1、第二篇 細胞的遺傳物質第三章 基因表達的分析技術生物性狀的表現均是通過基因表達調控實現的。 對基因結構與基因表達調控 進行研究， 是揭示生命本質的必經之路。 在基因組研究的過程中， 逐步建立起一 系列行之有效的技術。針對不同的研究內容，可建立不同的研究路線。第一節 PCR 技術聚合酶鏈反響polymerase chain reaction, PCR技術是一種體外核酸擴增 技術，具有特異、敏感、產率高、快速、簡便等突出優點。PCR 技術日斟完善,成為分子生物學和分子遺傳學研究的最重要的技術。應用PCR 技術可以使特定的基因或 DNA 片段在很短的時間內體外擴增數十萬至百萬倍。擴增的片段 可以直接

2、通過電泳觀察,并作進一步的分析。一、實驗原理PCR是根據DNA變性復性的原理，通過特異性引物，完成特異片段擴增。第一，按照欲檢測的DNA的5,和3,端的堿基順序各合成一段長約 1824個 堿基的寡核苷酸序列作為引物primer。引物設計需要根據以下原那么：引物 的長度保持在 1824bp 之間，引物過短將影響產物的特異性，而引物過長將影 響產物的合成效率；GC含量應保持在4560%之間；5,和3,端的引物間 不能形成互補。第二，將待檢測的 DNA 變性后，參加四種單核苷酸 dNTP、 引物和耐熱DNA聚合酶以及緩沖液。通過95C變性，在進入較低的溫度使引物 與待擴增的 DNA 鏈復性結合，然后

3、在聚合酶的作用下，體系中的脫氧核苷酸與 模板 DNA 鏈互補配對，不斷延伸合成新互補鏈，最終使一條 DNA 雙鏈合成為 兩條雙鏈。通過變性9295C復性4060C引物延伸6572C 的順序循環 20 至 40個周期，就可以得到大量的 DNA 片段。理論上循環 20周 期可使 DNA 擴增 100余萬倍。二、PCR技術的分類及其應用范圍1. 逆轉錄PCR 逆轉錄PCR (RT-PCR)是將RNA反轉錄和PCR結合而 建立起來的一種PCR技術。其包括兩個過程：通過逆轉錄合成 cDNA和對之進 行 PCR 擴增。其中，用于逆轉錄的 RNA 模板要求完整，并且不含 DNA 和蛋白 質等雜質。逆轉錄PC

4、R可以檢測低于10個拷貝的特異RNA。2. 原位PCR 原位PCR技術(in situ PCR)是將檢測細胞內特定基因的原 位雜交技術和聚合酶鏈式反響(PCR)法相結合的方法。它是擴增組織切片或細胞 內微量的基因，并將其檢測出來的技術。3. 甲基化 PCR 甲基化 PCR 與常規 PCR 在原理上一致，但在引物的設計 以及 DNA 樣本的處理上有所不同。針對擴增的 DNA 甲基化區域，一般需要設 計三條引物：正常序列引物、甲基化對應引物以及 DNA 序列修飾引物。通過三 組PCR,判斷DNA序列中甲基化的存在與否。4. 實時熒光定量 PCR 實時熒光定量 PCR (real time quan

5、titative PCR) 是在PCR反響體系中參加熒光基團，利用熒光信號累積實現實時監測整個 PCR進 程，并能對起始模板進行定量分析。RT-PCR需要熒光探針參與，常用的探針可 分為以下幾類：1)內摻式染料SYBR Green I ； 2)序列特異性探針：Taqman, Molecular Beacons， Dual Probes； 3)特異性引物： Amplifluor(Intergen)， Lux 引物， Scorpion；4)陰陽探針。熒光定量 PCR 不僅可以測定靶 DNA 的含量，用于臨床診斷， 而且可以應用不同 的探針檢測基因突變和SNP分析。5. 多重引物PCR多重引物PCR

6、是在同一擴增體系參加多對引物，同時擴 增多個基因片段的 PCR 技術。其技術的優點是通過一次擴增可診斷幾種疾病或 同一疾病的幾個不同的基因突變。6. 隨機 引物 PCR 多態 DNA 的隨機擴 增 ( random amplication of polymorphic DNA， RAPD)或隨機引物 PCR (arbitrarily primed PCR，AP PCR) 是應用基因組DNA中單一、隨機序列的短引物，通過PCR擴增產生一組代表種 或株特性的 DNA 片段。因此， RAPD 是獲得種或株的 DNA 分子指紋圖譜的通 用方法。7. 套式PCR 又稱巢式PCR，是對靶DNA片段設計兩套

7、引物系統，第1 套引物擴增1530個循環，再用擴增的DNA片段內設定的第2套引物擴增15 30 個循環，可使目的 DNA 序列得到高效擴增。套式引物 PCR 可減少引物的非 特異性擴增，增加特異性擴增，減少PCR的誤診率。8突變體構建 PCR1應用載體構建突變體的PCR：原理是將野生型目的基因的cDNA插入 到克隆載體上， 設計攜帶突變點的一對引物， 對克隆載體進行擴增， 然后將經過 PCR而獲得的DNA轉染感受態細胞，并用篩選培養基篩選轉染的細胞，獲得的 克隆可以通過細胞擴增，獲得大量的攜帶突變體 DNA 的載體。2應用內外引物構建突變體的PCR：載體構建突變體PCR是構建點突變 的高效方法

8、，但不適用于缺失、易位、倒位等突變方式。內外引物構建突變體 PCR 可以克服載體構建突變體 PCR 的缺乏。其原理是合成兩對引物，即一對擴 增整個 cDNA 的外引物和一對包含突變序列并局部互補的內引物。分別以一個 外引物與一個內引物進行 PCR，可以獲得兩條DNA序列，該兩條DNA在突變 位點存在局部重合。去除引物，將兩條 DNA 變性，而后進行復性，將可導致兩 條DNA重合局部互補，并在Taq酶的作用下補齊3,末端。用外引物擴增DNA， 將獲得含有突變的 cDNA。PCR引物的設計是PCR成功的關鍵，必須遵守以下原那么：確定擴增區域 及其長度；確定引物的Tm值；防止引物自身二聚體、引物間二

9、聚體和發夾 結構等二級結構的形成；具有擴增的特異性。三、應用 PCR 技術檢測性別決定基因一實驗原理SRY基因又稱睪丸決定基因Testis determining factor，位于人類 Y染色體， 在X染色體上沒有相應的同源節段。根據 SRY基因序列合成一對特異性引物， 通過 PCR 反響檢查患者有無此基因相應擴增片段，以及患者的表型可對患者的 真正性別和病因作出判斷， 另外對胎兒性別的產前診斷有利于防止性連鎖遺傳病 患兒的出生。二實驗準備1. 材料 人體靜脈血、注射器、微量加樣器及吸頭、 1.5ml 及 0.5ml Eppendorf 管。弓I物序列：SRY1: 5'-GATCAG

10、CAAGCAGCTGGGATACCAGTG- 3' SRY2:5-CTGTAGCGGTCCCGTTGCTGCGGTG- 3')2. 試劑實驗中有關試劑和器材要進行高壓滅菌處理生理鹽水、細胞裂解液50mmol Tris-HCl , pH 8.0; Immol Na? EDTA , pH 8.0; 0.5% SDS; 0.1mmol NaCI、10mg/ml 蛋白酶 K、20%SDS、水飽和酚1mol/L Tris-HCl抽提、酚：氯仿：異戊醇25 : 24 ： 1、氯仿：異戊醇24 ： 1、8mol/L 醋酸鉀、無水乙醇、70%乙醇、TEpH8.0 10 mmol/L Tris-

11、HCl ,pH8.0;0.1 mmol/L Na2EDTA, pH8.0、10duffer 500mmol/L KCl、100mmol/L Tris HCl, pH8.3, 室溫 15mmol/L MgCl2； 0.1% 明膠、4XdNTP 1 mmol/LdATP , 1 mmol/L dCTP , 1 mmol/L dGTP, 1 mmol/L dTTP、Taq 酶1U/ 卩1、引物溶液10pmol/ 015XTBE 緩沖液1000ml 54g Tris 堿，27.5g 硼酸，20ml 0.5mol/L EDTA , pH8.0、DNA 分子量標記、2%瓊脂糖凝膠、載樣緩沖液100ml 0

12、.2%溴酚藍，50%蔗糖， 10mol/L NaOH仏2滴、10mg/ml溴化乙錠溶液戴手套謹慎稱取溴化乙錠約 200mg,放入棕色瓶中，加重蒸水20ml,溶解后置4C冰箱保存備用。使用時100ml 瓊脂糖凝膠中加5卩l 10mg/ml溴化乙錠溶液，終濃度為0.5卩g/n。3. 實驗儀器 PCR擴增儀、超凈工作臺、高速臺式離心機、電泳儀及電泳 槽、紫外檢測儀。三實驗步驟1. DNA模板制備方法I:取毛發12根，盡量剪碎，于15 20ml生理鹽水中100C水浴10min, 離心取上清備用。方法U:外周血提取DNA1白細胞的別離 抗凝血用12倍的生理鹽水或磷酸緩沖的生理鹽水PBS稀釋并混合。 在5

13、0ml離心管中參加1倍體積淋巴細胞別離液上海試劑二廠，在上面 仔細鋪一層2倍體積已稀釋的血液。 室溫以2000rpm離心15min20min，紅細胞應沉于管底，而白色的淋巴 細胞應分布于上層血漿與下層淋巴細胞別離液的界面。 吸棄血漿，小心吸取淋巴細胞層，直至把淋巴細胞轉移完全。 用生理鹽水或PBS洗淋巴細胞二次。 最后得到的淋巴細胞沉淀，可立即用于 DNA的提取，或凍存于超低溫冰 箱中，直至使用。(2)DNA 的提取(見本篇第一章) 。2. PCR 反響體系配制及擴增(1) PCR反響總體積50卩,1取一潔凈的0.5ml Eppendof管，依次參加：10 x buffer5卩dNTP5卩引物

14、 12.5卩引物 22.5卩模板 DNA10Taq DNA2Ud3H2O補足 50(2)將反響管放入PCR擴增儀上進行聚合酶鏈反響，條件為94C變性10min 后，94r 45s、55r 45s、72C 90s共30個循環；最末一個循環緊接 72C再延伸 10min。3. 擴增產物電泳檢測取PCR擴增產物10卩與2卩上樣緩沖液混合后，與DNA Marker同時進行 瓊脂糖凝膠電泳。電泳結束，取出凝膠置于紫外檢測儀上觀察。(四) 考前須知1. 實驗過程應設陰性及陽性模板對照。2. PCR常見問題及解決方法(1) 沒有得到預期的PCR擴增產物：確證聚合酶的活性是否正常； DNA解鏈是否充分，變性溫

15、度是否準確；引物組成是否正確，有無二級結構 組成；反響系統有無蛋白酶或核酸酶存在，使聚合酶或模板及產物降解。(2) 有非特異性擴增產物出現：增加復性溫度，縮短復性時間及延伸時 間；降低引物和Taq DNA聚合酶的用量；調整 皿§2+濃度；減少熱循環次 數。(3) 形成了引物二聚體：檢查引物的序列，特別是3端是否有互補區；增加引物的長度； 調整引物與模板濃度， 使模板比例增高， 降低引物使用濃 度；增加復性溫度；減少熱循環次數。(4) PCR產物在凝膠電泳中成片狀：減少Taq DNA聚合酶的用量；增 加復性溫度，減少復性時間及延伸時間；降低Mg2+濃度；減少循環次數；從凝膠中回收與預期

16、分子量相同的 DNA，再次進行PCR反響。3. 實驗平安溴化乙錠是強誘變劑， 并有中度毒性， 取用含有這一染料的溶液時務必戴上 手套，這些溶液經使用后，應進行凈化處理。第二節 單鏈構象多態性(SSCP)分析單鏈構象多態性(single strand conformation polymorphism, SSCP)分析是 利用DNA或RNA單鏈構象具有多態性的特點，結合 PCR進行基因檢測的一種 分析技術，稱為PCR-SSCP技術。其根本原理為：DNA或cDNA在變性后，由 于序列的不同而導致單鏈 DNA 的空間結構各異。在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 的過程中，不同空間結構的單鏈 DNA遷移率存在

17、差異。因此，PCR-SSCP可以 用來鑒定單核苷酸的差異。該技術已被廣泛用于癌基因和抗癌基因變異的檢測、 遺傳病的致病基因分析以及基因診斷、基因制圖等領域。PCR-SSCP的敏感性隨核苷酸片段長度的增加而降低，在檢測200個核苷酸 片段中單個堿基的突變時， 檢出率高達 90%；而400個核苷酸片段單個堿基突變 的檢出率為 80%。因而，在實驗中要將大片段分成較短的片段。 哺乳動物基因組 中的外顯子一般小于 300 個堿基，可以使用內含子引物直接對目的片段進行 PCR-SSCP。一、PCR-SSCP技術的根本程序PCR-SSCP技術的根本程序為：首先 PCR擴增特定靶序列，然后將擴增產 物變性為

18、單鏈， 進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。 在不含變性劑的中性聚丙烯酰 胺凝膠中電泳時， DNA 單鏈的遷移率除與 DNA 鏈的長短有關外， 更主要的是取 決于 DNA 單鏈所形成的構象。 在非變性條件下， DNA 單鏈可自身折疊形成具有 一定空間結構的構象。這種構象由 DNA 單鏈堿基決定，其穩定性靠分子內局部 順序的相互作用主要為氫鍵來維持。相同長度的 DNA 單鏈其順序不同，甚 至單個堿基不同，所形成的構象不同，電泳遷移率也不同。 PCR 產物變性后， 單鏈產物經中性聚丙烯酰胺凝膠電泳，靶 DNA 中含單堿基置換，或數個堿基插 入或缺失等改變時，因遷移率變化會出現泳動變位，從而可將變異 DN

19、A 與正常 DNA區分開。由此可見，PCR-SSCP分析技術是一種DNA單鏈凝膠電泳技術， 它根據形成不同構象的等長 DNA 單鏈在中性聚丙烯酰胺凝膠中的電泳遷移率變 化來檢測基因變異。二、實驗準備一試劑甲酰胺加樣緩沖液 95%甲酰胺， 20mmoL/L EDTA， 0.05%溴酚藍和 0.05% 二甲苯青、6%丙烯酰胺丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺=49： 1 、10%甘油、0.5 XBE、10%醋酸、2%硝酸銀、顯影液3%無水碳酸鈉，0.2%甲醛，0.02%硫 代硫酸鈉、去離子水二實驗儀器PCR 擴增儀、超凈工作臺、高速臺式離心機、電泳儀及電泳槽、紫外檢測儀。三、實驗步驟1 目的片段的 PCR

20、及其產物的變性 根據擴增的目的片段制定 PCR 擴增 條件。PCR擴增結束后，用5倍體積的甲酰胺加樣緩沖液混合。將樣品于 95C 變性 5min 并直接置于冰浴上。2 電泳 電泳膠有兩種：聚丙烯酰胺凝膠由6%丙烯酰胺、10%甘油和0.5 XBE組成。上樣5卩，在室溫下0.5W/cm,用0.5 XBE電極緩沖液電泳2.5h 以上；聚丙烯酰胺凝膠由6%丙烯酰胺和0.5 >TBE組成。上樣5卩,1在4C下 0.5 W/cm,用0.5 XBE電極緩沖液電泳2.5h以上。3染色 取下凝膠，置10%醋酸固定液中30min，再以去離子水漂洗3次 2min/次，參加2%硝酸銀染液染色20min后，去離子

21、水洗膠20s，凝膠置顯 影液中顯色510min，以10%醋酸終止反響，漂洗及分析結果。4. 結果判讀 SSCP結果判讀的標準是正常個體由于等位基因相同，僅存在兩條單鏈， 因此在凝膠上多出現兩條帶， 有時由于兩條鏈接近可形成一條帶， 或 一條單鏈有兩種空間結構可形成三條帶； 突變個體由于等位基因不同，可以形成 四種不同的單鏈，因此在凝膠上多出現四條帶，有時也可形成五條帶。如果存在 復雜突變，可以形成超過5條的帶紋圖2-3-1。圖2-3-1 SSCP結果圖1為未變性的 PCR產物;2、4、6、8、9為正常個體；3、5、7'為突變攜帶者四、考前須知1. 核酸片段的大小是決定檢測敏感性的首要因

22、素：用于SSCP分析的核酸片段越小，檢測的敏感性越高。對于大于 400bp的PCR產物可采用以下兩種策 略進一步處理：用限制性內切酶對 PCR產物進行消化，產生較小片段；通 過改變引物的位置和增加PCR擴增次數，縮短PCR產物。2. 聚丙烯酰胺凝膠孔徑的大小是影響檢測敏感性的另一個重要的因素：一般情況下，丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺的比例為 49： 1。可以選用10%甘油在室 溫或無甘油在4C條件下進行電泳。3. 游離引物：游離引物可能同PCR產物結合而改變其泳動率，即使游離引物量為6nM都有明顯影響。因此，應盡可能除去游離引物?？梢圆捎貌粚ΨQ引 物擴增方法，盡可能消耗多余的引物。也可以運用過柱或

23、磁性球方法純化PCR產物?；蛘呤窍♂孭CR產物，減少游離引物的干擾。4低濃度變性劑：凝膠中參加低濃度的變性劑，女口5%10%甘油、5%尿素或甲酸胺、10%二甲亞砜DMSO或蔗糖等有助于提高敏感性，可能是因為 輕微改變單鏈DNA的構象，增加分子的外表積，降低單鏈 DNA的泳動率。但 有些變異序列卻只能在沒有甘油的凝膠中被檢出。因此，對同一序列使用23種條件做SSCP,可能提高敏感性。5. 電泳溫度：一般認為保持凝膠內溫度恒定是 SSCP分析最關鍵的因素，溫 度有可能直接影響DNA分子內部穩定力的形成及其所決定的單鏈構象，從而影 響突變的檢出。室溫下電泳適于大多數情況，但由于在電泳時溫度會升高，為

24、確 保電泳溫度相對恒定，應采取以下措施：減少凝膠厚度，降低電壓，有效的空氣 冷卻或循環水冷卻等。6. 凝膠的長度：可用測序板進行SSCP分析，凝膠板長度在40cm以上。7. 凝膠濃度及厚度： 凝膠濃度很重要，一般使用5%8%的凝膠，凝膠濃 度不同，突變帶的相對位置也不相同，如果在進行未知突變種類的SSCP分析時， 最好采用兩種以上凝膠濃度，這樣可以提高突變種類的檢出率。凝膠的厚度對 SSCP分析也很重要，凝膠越厚，背景越深，在上樣量較多的前提下，盡量使凝 膠越薄越好。8假陰性：一般認為，如沒有污染，PCR-SSCP分析不存在假陽性結果， 但可能出現假陰性結果， 后者是由于點突變引起的空間構象變

25、化甚微， 遷移率相 差無幾所致，尤其是點突變發生在擴增片段的兩端時。如果有陽性和陰性對照， 結果可以重復確定的突變帶是可信的， 如果沒有陽性對照， 應經測序來確定其是 否為突變帶。由于PCR- SSCP的缺乏之處主要是可能檢出假陰性結果。應通過 設置陽性對照， 摸索電泳條件， 假陰性結果在很大程度上是可以防止的。 但對未 知基因變異的檢測，假陰性結果就難以百分之百地消除。9. 結果分析：單鏈凝膠電泳時，互補單鏈遷移率不同，一般形成兩條單鏈 帶。 PCR 產物進行單鏈凝膠電泳之前，通過加熱變性產生單鏈。如變性不徹底， 殘留雙鏈亦可形成一條帶.因此，PCR- SSCP分析結果至少顯示三條帶。但是，

26、 由于一種 DNA 單鏈有時可形成兩種或多種構象，檢出三條或四條單鏈帶就缺乏 為奇。第三節 基因表達譜研究技術人類基因組大約有 30000個左右的結構基因， 其中在任一細胞中表達的基因 僅占總數的 15%。管家基因在任何生長發育階段以及生理狀態下均有所表達，而奢侈基因的表達那么有組織特異性、 時空特異性以及調節特異性。 兩者同時決定了 包括發育與分化、內環境穩定(homeostans)對逆境的反響、細胞周期調控、衰 老乃至程序化死亡等整個生命過程。 基因表達的變化是調控生命活動過程的核心 機制。通過比擬同一類或不同種類細胞在不同生理條件下或在不同生長發育階段的基因表達差異，可為分析生命活動過程

27、提供重要信息。因此，基因的表達譜研究是揭示細胞生長、細胞分化、組織器官建立以及細胞衰老死亡的重要方向。研究基因表達譜的方法主要有基因表達系列分析、基因芯片技術、差異顯示 PCR法以及消減雜交技術等表2-3-1。表2-3-1不同基因表達譜研究技術的比擬方法技術與原理優點缺點基因表達系列克隆、DNA測序不需特殊設備、實驗本錢克隆步驟較多、基因片段有可能喪失、提供分析較低、測序效率較高、可信息有限。獲得新基因。基因芯片分子雜交操作簡便、不需測序。實驗費用高、需要特殊設備；存在假陽性和假陰性；圖象和數據分析工作量較大。差異顯示PCR電泳、分子雜交、不需特殊設備、可展示所方法繁瑣、假陽性高、片段短而靠近

28、PCR 技術、DNA有基因、差異表達基因片mRNA3 / 末端。測序段、可獲得新基因。代表性差異分克隆、PCR技術、mRNA需求少、特異性高酶切連接步驟多、cDNA存在喪失現象、獲析技術分子雜交得的片段是酶切片段。抑制消減雜交PCR、克隆、測序特異性高低豐度cDNA存在喪失、不能合成全長技術cDNA?；赑CR的消分子雜交、PCR、設備要求不高、操作簡研究經費高、不能同時展示所有的基因和差減雜交技術克隆、測序便、可獲得新基因。異基因、存在一定的假陽性、需大量測序。一、SAGE技術一概述基因表達系列分析 serial analysis of gene expressionSAGE是由 Velcu

29、lescu 等建立并用以分析基因組表達的方法，可以在未知目的基因的前提下，分析來自一個細胞的全部轉錄本信息；對或未知基因表達進行定性和定量分析；假陽性率低，可重復性強。隨著SAGE技術的日益成熟，在基因表達方面已經得到了廣泛的使用。二SAGE的原理mRNA的3,末端特定部位存在可以標識其特異性的標簽tag,其長度一 般在1014個核苷酸之間，檢測tag可以獲得該mRNA的表達信息。SAGE技 術主要是基于以上原理，通過獲得tag從而確定基因的表達情況。其次，別離獲 得的tag可以通過串聯連接克隆于載體上，以便測序，提高了分析效率。同時，根據同一 tag重復次數，可以判斷轉錄本的表達水平SAGE

30、技術包括以下幾個步驟：提取 RNA，并將其與攜帶生物素標記的 oligodT混合，以mRNA為模板，經逆轉錄得到雙鏈cDNA ；錨定酶 anchoringenzyme AE酶切生物素標記的雙鏈 cDNA。錨定酶要求至少在每一 種轉錄本上有一個酶切位點，一般 4堿基限制性內切酶能到達這種要求。Nia川 是一種廣泛的限制性內切酶，平均每 250bp就存在一個Nia川識別位點CATG， 因此是理想的 SAGE錨定酶；應用帶有親和素的磁珠別離生物素標記的 CDNA3端酶解片段，獲得mRNA polyA尾部與最近的酶切位點之間的片段； 將別離得到的cDNA酶切片段等分為A和B兩局部，分別與設計好的兩種連

31、接 子A或B連接。連接后的DNA片段在3,端包含有U S型內切酶如BsmF I 的識別位點；用U S型內切酶又稱標簽酶消化以上步驟獲得的連接產物， 并去除與磁珠相連的DNA片段。U S型內切酶的作用方式以標簽酶 BsmF I為 例，BsmF I 的識別和切割位點為 5-GGGAC N 103' /3CCCTG N 14J-5； 因此產生連有接頭的短cDNA片段，長為10堿基，即釋放的cDNA標簽，不同 的標簽酶獲得的堿基數不同，如 Fok I可以獲得9堿基的標簽；利用 Klenow 片段或T4 DNA聚合酶消化產生的粘性末端，混合兩個 cDNA池的短cDNA片 段，并連接成100bp的

32、雙標簽ditag以引物A和B通過PCR擴增雙標簽， 擴增產物含有2個尾尾相接的標簽一個Ditag，其側翼有錨定酶切割位點； 利用錨定酶酶切擴增產物，別離純化以收集標簽Ditag； 將每3050個雙標 簽連接起來，并克隆到pZErO-1載體中，建立SAGE文庫；對插入到pZErO-1 載體中的雙標簽序列進行測序，并利用相應的應用軟件進行結果分析， 確定原始 序列中每個標簽序列、數目以及發生率。同時可以與NCBI的SAGEmap、GenBank 以及EST公眾數據庫進行比對，找出標簽與基因及 EST之間的對應關系，對標 簽進行定性圖2-3-2、2-3-。圖2-3-2 通過SAGE獲得的DNA片段圖

33、2-3-3 SAGE的測序圖三SAGE 技術的應用1. 全基因組轉錄圖譜的建立早在1995年，Velculescu等選擇BsmFI和Nia川分別作為標簽酶和錨定酶對胰腺組織中1000多個標簽進行手工測序，發現95%以上的標簽能夠代表唯一的轉錄物。2001年，Caron等將公眾SAGE數 據庫的 231 萬標簽以及他們自己從神經母細胞瘤別離到的 16萬個標簽按照組織 來源分成 12組，并經過計算， 將這 12組不同組織的標簽與已做染色體定位的基 因進行比對， 獲得了可以反映基因表達豐度的全基因組轉錄圖譜， 并發現染色體 上存在高表達的基因簇區域regio n of in creased ge n

34、e expression RIDGE。結果 提示，基因組結構是高度有序的，一個典型的RIDGE在1CRcentiary的染色體長度上通常含有630個基因，而低轉錄區域僅含有12個基因，例如在18 號染色體上，目前發現有 385個表達豐度較低的基因，而在大小相近的 19號染 色體上分布著一連串RIDGE，包含了 937個基因。2. 在基因差異表達中的研究在生物的基因組中存在兩大類基因：管家基因和奢侈基因。 管家基因在不同組織來源的細胞中廣泛表達， 而奢侈基因的表達 具有組織特異性。研究組織特異性基因的表達是揭示細胞分化的根底。SAGE技術為基因差異表達的研究提供了有效的手段， 在發育生物學以及腫

35、瘤生物學中得 到了廣泛的應用。通過 SAGE 技術對病理狀態和正常生理狀態的組織進行基因表達譜比擬研 究，可以發現疾病相關的標記基因。此外， SAGE 技術也可應用于化學物質處理 細胞前后基因表達變化的研究。例如有學者研究了神經生長因子NGF、雌激素、細菌脂多糖LPS等對相映的細胞神經元、乳腺癌細胞以及單核細胞處理 前后基因表達差異，發現了與之相關的下游基因。3. 模式生物的研究 SAGE 技術已經廣泛地應用于其它模式生物的研究中。Velculescue等在酵母上別離得到60633個SAGE標簽，其中93%的標簽可與4665 個基因對應。Matsumura等從水稻秧苗中別離出10122個標簽，

36、其中23.1%可與 的 1367個 cDNA、 EST 匹配。二、差異顯示技術一概述差異顯示技術differential display RT-PCR, DDRT-PCR是 1992 年由 Liang和 Pardee 創立 而用 于研究基因表達差異的 方法 。其原理是：真核細胞 mRNA3 polyA上游的兩個堿基 MN ( M=A/C/G , N=A/C/G/T )可以形成12種組 合，以 T7T12MN 作為錨定引物與 mRNA 的 polyA 以及上游的兩個堿基結合， 在反轉錄酶作用下進行總 mRNA 的反轉錄， 將形成與引物匹配的十二類 cDNA。 在mRNA(cDNA ) 5端設計帶

37、有熒光標記的隨機引物，并結合錨定引物，對cDNA 進行擴增。由于不同的 mRNA(cDNA )其隨機引物結合部位不同，因此PCR產物的大小和序列不同。經聚丙烯酰胺凝膠電泳，別離 cDNA 擴增產物，用 GenomyxSC熒光掃描系統檢測2kb300bp的DNA片段。從聚丙烯酰胺膠中回 收特異 cDNA 片段，經再次 PCR 擴增和瓊脂糖凝膠電泳檢測， 并以 Northern blot 排除假陽性后，對目的片段進行克隆。獲得的 cDNA 可以制備為探針，從 cDNA 文庫或基因組文庫中篩選全長 cDNA 或全基因序列。差異顯示技術在基因表達研究中具有以下優勢：實驗要求的mRNA樣品量較少；DDR

38、T-PCR技術包含PCR擴增過程，因此能夠用于檢測組織或細胞 中極低豐度表達mRNA樣品的差異表達；可以將兩種或兩種以上特定組織樣 品來源的擴增產物放在同一塊凝膠上鑒定， 因此保證了測定的一致性， 因此可以 用于鑒定不同來源組織或細胞轉錄水平 mRNA 的定性和定量變化。然而，差異 顯示技術也存在以下主要缺陷：假陽性較高，引起假陽性的因素有：DNA污染、差異cDNA條帶可能包含多種產物、某些cDNA片段較小等；cDNA產物 的質量較低，在序列膠中表現為條帶不清晰；由于隨機引物與模板匹配不適， 引起擴增產物產率較低。改善DDRT-PCR合成體系是提高其應用的根底。引物的合理設計是降低差異 顯示技

39、術缺陷的重要手段。RNA的質量是決定DDRT-PCR成功的另一個決定因素，實驗要求： RNA 保持完整性；OD260與OD280的比值在2左右；RNA應無DNA污染，可 以通過應用無RNase的DNase除去提取物中殘存的DNA分子，也可通過oligo (dT)層析法別離純化具有polyA尾部的RNA分子。(二) 實驗操作的具體步驟1 實驗操作步驟(1) 總 RNA 的制備：按試劑盒提供的方法或按?分子克隆試驗指南?提 供的方法提取總 RNA，以RNase free DNase 1(終濃度80 OOOU/L)降解其中污染 的 DNA ，經甲醛變性凝膠電泳鑒定其完整性， 并以紫外分光光度儀檢測其

40、純度。(2) 逆轉錄反響：選擇錨定引物 T7(dT12)AP 對總 RNA 進行逆轉錄反 應，反響體系如下：總RNAIQtg，引物4pmol, 70 °C 5 min,置于冰上3 min，力卩 入 50mmol/L Tris-HCI(PH 8.3)，75mmol/L KCl，3mmol/L MgCI 2, 10mmol/L DTT， 25 卩 mol/L dNTPmix (1:1:1:1，SuperScript n 60U，總反響體系 20卩。42 C 5 min， 50 C 50 min， 70 C 15 min。(3) 熒光標記差異PCR:選取帶有熒光標記的錨定引物 TMR T7

41、 (dT12) AP 和任意一個隨機引物對逆轉錄產物進行 PCR 反響。反響體系包括： 20mmol/L Tris-HCl(PH 8.4)，50mmol/L KCl，3.75mmol/L MgCl 2,逆轉錄產物 3.0 卩,150 卩 mol/L dNTPmix (1:1:1:1) ,0.35 卩 mol/L 隨機引物，0.35 卩 mol/L 錨定引物，AmpliTaq 0.5 U,總反響體系 10 卩。95 C 2min; 94 C 15 s, 50 C 30 s, 72 C 90 s, 4 個循環； 94 C 15 s， 60 C 30 s， 72 C 90 s, 25個循環； 72

42、C 延伸 7min。(4) 別離差異顯示片段：配置 5.6%變性聚丙烯酰胺膠，膠厚 0.25mm,大 小61X33cm。將取PCR產物10卩與10卩上樣緩沖液混合，95C變性后上樣。 3000V、100W、55 C 電泳 4.5h。制成干膠，在 GenomyxSC 上掃描，用 AcquireSC program 軟件分析掃描結果。( 5)回收差異條帶：確定差異條帶位置，用一次性手術刀片切割下所需條 帶，置于30卩去離子水中，37C水浴3060min,備用。(6)差異條帶的再擴增：以回收條帶為模板，用T7啟動子錨定引物T7(dT12) AP和隨機引物對模 板進行再 擴增反響：模板2.0卩,1 2

43、0mmol/L Tris-HCl(pH 8.4), 50mmol/L KCl , 1.5mmol/L MgCl 2,20 卩 mol/L dNTPmix (1:1:1:1), 0.2卩mol/的引物，10U AmpliTaq，總反響體系20卩。反響條件同差異顯示 PCR。三、基因芯片技術基因芯片是生物芯片的一種， 由分子生物學、 微電子學和計算機科學等多種 學科相互交融而形成的新技術。 其為基因表達譜的研究、 新基因的發現、 基因突 變的檢測、 DNA 多態性的分析、基因組作圖等提供了有效的手段。(一)概述基因芯片(genechip又稱DNA芯片或DNA微陣列，以DNA分子雜交技術 為根底，將

44、許多的、特定的寡核苷酸或基因 cDNA 片段作為探針，有序地、 高密度 地 排列 在玻 璃 、硅 片或 尼龍 膜 等載 體上 ， 制成 DNA 微 陣列 DNAmicroarray，對待測樣品 DNA或由RNA通過RT-PCR擴增得到的cDNA 進行熒光分子標記， 并與芯片上的探針雜交， 再經過激光共聚焦熒光掃描系統掃 描，檢測探針分子雜交信號強度， 通過計算機系統對熒光信號綜合分析獲得樣品 中大量基因序列及表達的信息。 基因芯片可以獲得每個點在不同波長下的熒光強 度值及其比值ratio值，并得到直觀的顯色圖。目前常用的熒光染料是 Cy3 綠 色和Cy5紅色。以Cy3 dUDP標記正常對照組織

45、 mRNA，Cy5 dUDP標記實 驗組織mRNA，雜交后僅在實驗組織中高表達基因呈現紅色，而在正常對照組 織中高表達的基因呈現綠色； 在兩組織中表達水平相當的顯黃色， 而均不表達的 那么為無色?；蛐酒赏瑫r對兩組或兩組以上樣品中的基因表達水平進行平行檢 測，從而可對來源于不同個體 正常人與患者 、不同組織、不同細胞周期、不同 發育階段、不同分化階段、不同病變、不同刺激 包括不同誘導、不同治療手段 下細胞內的 mRNA 或逆轉錄產物 cDNA 進行大規模檢測和分析。根據微陣列上探針的種類，可將基因芯片分為寡核苷酸芯片和 cDNA 芯片。 前者是將寡核苷酸原位合成或合成后固定在芯片上，并與標記樣本 DNA 雜交， 根據雜交信號出現部位的寡核苷酸序列，推測與其互補的 DNA 序列?？捎糜诨?因發現、突變檢測、表達監控和遺傳制圖等。后者是將 cDNA 固定在芯片上， 并與一組標記探針雜交，可用于基因表達的研究。二基因芯片使用的根本流程基因芯片技術包括四個主要步驟： 芯片制備、 樣品制備、雜交反響及信號檢 測和結果分析。1待測樣本的制備 基因芯片的樣本來自于兩個方面：其一是直接從組織 細胞中別離純化DNA，并對待測樣本中的DNA進行特異擴增；其二是提純RNA， 并進行逆轉錄以及 cDNA 擴增。在 DNA 擴增的過程中需要完成樣本的標記。目 前樣品標記常采用熒光標記法， 也可