1、專業課程設計熒光量子點法降鈣素原（PCT）試劑盒的研制 學 院 專 業 指導老師 班 級 姓 名 學 號 摘要本產品運用免疫層析法的夾心免疫技術將量子點與PCT單克隆抗體結合，建立一種新型的免疫分析法進行特異性定性檢測人血清或血漿中的PCT，使靈敏度顯著提高，達到或超過某些酶聯免疫吸附法(ELISA)的水平。由于待檢測PCT與PCT抗體的反應，使得水溶性量子點的熒光強度產生變化，通過測定水溶性量子點熒光強度變化的量來實現對待檢測PCT濃度的高選擇性定量檢測。本發明中的降鈣素原(PCT)檢測試劑盒具有制備低廉、穩定性好、易于保存，利用熒光量子點標記方法檢測靈敏度高、特異性強的優點，比較容易的在臨

2、床進行推廣。1.研究背景目前臨床和科研實驗室中均用免疫學方法檢測PCT濃度，包括膠體金法、ELISA法和免疫化學發光法等。所有這些方法的前提都是制備PCT特異性抗體，且健康人血漿中含量極低，在200pg/mL以下，對抗體的親和力等參數要求很高。迄今為止這些檢測體系所用的抗體均來自國外大公司，價格昂貴。因此，制備PCT特異性單克隆抗體，為PCT的免疫檢測提供具有自主知識產權的關鍵原料，對于擴大其臨床應用，降低醫療成本，具有重要意義。目前應用化學發光免疫分析技術建立人血清中降鈣素原定量檢測方法，采用固相包被降鈣素原單克隆抗體，生物素標記另一降鈣素原單克隆抗體 ，建立人血清中降鈣素原的雙抗體夾心化學

3、發光免疫定量檢測方法。在此基礎上，熒光免疫分析技術是利用熒光物質標記抗體或者抗原分子，通過與待分析物的特異性結合后，檢測熒光信號的強度變化，實現對目標分析物的定性和定量檢測。制備熒光信號強、免疫活性好的量子點-抗體（QD-Ab）復合物是將量子點應用于熒光免疫檢測的關鍵。QD-Ab的熒光信號放大效率主要是由量子點抗體偶聯比例以及量子點本身的熒光量子效率決定，而其免疫活性則由QD表面偶聯的抗體分子的量效決定，除了抗體自身親和力對復合物的免疫活性產生影響外，抗體與量子點間的偶聯位點和抗體分子在量子點表面的空間構象也對QDAb復合物的免疫活性有重要影響。2.PCT簡介及臨床意義PCT（降鈣素原，pro

4、calcitonin）是一種無激素活性的降鈣素前肽物質，來自于定位11號染色體上的單拷貝基因，該基因由2800個堿基對組成，含6個外顯子和5個內含子，相對分子質量約為13×103。在正常代謝下，甲狀腺C細胞產生PCT并分泌激素活性的降鈣素。正常人血中PCT濃度極低，當嚴重細菌、真菌、寄生蟲感染以及膿毒癥和多臟器功能衰竭時它在血漿中的水平升高。在自身免疫、過敏和病毒感染時PCT不會升高；局部有限的細菌感染、輕微的感染和慢性炎癥也不會導致其升高。自1993年Assicot等首次報道PCT可作為細菌感染的早期標志物以來，PCT作為一個新的炎癥指標廣泛應用于細菌感染的診斷與鑒別診斷，2001

5、年國際膿毒癥會議的膿毒癥診斷標準已把PCT作為診斷指標之一。PCT水平的升高出現在嚴重休克、全身性炎癥反應綜合征（SIRS）和多器官功能紊亂綜合征（MODS），即使沒有細菌感染或細菌性病灶。但是，在這些病例中PCT水平通常低于那些有細菌性病灶的患者。從腸道釋放細胞因子或細菌移位可能誘導其升高。PCT是診斷和監測細菌炎性疾病感染的一個參數。它的測定可以作為一個急性的參數來鑒別診斷細菌性和非細菌性感染和炎癥。3.量子點技術簡介及研究進展量子點（quantum dots，QDs）是納米尺寸的半導體微粒，又稱為半導體納米晶體（nanocrystals，NCs），是一種由族或族元素組成的、穩定的、溶于水

6、的、直徑在210nm之間的納米晶粒。當半導體材料減小到納米尺寸時，它與大塊材料相比具有獨特的光學特性。目前，量子點最有前途的應用領域是在生物體系中作為熒光探針。QD的光學特性比傳統的熒光染料探針有明顯的優越性：（1） 量子點被激發后可得到波長范圍寬且光譜可調的熒光。（2） 量子點粒徑大小不同，所激發的熒光也不相同。（3） 不同大小的量子點可以用同一波長的光激發而發出不同顏色的光，這將給生物學的研究帶來很大的方便。由于量子點半峰寬較窄，這就允許使用不同光譜特征的量子點，而發光色譜不發生重疊或重疊較小，可用于多種標記物的同時檢測生物體內的幾種組分。量子點具有很多的優點，如能解決量子點與生物分子的偶

7、聯問題，就可以用量子點代替有機熒光染料，在細胞器定位、信號傳導、原位雜交、胞內分子的運動和遷移等研究中發揮巨大的作用。量子點的制備方法有很多，用于生物熒光探針的量子點通常采用膠體化學法按所用的原料不同可以分為金屬有機溶劑熱分解和巰基分子作穩定劑的水相合成兩種路線。對用于生物檢測的納米晶體的要求是可溶于水或緩沖溶液，粒徑分布均勻，量子產率高，并且穩定。因此制備發光效率高、發光顏色可調性好、對光熱穩定性好的量子點，尤其是制備對于生物檢測十分重要的受激發能在紅外區發光的量子點已成為近年來的研究熱點。量子點作為熒光探針使用時，其表面需要修飾生物分子，如抗體、多肽、糖類等。如何將生物分子有效的偶聯在量子

8、點表面并保持其生物活性，是量子點生物學應用中極為關鍵的一步。到目前為止，已經有一些類型的偶聯技術在量子點抗體偶聯中應用。量子點的制備方法通常分為物理方法和化學方法兩種。用于生物探針的量子點的合成方法主要采用膠體化學法，通過在膠體溶液中進行納米晶體的制備，一類是在高沸點的有機溶劑中利用前驅體（烷基（非）金屬）熱分解來合成，另一類是利用穩定劑（巰基小分子）在水溶液中合成。采用膠體化學法在有機溶劑中合成的量子點在用于生物標記時必須對量子點進行表面修飾，使其具有一定的水溶性和生物相容性，同時在量子點表面連接上可與生物分子連接的功能性基團，可引入極性的官能團（如氨基或羧基等），再通過交聯劑NHS（N-羥

9、基琥珀酰亞胺）或EDC（乙基-3-（二甲基氨丙基）碳二亞胺），完成量子點與生物大分子（蛋白質、核酸、酶等）的共價偶聯。目前量子點標記最為活躍的領域是在熒光免疫方面。借助于抗原抗體、生物素親和素等之間的特異性識別作用完成各種研究。QDs穩定性好，熒光雜質少，連接于生物分子后不影響其活性，特異性高。4.產品技術及待解決問題本項目參考CN104122401A中的方法將降鈣素原檢測試紙，作為一種量子點標記免疫定量檢測試紙，包括底襯以及依次搭接地粘貼于底襯上的樣品墊、過濾墊、結合墊、層析膜和吸水墊從而形成多層膜結構，各層膜結構之間部分重疊；所述結合墊上包被有量子點標記的降鈣素原特異性抗體I、以及量子點標

10、記的兔IgG；所述層析膜上有一條包被降鈣素原特異性抗體II的檢測線、以及一條包被羊抗兔IgG抗體的質控線。該試紙可方便快捷、準確定量地同時檢測降鈣素原。本發明同時參考一種降鈣素原的化學發光定量檢測試劑盒及其制備方法和檢測方法，用以巰基丙酸（MPA）作為穩定劑合成的水溶性量子點CdSe納米粒子，用N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）將量子點活化，用EDC（乙基-3-（二甲基氨丙基）碳二亞胺）完成量子點與PCT抗體的共價偶聯。CdSe量子點表面覆蓋有巰基乙酸，在水溶性縮合劑EDC的作用下與抗體的氨基反應，使抗體以共價鍵連到量子點表面。用修飾過的QDs標記單抗，而此標記不影響PCT單抗與多克隆抗體的反應，標

11、記后的PCT抗體仍然具有生物活性。EDC與羧基反應形成氨基反應活性的中間體O-酰基脲，該中間體很不穩定，在水中會很快水解釋放出羧基，以及一N-酰基脲。該副反應所產生的N-酰基脲會結合在蛋白疏水區域的羧基上，而NHS介入的反應，可以使形成的中間體在水溶液中保持穩定。整個偶聯過程簡單，條件溫和，量子點的熒光強度幾乎不受影響。偶聯過程中，會有小部分量子點和抗體發生交聯，生成大顆粒物，反應后離心即可去除。降鈣素原測定試劑盒（熒光量子點法）項目設計方案1 設計目的和依據： 目的：本發明目的在于提供一種利用熒光量子點法定量檢測降鈣素原（PCT）的試劑盒，PCT作為一種能直觀反映全身炎癥反應的活躍程度的蛋白

12、而備受關注。目前市場上運用熒光量子點法檢測降鈣素原（PCT）的產品較少，而該種方法相較于其他化學檢測方法擁有更加靈敏準確的優勢，相較于其他物理檢測方法也有著對設備加工工藝要求較低的優勢。 依據：專利：1、CN103558400A 一種降鈣素原乳膠增強免疫比濁法檢測試劑盒2、CN102384902A 基于量子點熒光檢測的酶芯片及其制備方法和應用3、CN104122401A 降鈣素原和C反應蛋白的檢測試紙及其制備方法和檢測方法4、CN103901203A 一種降鈣素原的化學發光定量檢測試劑盒及其制備方法和檢測方法5、CN102053156A 一種基于熒光量子點檢測炭疽芽孢桿菌的方法6、CN1027

13、07071A PCT/CRP聯合檢測用膠體金試紙條及其制備方法文獻：1宋健,范佳,宋大千,畢麗榮,周廣宇,張皓,魏景艷,楊柏. 量子點偶聯抗體型夾心免疫傳感法檢測心肌肌鈣蛋白IJ. 高等學校化學學報,2009,10:1940-1944.2鄭怡麟,何瑩,陳安,易維京,胡川閩. 抗人降鈣素原特異性單克隆抗體的制備鑒定及初步應用J. 第三軍醫大學學報,2013,06:523-526.3張鵬飛,宋杰,陳佳,陸慧琦,韓煥興. 量子點與抗乙肝表面抗原(HBsAg)抗體的偶聯研究J. 分析化學,2013,06:846-850.4邢仕歌,熊齊榮,鐘強,張悅,卞素敏,金涌,儲曉剛. 量子點抗體偶聯技術研究進展J

14、. 分析化學,2013,06:949-955.5馬慧蓮. 發光CdTe量子點生物偶聯產物制備、性質及應用研究D.東北大學,2005.6白亞龍. 一種基于量子點熒光微球的高靈敏度免疫層析技術初步研究D.上海師范大學,2010.7謝穎,徐靜娟,于俊生,陳洪淵. 水溶性的CdSe/ZnS納米微粒的合成及表征J. 無機化學學報,2004,06:663- 667.8邱婷,彭洪亮,何治柯. 水溶性量子點CdSe/ZnS與蛋白質非特異性相互作用研究J. 化學傳感器,2007, 02:26-30.9胡曉武,李之珍,田雪,劉輝宇. 膠體金法測定降鈣素原試劑盒的研究J. 中華全科醫學,2014,02:271-27

15、3.10謝玉玲,戴振賢,柳麗娟,許勝,薛正翔,吳玉水. 降鈣素原化學發光免疫定量檢測方法的建11Shehabi Yahya,Seppelt Ian. Pro/Con debate: is procalcitonin useful for guiding antibiotic decision making in critically ill patients?J. Critical Care (Online),2008,123:211. 12 Xiao-Feng Hua,Tian-Cai Liu,Yuan-Cheng Cao,Bo Liu,Hai-Qiao Wang,Jian-Hao Wang

16、,Zhen-Li Huang,Yuan-Di Zhao. Characterization of the coupling of quantum dots and immunoglobulin antibodiesJ. Analytical and Bioanalytical Chemistry,2006,3866:1665-1671. 13Snider R H,Nylen E S,Becker K L. Procalcitonin and its component peptides in systemic inflammation: immunochemical characterizat

17、ion.J. Journal of investigative medicine : the official publication of the American Federation for Clinical Research,1998,459:552-600.立及臨床應用價值J. 福建醫藥雜志,2013,06:10-12.說明書：參照羅氏廠家試劑盒說明書。 2 開發過程遵循標準：1醫療器械說明書、標簽和包裝標識管理規定（局令第10號）2 GB/T15000.2-94標準樣品工作導則3 JJF 1005-2005 標準物質常用術語和定義4 YY 0648-2008 測量、控制和試驗室用電

18、氣設備的安全要求 第2-101部分：體外診斷（IVD）醫用設備的專用要求5臨床化學體外診斷試劑盒通用技術要求6 JJF 1001-1998 通用計量術語及定義7 GBT 19703 體外診斷醫學器具-生物源樣品中量的測量-參考物質的說明8 GBT 19702-2005 體外診斷醫療器械 生物源性樣品中量的測量 參考測量程序的說明9 WS-T 124-1999臨床化學體外診斷試劑盒質量檢驗總則10 YY/T0638-2008/ISO 18153:2003 體外診斷醫療器械-生物樣品中量的測量-校準品和控制物質中酶催化濃度賦值的計量學溯源性11 EN 980 200312 GB9969-1-199

19、8工業產品使用說明書總則13 GBT21415-2008體外診斷醫療器械-生物樣品中量的測量-校準品和控制物質賦值的計量學溯源性14 JJG810-1993波長色散X射線熒光光譜儀15 GB/T 13551-1995 火焰原子吸收光譜法16 GB/T 31364-2015 能量色散X射線熒光光譜儀主要性能測試方法3知識產權評估和論述：本項目采用的ODs標記抗體的技術為國內和國際通用技術。本設計依據羅氏診斷降鈣素原（PCT）說明書（05137624001V1）中熒光量子點標記抗體的原理，及其雙抗體夾心法的方式參考研制而成。4臨床意義PCT（降鈣素原，procalcitonin）是一種蛋白質，當嚴

20、重細菌、真菌、寄生蟲感染以及膿毒癥和多臟器功能衰竭時，它在血漿中的水平升高。自身免疫、過敏和病毒感染時PCT不會升高。局部有限的細菌感染、輕微的感染和慢性炎癥也不會導致其升高。PCT反映了全身炎癥反應的活躍程度。影響PCT水平的因素包括：被感染器官的大小和類型、細菌的種類、炎癥的程度和免疫反應的狀況。另外，PCT只是在少數患者的大型外科術后14d可以測到。PCT水平的升高出現在嚴重休克、全身性炎癥反應綜合征（SIRS）和多器官功能紊亂綜合征（MODS），即使沒有細菌感染或細菌性病灶。但是，在這些病例中PCT水平通常低于那些有細菌性病灶的患者。5原理本試劑是利用免疫雙抗體夾心法測定分析方法來定性

21、檢測人血清或者血漿中的PCT。首先，用EDC/NHS的歐聯作用將ODs標記到Anti-PCT單克隆抗體（標記抗體，一抗）上同時包被于固相載體上，當樣品中的PCT與標記抗體結合后，利用檢測線上的另一種Anti-PCT單克隆抗體（一抗）來捕捉結合了標記抗體的PCT，并設置質控線，質控線上設有抗Anti-PCT單克隆抗體（一抗）的抗體（二抗），用來捕捉未和PCT結合的標記抗體，來對照說明試劑條的質量穩定，形成“抗體抗原抗體”復合物，之后激發量子點發出熒光，樣本中的PCT含量與系統所檢測的相對熒光強度成正比，從而測出樣品中PCT含量。6技術創新點(1) 相較于CRP等蛋白檢測，PCT反映了全身炎癥反應

22、的活躍程度且更為靈敏。(2) 相較于物理檢測方法，熒光檢測更為便捷，對設備及加工工藝要求較低。(3) 相較于化學檢測方法，熒光檢測檢出限低，更為靈敏準確。7仿制試劑理化指標分析（后附血液中降鈣素原（PCT）熒光量子點試劑盒項目仿制試劑理化指標測試報告）8基礎配方及配方中各物質的作用（1） 固相試劑名稱含量（mmol/L）分子量每毫升用量作用牛血清白蛋白0.0147680000.1 g封閉劑MES100213.50.1 g緩沖液成分氫氧化鈉10039.9971緩沖液成分Anti-PCT單抗（一抗）4.5g檢測線抗體抗Anti-PCT單抗（二抗）4.5g質控線抗體(2) 標記試劑：名稱含量（mmo

23、l/L）分子量每毫升用量作用MES100213.50.1 g緩沖液成分氫氧化鈉10039.9971緩沖液成分EDC100191.700.0197g偶聯劑NHS100115.090.01151 g活化劑Cys121.15穩定劑Anti-PCT單抗（一抗）4.5g被標記抗體ODs0.001標記物（3）洗滌試劑：名稱含量（mmol/L）分子量每升用量作用MES100213.50.1 g緩沖液成分氫氧化鈉10039.9971緩沖液成分9關鍵技術及解決方案關鍵技術：此試劑盒的關鍵技術分為以下幾個方面，(1)特異性：本方案要求特異性既達到要求又節省成本，特異性不合格會影響臨床測值出現假陽性。(2)靈敏度：

24、靈敏度是產品的一個重要指標，用來判定產品測定樣本的敏感程度。(3)穩定性：本方案要求試劑穩定性要求達到12個月。 解決方案：(1)特異性：A 篩選抗原：篩選不同廠家的標記抗體，一抗，以及二抗。B量子點的選擇運用雙抗體夾心法提高檢測時的專一性和準確性。(2) 靈敏度：A 定向包被乙基-3-（二甲基氨丙基）碳二亞胺，其表面的的氨基（NH2）直接與蛋白質或多肽共價結合，實現抗體的定向包被，不再需要表面活化，提高試劑靈敏度。B 確定檢測線和質控線相關指標實驗確定T線包被濃度，實驗確定C線包被濃度，實驗確定C、T線在NC膜上的合理距離關系。C EDC/NHS偶聯EDC和NHS一旦偶聯則很難分離，經NHS

25、活化后的ODs在EDC作用下在其表面可以結合多個Anti-PCT抗體，增加了檢測時的捕捉能力，從而提高靈敏度。D 非蛋白封閉劑的應用新型的非蛋白型封閉劑，不僅可以比傳統的蛋白型封閉劑更進一步降低背景，提高實際靈敏度，同時由于不含蛋白，保存也很簡單，放在室溫也不用擔心蛋白降解或長菌變質。E 多聚BSA應用多聚BSA消除非特異性干擾引起的背景問題，能阻斷檢測組分與固相的非特異性鏈接，從而降低背景信號并改善檢測的靈敏度。BSA多聚體帶有陰性電荷，適用于多價干擾的清除，如多價抗體/聚合物或抗原。(3)穩定性：固相、標記試劑為含具有生物活性抗體的液體試劑，為維持試劑的穩定性，可通過加入以下幾種物質：A穩

26、定劑固相試劑和標記試劑中均含有抗體，為延長試劑的有效期，擬添加相應的穩定劑，如：明膠、甘油、蔗糖、海藻糖、甘露醇、乳糖、氨基酸、磷酸鹽、多聚精氨酸，脫脂牛奶，植物蛋白、多肽、水溶性雜蛋白。B 表面活性劑表面活性劑具有固定的親水親油基團，起到增溶、分散和防腐等作用。常用的表面活性劑有吐溫20（Tween）、曲拉通X-100、蔗糖酯、脂肪酸甘油酯、PVP，經實驗篩選后選擇最佳表面活性劑。C 防腐劑常用的防腐劑有疊氮鈉、柳硫汞、ProClin300和山梨醇，經實驗篩選最有利于維持試劑穩定性的防腐劑。D 金屬螯合劑某些金屬螯合劑，具有螯合金屬的能力，可保護試劑中抗原、抗體的穩定性，如EDTA、DTPA

27、、NTA。10主要原料的選擇材料名稱價格/規格易獲得性生產廠家Anti-PCT單克隆抗體（一抗）1000元/mg長期供應博雅享達Anti-PCT單克隆抗體標記抗體1000元/mg長期供應抗標記抗體的單抗（二抗）1000元/mg長期供應ODs4300元/mg長期供應深圳海王英特龍11提高穩定性措施 試劑在28條件下，干燥、避光、密封貯存，有效期24個月，機內穩定28天。校準品用去離子水復溶后28穩定100天。固相、標記試劑為含具有生物活性抗體的液體試劑，為維持抗體的活性及試劑的穩定性，添加以下物質：A.穩定劑固相試劑和標記試劑中均含有抗體，為延長試劑的有效期，擬添加相應的穩定劑，如：明膠、甘油、

28、蔗糖、海藻糖、甘露醇、乳糖、氨基酸、磷酸鹽、多聚精氨酸，脫脂牛奶，植物蛋白、多肽、水溶性雜蛋白。B添加表面活性劑表面活性劑具有固定的親水親油基團，起到增溶、分散和防腐等作用。常用的表面活性劑有吐溫20（Tween）、曲拉通X-100、蔗糖酯、脂肪酸甘油酯、PVP，經實驗篩選后選擇最佳表面活性劑。C添加防腐劑常用的防腐劑有疊氮鈉、柳硫汞、ProClin300和山梨醇，經實驗篩選最有利于維持試劑穩定性的防腐劑。D. 金屬螯合劑某些金屬螯合劑，具有螯合金屬的能力，可保護試劑中抗原、抗體的穩定性，如EDTA、DTPA、NTA。12抗干擾、特異性研究三酰甘油（TG），蛋白質,PCT在體內的半衰期為4-6

29、h半衰期較短,EDC/NHS有可能產生一定抗體聚合物，對本品有干擾，可以進行干擾試驗。13技術要求根據羅氏說明書編制項目指標特異性99.0%靈敏度99.0%抗干擾三酰甘油<1.7mmol/L精密度陽性質控批內精密度：CV15.0%穩定性試劑有效期24個月，開封后有效期均為100小時；14溯源：15生產過程控制：(1)生產用水要用電導率<0.5s/cm的純水。(2)試劑存放：試劑要存放在高密度聚乙烯塑料容器中。(3)抗體忌反復凍融(4)要嚴格控制試驗中的溫度，濕度以及PH。參考專利、文獻：專利：1、CN103558400A 一種降鈣素原乳膠增強免疫比濁法檢測試劑盒2、CN102384

30、902A 基于量子點熒光檢測的酶芯片及其制備方法和應用3、CN104122401A 降鈣素原和C反應蛋白的檢測試紙及其制備方法和檢測方法4、CN103901203A 一種降鈣素原的化學發光定量檢測試劑盒及其制備方法和檢測方法5、CN102053156A 一種基于熒光量子點檢測炭疽芽孢桿菌的方法6、CN102707071A PCT/CRP聯合檢測用膠體金試紙條及其制備方法文獻：1宋健,范佳,宋大千,畢麗榮,周廣宇,張皓,魏景艷,楊柏. 量子點偶聯抗體型夾心免疫傳感法檢測心肌肌鈣蛋白IJ. 高等學校化學學報,2009,10:1940-1944.2鄭怡麟,何瑩,陳安,易維京,胡川閩. 抗人降鈣素原特異性單克隆抗體的制備鑒定及初步應用J. 第三軍醫大學學報,2013,06:523-526.3張鵬飛,宋杰,陳佳,陸慧琦,韓煥興. 量子點與抗乙肝表面抗原(HBsAg)抗體的偶聯研究J. 分析化學,2013,06:846-850.4邢仕歌,熊齊榮,鐘強,張悅,卞素敏,金涌,儲曉剛. 量子點抗體偶聯技術研究進展J. 分析化學,2013,06:949-955.5馬慧蓮. 發光CdTe量子點生物偶聯產物制備、性質及應用研究D.東北大學,2005.6白亞龍. 一種基于量子點熒光微球的高靈敏度免疫層析技術初步研究D.上海師范大學,2010.7謝穎,徐靜娟,于俊生,陳