位注射、脾臟注射產(chǎn)生的腫瘤有什么區(qū)別？該怎樣判斷應(yīng)該選擇哪一種注射方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)？解答：皮下成瘤的優(yōu)點(diǎn)：成瘤率高，周期短，腫瘤的大小和位置較易控制，個體差異小，另外，對宿主的影響類似，易于客觀判斷療效。缺點(diǎn)：缺乏腫瘤微環(huán)境的影響，該模型不能很準(zhǔn)確模擬腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)生長。原位移植（經(jīng)脾臟或肝臟原位注射）的優(yōu)點(diǎn)：原位生長能更好的模擬腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)生長的微環(huán)境，藥物療效預(yù)測更加精準(zhǔn)。缺點(diǎn)：外科移植手術(shù)程序