1、病毒包裝相關知識匯總應用領域隨著分子生物學的理論及技術方法（特別是重組DNA技術）的迅速發(fā)展，人們可以在實驗室構建各種載體、克隆及分析目標基因，使疾病深入至分子水平研究，于是誕生了基因診斷、基因治療技術。基因治療從基因角度理解是對缺陷的基因進行修復增補，或將正常功能的基因置換的方法。從治療角度理解是一種基于導入遺傳物質以改變患者細胞的基因表達從而達到治療或預防疾病的目標的新措施。當代基因治療研究的熱門方法是將外源DNARNA片段導入靶細胞或組織，研究靶基因的上調或抑制情況。例如，有些異常基因（癌基因、病毒基因），可通過技術引入外源片段將其抑制；有些基因本身有治療作用，體外合成該基因導入體內使其

2、表達豐度提高。故選擇合適高效的基因導入介質系統(tǒng)尤為關鍵。而病毒載體已成為當前基因治療載體研究的熱點。病毒載體的優(yōu)勢：1、利用病毒天然的感染性進入細胞，感染效率高；2、病毒的宿主范圍廣，可以感染分裂細胞和非分裂細胞；3、病毒基因組的結構簡單、分子背景比較清楚，穩(wěn)定易于改造、易于制備；4、復雜的裝配過程由細胞完成；5、不同的病毒載體具有不同的表達特點；6、通過載體改造的方式形成了復制缺陷型結構，安全性高；7、病毒包裝技術經歷了多年的研究，已趨于成熟，可用于產業(yè)化大量生產慢病毒包裝技術背景：慢病毒（Lentivirus）是逆轉錄病毒的一種，慢病毒（Lentivirus）載體是以HIV-1（人類免疫缺

3、陷1型病毒）為基礎發(fā)展起來的病毒載體。具有感染譜廣泛、可用于感染依靠傳統(tǒng)轉染試劑難于轉染的細胞系如原代細胞、懸浮細胞和處于非分裂狀態(tài)的細胞，并且在感染后可以整合到受感染細胞的基因組，進行長時間的穩(wěn)定表達，成為導入外源基因的有力工具。目前慢病毒系統(tǒng)已經被廣泛應用到各種細胞系的基因過表達、RNA干擾等研究以及活體動物實驗中。技術原理：慢病毒載體系統(tǒng)包含了包裝、轉染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息，且能提供慢病毒所有的轉錄并包裝RNA到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白。第三代四質粒慢病毒載體系統(tǒng)，相較于前代慢病毒載體，安全性大大提升。其包括如下成分：a.基因轉移/表達載體；b.輔助載體。利用表達載體和

4、輔助載體共轉染細胞，在細胞中進行病毒的包裝，包裝好的假病毒顆粒分泌到細胞外的培養(yǎng)基中，離心取上清液后純化病毒，可以直接用于宿主細胞的感染，目的基因進入到宿主細胞之后，經過反轉錄，整合到基因組，從而高水平的表達效應分子。技術特點：1、直接包裝成為假病毒顆粒，對分裂和非分裂細胞均有感染作用。2、可以通過簡單方式，在短時間內獲得穩(wěn)定表達特定基因的多種細胞株。3、可用于基因敲除、基因治療和轉基因動物研究。4、無需任何轉染試劑，操作簡便。5、可以根據需要選擇多種標記。技術應用：1、將過表達質粒/干擾質粒轉入難以轉染的細胞，比如神經元細胞、干細胞或其它原代細胞；2、將過表達質粒/干擾質粒轉入動物組織，以期

5、獲得長期表達；3、構建穩(wěn)定過表達/干擾細胞系，再用exvivo的方法導入動物體內；4、基因治療；5、轉基因動物；6、基因敲除；7、藥物研究：構建表達受體蛋白的細胞系，研究藥物的作用；8、快速建立生產目的蛋白的細胞系，非常有前途的真核細胞表達方法。技術流程概述：1、基因合成及病場載體構建2、轉染及驗證3、細胞培養(yǎng)及慢病毒包裝4、收秋病是液及病是純化5、病毒滴度檢測6、感染效果WB qPC斛價慢病毒包裝常用質粒圖譜：nwi whIL i L X/ / am技術背景：卜 ' AIQ10g EpC&H CW MCS £ F i -iGfip + fhjn>L VI

6、9;V I XM 網明腺病毒包裝腺病毒（Adenovirus,AdV是一種非整合型雙鏈DNAW毒，在自然界中廣泛分布。雖然一些類型的腺病毒會引起人胃腸道、上呼吸道或眼部上皮細胞的急性感染；但是應用于基因治療研究的腺病毒是安全的，對人無致病、致畸、致癌的潛在危害。根據JournalofGeneMedicine的統(tǒng)計，截至2006年，在全球1192項基因治療臨床試驗方案中，有305項（26%）使用腺病毒載體，首次超過反轉錄病毒，居第一位。由于腺病毒可以感染呼吸道和消化道，所以它所介導的基因治療可以靜脈注射，還可以通過口服經腸道吸收，或通過噴霧、滴注經呼吸道吸收，使得基因治療方案易于推廣應用。技術原

7、理：腺病毒（Adenovirus）是一種無包膜的雙鏈線性DNAW毒，基因組長約36kb,衣殼呈規(guī)則的20面體結構。腺病毒外源基因裝載容量大，且能夠感染絕大多數哺乳動物細胞，包括分裂和不分裂的細胞；除了一些抗腺病毒感染的淋巴瘤細胞。腺病毒適用于在難以轉染的細胞中進行RNA干擾、過表達中I定基因和invivo實驗。常用重組腺病毒系統(tǒng)組成：腺病毒骨架載體（攜帶腺病毒主要功能基因）、穿梭載體（轉移外源基因表達盒到骨架載體上）。目前應用最為廣泛的是AdMax腺病毒載體系統(tǒng)，骨架質粒和穿梭載體共轉染293細胞后，在細胞內中通過Cre/loxP實現載體重組，進而產生重組腺病毒。通過裂解細胞收獲病毒粒子，病毒

8、粒子經過反復擴增與純化可得到高滴度的腺病毒。技術特點1、幾乎可以感染所有類型的細胞，包括分裂細胞和非分裂細胞；2、可以獲得復制缺陷型（E1和E3缺失）的腺病毒；3、病毒滴度高，產生病毒經過濃縮后可以達到1012PFU/mL；4、 腺病毒載體感染宿主的范圍比較廣，制備容易，操作簡單；5、感染細胞時，不整合到染色體中，不存在激活致癌基因或插入突變等危險，生物安全性高。技術應用1、 應用于體內接種疫苗。用攜帶免疫調節(jié)基因或腫瘤特異抗原已近的腺病毒載體轉入相應腫瘤細胞以誘導抗腫瘤免疫反應，可制成具有抗腫瘤活性的瘤苗。2、 應用于信號轉導，基因轉位，coIP，動物實驗，干細胞研究等科研實驗。3、 可以完

9、成較高難度的克隆構建，包括具有細胞毒性作用基因的腺病毒構建，在短時間內完成從原始質粒到病毒DNA勺構建工作。4、 產生滴度高，非常適于基因治療。技術流程1、構建穿梭質粒以含目的基因的質粒為模板，分別在兩個酶切位點設計引物，PCR擴增目的基因，雙酶切后插入穿梭質粒。2、細胞轉染將取骨架質粒和穿梭質粒轉染293細胞。3、將PacI消化后的腺病毒表達載體轉染AD293細胞，收獲細胞以制備病毒粗提液。4、將病毒粗提液感染293A細胞以擴增病毒。5、收集病毒顆粒分裝，-80C保存。腺病毒包裝常用質粒圖譜腺相關病毒包裝技術背景：腺相關病毒（adeno-associatedvirus,AAV）,屬于微小病毒

10、科（parvovirus）,為無包膜的單鏈線狀DNA病毒，需要輔助病毒（通常為腺病毒）參與復制。AAV的基因組約4800bp,兩個ITR序列和兩個開放閱讀框。AAV具有多種常見血清型，100多種病毒變種。其中AAV2是目前應用最廣的腺相關病毒，對多數常見細胞均有較好效果。重組腺相關病毒載體（rAAV）源于非致病的野生型腺相關病毒，由于其安全性好、宿主細胞范圍廣（分裂和非分裂細胞）、免疫源性低，在體內表達外源基因時間長等特點，被廣泛用于體內實驗研究，且腺相關病毒載體已成為世界上最常用的基因治療載體之一。腺相關病毒載體整合率遠低于慢病毒載體，但其可以以染色體外形式長期（數月至數年）存在于非分裂細胞

11、中，從而實現外源基因長期表達。技術原理：常用腺相關病毒載體系統(tǒng)AAVHelper-FreeSystem,能產生AAV2血清型病毒而無需輔助病毒。該系統(tǒng)包含3個質粒：1個重組表達質粒和2個輔助質粒。將目的基因克隆至重組pAAV載體上；將AAV感染必須的腺病毒基因（E2AE4及VA等）構建至輔助質粒pHepler上，將AAV復制基因rep和capsid結構基因cap構建至質粒pAAV-RC上。三質粒共轉染表達腺病毒E1基因細胞，在細胞中進行病毒的包裝。通過裂解細胞，離心取得上清液后進一步濃縮純化，收集病毒。技術特點：1、安全，AAV不參與任何疾病的發(fā)生，已經用于臨床疾病治療；2、感染范圍廣，可以用

12、于神經系統(tǒng)、眼睛、心肌、肝臟、肌肉和肺部定位注射或定向給藥；2、滴度高，顆粒小，擴散能力強；3、表達穩(wěn)定，可持續(xù)半年以上；4、外源基因定向重組，免疫原性低，極少發(fā)生非特異反應和免疫抑制，適合于進行基因治療研究。技術流程：1、病毒載體構建2、腺相關病毒包裝3、腺相關病毒濃縮與純化4、病毒滴度檢測腺相關病毒包裝常用質粒圖譜：附1:12種不同血清型AAV對各組織器官細胞的親和性血清型組織親和性AAV1肌肉，心臟，骨骼肌（包括心肌），神經組織AAV2中樞神經，肌肉，肝臟，腦組織，眼，AAV3肌肉，肝臟，肺，眼AAV4中樞神經，肌肉，眼，腦AAV5肺，眼，中樞神經，關節(jié)滑膜，胰腺AAV6肺，心臟AAV7

13、肌肉，肝臟AAV8肝臟，眼，中樞神經，肌肉AAV9心臟，肌肉，肺（肺泡），肝臟，中樞神經DJ肝臟，視網膜，肺，腎臟DJ/8肝臟，眼，中樞神經，肌肉Rh10肺，心臟，肌肉，中樞神經，肝臟附2:常見的病毒載體及生物學特性比較：隨著基因治療的廣泛應用，科學家們陸續(xù)開發(fā)出多種病毒載體，用于外源基因導入靶細胞或組織。這些病毒載體各有優(yōu)點，其中，慢病毒包裝簡單、周期短、可穩(wěn)定表達；腺病毒滴度高、感染及表達蛋白的能力強；腺相關病毒安全性高、表達穩(wěn)定。在實驗中，均需根據自己的實驗目的進行實際選擇。特將這三種病毒的生物學特性整理如下：慢病毒LLentivirus)腺相關病毒（AAV）腺病毒(Adenovirus

14、)病毒類型RNAssDNAdsDNA包裝容量8kb<5kb8kb包膜有無無顆粒直徑90-100nm20-30nm60-90nm包膜有無無基因組dsRNAssDNAdsDNA表達起始時間48-72h72-96h24-48h表達持續(xù)時間>2months>6months1month宿主基因組整合方式隨機高頻整合定向低頻整合或非整合非整合親噬性感染譜廣感染譜廣感染譜廣免疫原性低低高主要缺點隨機整合存在引發(fā)包裝容量小免疫原性低，無致病性腫瘤的可能性主要優(yōu)點在大部分組織中獲得穩(wěn)定表達免疫原性強大部分組織都可以獲得較局感染效率附3:如何根據實驗目的選擇合適的病毒載體項目慢病毒（LV）腺病毒

15、（Ad）腺相關病毒（AAV）體內實驗靜脈注射-+定點注射+細胞回輸+-體外實驗過表達+-干擾+-MicroRNA+-前沿研究CRISPR/Cas9+-CAR-T+-自噬+-光遺傳+-+附4:病毒包裝常見問題與解答綜合問題1、病毒包裝的關鍵是什么？病毒包裝的幾個關鍵節(jié)點就是細胞因素、載體系統(tǒng)（盡量使用成熟的商業(yè)化載體系統(tǒng)）、構建重組的質粒正確與否、質粒抽提純化情況、包裝轉染控制（24、48小時的細胞及熒光狀態(tài)判斷）、目的基因對病毒包裝影響（基因大小、序列情況、蛋白功能毒性等都會影響到是否能包裝成功）。2、病毒載體種類應如何選擇？答：穩(wěn)定長時表達研究選擇慢病毒，比如穩(wěn)轉細胞株篩選；病毒使用量大選擇

16、腺病毒，比如老鼠實驗；基因治療選擇腺相關病毒。操作難度上慢病毒與腺病毒都差不多，是指重組病毒的制備和純化角度來說的，AAV的制備就更復雜更難一些。從載體毒性而言，慢病毒毒性較大，但它相對較少引起受體的免疫原性，而腺病毒則有較大的免疫原性。腺相關病毒載體是比較理想的基因治療載體，免疫原性較低，而且對受體傷害較少。從插入目的基因角度考慮，慢病毒最大插入基因長度是5k,腺病毒最大插入基因長度是8k,腺相關病毒最大插入長度是3k。（具體可參考附2:常見的病毒載體及生物學特性比較）至于具體是選擇腺病毒好，還是慢病毒或別的病毒載體好，主要還看你的實驗目的，其次才是看哪那種病毒載體容易做。金開瑞的研究人員有

17、豐富的病毒研究和使用經驗，咨詢我們的技術支持團隊，您可以獲取更多幫助。3、病毒載體對目的基因的長度是否有要求？AAV的總包裝容量是4.7kb,載體中ITRs（兩個ITR共290bp）+hCMV約750bp）+polyA（約150bp）約1200bp，所以如果用AAV包裝載體，目的基因長度要求不超過3.5kb。相對應慢病毒目的基因長度不超過5kb，腺病毒載體目的基因長度要求不超過8kb。4、如何選擇合適的啟動子用于體內動物實驗？部分質粒載體的啟動子所含GC含量比較高，所以進入動物體內后，細胞會啟動表觀遺傳學信號通路，對其進行甲基化修飾或者在染色體整合位點進行去乙酰化修飾從而抑制基因的表達。體外細

18、胞的病毒載體轉導偶爾發(fā)生類似修飾，但比較罕見。所以，針對體內動物實驗，尤其是利用病毒載體制備轉基因或者基因敲除、RNA干擾小鼠等，需要選擇恰當的啟動子才能表達外源插入片段。我們擁有豐富的經驗，我們的啟動子庫可以幫助研究人員選擇合適的啟動子用于特定的實驗。5、什么時候需要使用誘導表達系統(tǒng)？誘導表達系統(tǒng)無論是對于體外基因功能研究還是體內動物實驗，都是非常有用的一套系統(tǒng)，當研究遇到以下情況時，建議使用誘導表達系統(tǒng)：a、 所表達基因或者外源片段具有抑制細胞生長、引起細胞毒性等特性；b、 需要在特定時間開啟或關閉外源片段的表達。6、成功構建誘導表達系統(tǒng)的關鍵是什么？一個成功的誘導表達系統(tǒng)，需要達到以下效

19、果：a、對于誘導激活系統(tǒng)來說，需要在未激活前保持很低的表達水平，而激活后，能迅速地高水平并且穩(wěn)定表達。b、對于誘導關閉系統(tǒng)來說，需要在關閉前可以維持正常的表達水平，而添加誘導關閉物后，能迅速徹底地關閉基因的表達。而影響誘導表達系統(tǒng)構建成功的因素主要有以下幾點：a、誘導表達載體自身調控元件：包括啟動子的強弱、啟動子對誘導物的響應效果、載體啟動子外其它調控元件對插入片段表達的影響。解決方案包括使用組合誘導物以達到更佳效果，改造其它調控元件以減少泄露表達。b、穩(wěn)定整合位點：由于構建誘導表達系統(tǒng)必須在穩(wěn)定細胞株中實現，所以，穩(wěn)定整合位點附近的轉錄活性對誘導表達系統(tǒng)影響很大。轉錄活性過低，導致誘導激活效

20、果不佳，轉錄活性過高，導致誘導激活前表達水平過高或者誘導關閉后仍然有殘留表達。因此需要構建多株穩(wěn)定細胞株，并進行比較，挑取誘導前后均符合預期的一株進行實驗。3）穩(wěn)定整合后拷貝數：拷貝數過高也會導致誘導激活前表達水平過高或者誘導關閉后仍然有殘留表達。所以建議使用逆轉錄（包括慢病毒）載體獲得單拷貝細胞穩(wěn)定株。7、如何使用病毒液去感染靶細胞？不同的重組病毒載體，不同的細胞，以及動物體內組織細胞侵染，其具體的操作步驟都有所不同。所以建議研究人員依據具體的實驗選擇不同的操作步驟。8、病毒可以高效感染任何靶細胞嗎？理論上，現有的病毒載體可以在任何條件下高效感染任何靶細胞。其依據是，病毒載體高效感染細胞主要

21、受三個參數影響：細胞特性：分裂和非分裂細胞、體內所處環(huán)境是否存在血腦屏障等阻礙。現有的病毒載體，綜合起來，既可以侵染分裂細胞，也可以侵染非分裂細胞，而且還可以突破血腦屏障高效侵染腦神經細胞。細胞種類：不同組織細胞。雖然不同載體對不同組織細胞的侵染有傾向性，但通過改造病毒載體決定病毒表面糖蛋白的序列，即使針對同一類病毒，也可以獲得最高達數百種不同侵染特性的載體系列，從而可以滿足不同細胞類型的侵染需求。病毒載體的滴度。除不同類病毒其滴度會不同外，病毒載體的滴度還受包裝片段的特性影響，包括插入片段的毒性和大小。外源片段的毒性可以通過使用誘導調控系統(tǒng)或者改造病毒包裝細胞系來減輕毒性影響，而插入片段的大

22、小的影響可以通過選擇對外源片段具不同容納能力的病毒載體來避免。金開瑞擁有龐大的病毒載體庫，可以最廣程度地覆蓋各種組織細胞，同時可以覆蓋不同特性的細胞，還擁有各種誘導表達系統(tǒng)和經過改造的病毒包裝細胞系可以包裝具有細胞毒性的外源插入片段。9、如何才能用重組病毒載體在細胞上做出滿意的結果？病毒載體在細胞試驗中要想取得滿意的結果，主要在以下幾個方面：病毒載體在不同的細胞由于細胞表面受體的差異而不同轉導效率不同，盡量選擇轉導效率高的細胞，可用參考文獻報道和轉導報告基因進行篩選。良好的細胞狀態(tài)。最好在細胞狀態(tài)最佳時感染病毒。特別是不要在消化細胞后不久就感染，因為此時細胞膜上的病毒受體往往受到了暫時的破壞，

23、應該培養(yǎng)過夜后再感染病毒，效果較好。適當的轉導MOI（病毒基因組數/細胞的比），一般可用105上下做倍比稀釋。適當的轉導體積，如24孔板可用200ul,6孔板0.5ml。轉導時間為1-2h，每25分鐘晃動培養(yǎng)板混勻一次。（轉導時，最好換用無血清培養(yǎng)基，因為血清對病毒的感染有些許不利影響）可加合適輔助藥物刺激，增強表達。適當表達檢測時間，如是分泌蛋白可每24h連續(xù)取培養(yǎng)上清檢測。通常蛋白表達量在幾百納克至幾微克/ml水平。10、如何才能用病毒載體在動物體內做出滿意的結果？病毒載體在動物試驗中要想取得滿意的結果，主要注意以下幾個方面：選擇適當的血清型：例如不同的AAV血清型在動物體內同一組織有不同

24、的轉導效率，如AAV1在肌肉組織中、AAV5在肺組織中有很高的轉導效率。選擇適當的靶器官：同一血清型AAV在不同的組織具有不同的轉導效率，盡量選擇轉導效率高的靶器官。轉導途徑：盡量選擇局部直接多點注射靶器官。轉導病毒量：根據經驗，所加病毒量太多表達量反而會降低。檢測時間：根據經驗不同基因的表達高峰時間是不同的，一般在2周可檢測到基因表達，如無抗體產生的影響，基因的表達可持續(xù)表達半年以上的時間。11、用于體內試驗的重組病毒，是否要求純化？是的，病毒純化很有必要。因為細胞裂解液包含有缺損顆粒、大量的病毒外殼和penton蛋白（細胞毒素）、培養(yǎng)基、血清以及細胞碎片。這些雜質如果被注入動物體內，會引起

25、宿主強烈的免疫反應。另外，純化的作用還包括可以將病毒濃縮至一定濃度便于注射、使病毒懸浮于適于體內注射的緩沖液中等。12、病毒可以濃縮或稀釋嗎？方法如何？可以濃縮：對于一般實驗室用戶，可以采用高速離心辦法濃縮。目前市面上的病毒濃縮純化辦法很多，有不少商業(yè)化產品。不同的病毒純化辦法不同。腺病毒載體可以用300K以下的濃縮離心管（PALL公司產品）進行濃縮。一般來說濃縮后的滴度以不超過3X1012v.p/ml為宜，過濃可能導致病毒聚集而產生沉淀。可以稀釋：在實驗過程中稀釋病毒產品的等滲溶液沒有其他特殊要求，常規(guī)的動物試驗用等滲溶液即可，如PBS生理鹽水等。稀釋后的樣品盡量一次用完。13、病毒一定要濃

26、縮么？病毒一般可以收兩次，可以在48h和72h各收一次。如果你不想麻煩濃縮病毒的話，也可以不濃縮，直接將收集的病毒上清作為要感染的細胞的培養(yǎng)基，但是可能效果會不太好。并且一般收病毒時，培養(yǎng)基的營養(yǎng)已經損耗了很多，那樣直接培養(yǎng)感染細胞會損害細胞，所以建議還是進行濃縮后再感染。14、VP，PFU，IFU的區(qū)別？哪一個能更好地反映所使用的有活性的病毒的量？VP：病毒顆粒（viralparticle）,是“活”（有感染性）和“死”（無感染性）的腺病毒顆粒的總量。在體內實驗中，它代表了進入肌體可能引起宿主針對腺病毒的免疫反應的腺病毒顆粒總量。測定方法是OD260法，只有經過純化的腺病毒才能通過此方法測定

27、VP/ml值。PFU空斑形成單位（plaqueformationunit）,是有感染性的“活”的腺病毒的總量，即腺病毒得活性單位。測定方法是將腺病毒樣品經過一系列梯度稀釋后，感染293細胞并培養(yǎng)，通過計算細胞病變空斑數得到腺病毒樣品中PFU/ml值。IU:感染單位（infectiousunit）,和PFU一樣，是另一種腺病毒活性單位。測定方法是TCID50法。VP/PFU或VP/IU的值是判斷腺病毒純品中活病毒所占比例的重要依據。如果該病毒產品要用于人體實驗，按中國生物制品質量要求，該比值應該在33以下。用于普通實驗研究，該比值要求可以適當放寬。15、感染細胞最佳MOI的測定？MOI（Mult

28、iplicityofInfection，感染復數）是指每個細胞感染的病毒數，通常MOI越高，病毒整合到染色體的數量以及目的蛋白的表達量越高。對于分裂活躍的細胞，比如HeLa、293細胞，MOI=1時，80%以上的細胞均表達目的基因。而對于非分裂細胞，比如原代細胞，感染效率較低。我們建議通過比較不同MOI（比如0、1、5、10、50、100等），選擇適合的MOI進行實驗（可以考慮選用攜帶報告基因的病毒，比如Lenti-EGFP）。16、重組病毒產品如何運輸和保存？病毒產品一般采取干冰運輸。避免重組病毒反復凍融，請酌情分裝后于-80保存，建議不要在-20下長期保存。在我們提供的保存液中，病毒產品-

29、80保存期為半年。建議保存612個月以上的樣品，進行實驗前，重新測一次滴度。病毒產品解凍后最好保持在冰浴中，并盡快使用。如果解凍后的病毒一時用不完，滴度足夠高時，4可保存12周。但最好盡快用完，根據我們的經驗，4放置1周，滴度會有45倍的下降。17、所提供這些病毒產品的安全性如何？使用病毒載體的危險性主要有以下幾個考慮因素：a、是否能重組產生致病性病毒；b、是否具備復制能力；c、是否能整合，并導致癌基因激活或者抑癌基因失活；d、免疫原性。金開瑞所使用的病毒載體，全部經過改造，去除了致病性元件和復制功能區(qū)，因此重組產生功能性病毒的概率極低。一部分病毒（腺病毒和腺相關病毒載體），其整合幾率低，因此

30、安全性高。同時，針對部分具備整合能力的病毒載體（慢病毒載體），還去除了其3LTR內的激活元件，排除了其激活下游基因的能力。因此，這些病毒載體用于體外和動物實驗，對使用者而言都具有極高的安全性。有的病毒載體，比如腺相關病毒載體，即使用于人體，也被認為是安全性非常高的一類基因治療載體。盡管如此，我們建議，使用病毒載體進行細胞或動物實驗時，需要遵循標準廢棄病毒載體操作流程。18、如何保證病毒包裝實驗室安全？病毒載體已經被全世界許多實驗室應用，沒有出現過任何意外，但仍具有潛在的產生復制型病毒（RCD和致癌的風險，操作者在實驗中仍需要保持高度警惕！所有操作均應盡量在BSL2級生物安全柜中進行，并佩戴一次

31、性口罩和手套，尤其要避免病毒接觸口、眼、鼻、耳、傷口等身體開放性區(qū)域，避免產生氣溶膠，tip頭一定要選擇帶有濾芯的。必須高度注意被污染的尖銳物品，包括針頭、注射器、載玻片、移液管、毛細玻璃吸管和解剖刀。每次實驗后，立即清理所有接觸過病毒的器具，均應高壓消毒再進行下一步處理。顯微鏡臺、生物安全柜臺面等使用后，用70%乙醇擦拭。意外灑落的含病毒的液體，用衛(wèi)生紙吸干后，用0.6%次氯酸鈉溶液浸泡被污染處1h。裝盛病毒載體的實驗用品，要單獨放置，標示清楚，并標注“危險品”字樣。盡量使用培養(yǎng)瓶，不要使用培養(yǎng)板來感染病毒，以防意外灑落。對共用實驗室的人員進行病毒安全培訓或提示。關于慢病毒1、慢病毒載體的特

32、點及應用范圍？慢病毒載體是有包膜的RNAW毒，可以感染分裂和非分裂細胞（而逆轉錄病毒只能感染有絲分裂活性的細胞），在感染宿主細胞后不能自我復制。以水泡口炎病毒（VesicularStomatitisVirus）包膜G蛋白VSV-G替換野生型包膜蛋白，使重組慢病毒感染范圍覆蓋了各種傳代和原代的腫瘤細胞、上皮細胞、成纖維細胞、肌細胞、神經細胞，以及干細胞、T細胞等。2、金開瑞生物的重組慢病毒使用何種系統(tǒng)？金開瑞生物使用第三代慢病毒包裝系統(tǒng)，包括3個輔助質粒、1個用于插入目的基因的轉移質粒，三個毒粒組裝必須的基因（Pol,Gag,Rev）被分開裝載于不同的質粒上，包裝過程中必須4質粒共轉才能成功出毒

33、，最大限度降低了重組概率。同時三代轉移質粒的5和3'LTR都刪除缺失了野生型的U3,成為不能自我復制的自滅活（SIN）載體。3、慢病毒載體生物安全性如何？重組慢病毒載體已經刪除了所有野生型毒性基因，感染細胞后只表達裝載的目的基因，不表達任何野生型病毒的基因，自滅活序列修飾使其不能復制，包膜糖蛋白做了pseudotyped替換為VSV-G因此三代包裝系統(tǒng)的改造保證了慢病毒載體的生物安全性，目前未有致瘤報道。4、影響慢病毒產量的因素有哪些？包裝過程中，慢病毒的產量隨著插入片段的增大而呈指數下降，一般當目的基因2k時即會可見顯著的出毒效率降低，當接近4k時，其出毒量會低至可以使用的下限、或幾

34、乎不出毒。插入序列的G3量70%寸，產量會受到影響。一些對包裝細胞有毒性的基因，也會導致難以產毒。5.、慢病毒載體可以容納多大的插入基因？整個慢病毒基因組在5'和3'LTR之間的最大容納能力約9k,由于轉移載體中各種表達原件的存在，載體的實際裝載極限在4k左右。一般3.5k的基因已無法作產量保證。6、該如何選擇轉移載體？根據實驗應用需求，主要從啟動子、熒光/抗性標簽等角度選擇載體所攜帶的原件。過表達目的序列（包括編碼基因、非編碼RNA時通常選擇CMW動子，某些情況可能使用EF1a啟動子；進行shRNA干擾時通常選擇U6啟動子。后續(xù)進行穩(wěn)轉株篩選時，需攜帶如Puro的抗性篩選基因

35、。攜帶GFP、mCherry等熒光蛋白便于直觀監(jiān)測病毒感染效率，但在后續(xù)的免疫熒光、流式細胞術等實驗中，可能會由于波長范圍干擾而帶來不便，例如GFP同FITC互相干擾。另外當目的基因較大時，攜帶不必要的熒光或篩選元件會進一步降低出毒效率。7、慢病毒感染后多長時間可見目的基因表達？通常慢病毒介導的目的基因表達通常在72h左右達到高峰，大多數后續(xù)檢測可在此階段進行。對于代謝快速的細胞在24h即可看到熒光蛋白等較高表達的產物，代謝較慢的細胞可能需要72-96h。8、我以前用過慢病毒感染造血細胞，但是表達不理想，你們有沒有好的解決辦法？答：影響慢病毒載體介導的目的蛋白表達的因素主要是病毒的感染能力和特

36、定的啟動子在該細胞中的強度。VSV-G介導的慢病毒載體對造血系統(tǒng)的細胞的感染能力并不合適，除了常規(guī)用的VSV-G外，我們公司還擁有其它8種病毒包膜蛋白庫，我們會根據客戶的需要選擇特定的包膜蛋白，或者是利用特定的啟動子，從而使目的基因能在特定的細胞中得以高表達。9、你們提供的慢病毒的滴度是如何測定的？這個測定方法如何？我拿到病毒后需要自己測滴度嗎？我們是在293T細胞株中對純化的慢病毒進行滴度測定的。常用有4種方法進行慢病毒滴度測定，分別是：通過ELISA對病毒顆粒中的p24蛋白進行檢測；通過定量PCR寸病毒顆粒的RNA®行檢查；通過定量PCR寸整合到基因組DNA中的病毒序列進行檢測；

37、通過FACS對熒光蛋白的表達水平進行檢測。我們用基因組DNAt量PCR勺方法和熒光法進行慢病毒滴度的檢測。前兩種方法并不能區(qū)分病毒顆粒是否有活性，因此測定所得的滴度往往比后兩種方法高一至兩個數量級。后兩種方法確定的是有效的病毒滴度，因此更有意義。由于并非所有的病毒載體中都含有熒光蛋白，此外，熒光蛋白的表達有時候還受啟動子及表達的目的基因影響，因此通過整合到基因組中的病毒序列進行檢測是最佳方法。關于腺病毒1、腺病毒載體對目的基因的長度是否有要求？有要求。對E1和E3雙缺失的腺病毒載體，比如AdMax的KitC、KitD等，其總包裝的外源片斷要求小于8kb。而對于只有E1缺失或E3缺失的載體，比如

38、KitA、KitB等，外源片斷要求小于5kb。注意，外源片斷指包括啟動子、外源基因和polyA等在內的整個插入片斷。2、我的試驗需要多少總量的腺病毒載體？腺病毒介導外源基因的基因治療研究一般分為體外培養(yǎng)細胞試驗（體外試驗）和動物試驗（體內試驗）兩部分，不同的實驗設計所需要的病毒量也不盡相同。根據經驗，完成一個完整的腫瘤治療實驗需要腺病毒的病毒量總量約為3X1012VP左右.3、如何提高腺病毒的活性？提高腺病毒的活性，關鍵應該是在病毒包裝過程和擴增過程。純化過程只是去掉有缺陷的病毒和細胞碎片等容易引起機體免疫反應的過程，如果擴增的病毒滴度高，那么純化后就會更高的。4、克隆到轉移載體的基因中的5&

39、#39;和3'UTR（未翻譯區(qū)）的額外的堿基會影響蛋白表達嗎？UTR盡可能短一些，特別是在5'要避免在mRNAl形成二級結構。在起始密碼子ATG前面可以加一小段（6-9bp）的堿基序列可以增強目的基因的表達，比如Kozak序列（GCCGCCACCATG）5、如何判斷腺病毒載體是否能高效感染某種細胞？參照文獻報道是最簡單的辦法，也可以用帶報告基因的腺病毒先行預實驗。Ad5能高效感染絕大多數人類、小鼠等的體細胞（包括分裂和非分裂細胞），比如肝、肌肉、神經組織等。但對血液系統(tǒng)來源細胞和某些腫瘤細胞，比如乳腺癌、白血病細胞等，感染效率較低。6、腺病毒載體在體外實驗（invitro）中應

40、注意哪些問題？1）由于細胞表面受體的差異，腺病毒載體在不同的細胞中轉導效率不同。可根據文獻報道或用帶報告基因的腺病毒載體判斷病毒用量。2）在細胞處于對數生長期時感染病毒效果較好。避免在消化細胞后立刻感染病毒，因為此時細胞膜上的病毒受體往往受到了暫時的破壞。培養(yǎng)過夜后再感染病毒，效果較好。3）選擇適當的轉導MOI（病毒感染單位數/細胞數），可以在MOI為0.11000范圍內進行試驗（10倍比稀釋）。4）感染病毒時細胞培養(yǎng)液的體積盡量小一些，以完全覆蓋細胞為準。如24孔板可用200ul，6孔板1ml。5）感染時間為90分鐘，每15分鐘輕輕晃動培養(yǎng)液一次，以混勻。6）選擇適當表達檢測時間，一般感染病

41、毒24h后就能檢測到目的基因的表達，48小時表達達到較高水平。7、用于體內試驗的腺病毒，是否要求純化？是的，病毒純化是很必要的。因為細胞裂解液包含有缺損顆粒、大量的腺病毒fiber和penton蛋白（細胞毒素）、培養(yǎng)基、血清以及細胞碎片。這些雜質如果被注入動物體內，會引起宿主強烈的免疫反應。另外，純化的作用還包括可以將病毒濃縮至一定濃度便于注射、使病毒懸浮于適于體內注射的緩沖液中等。8、如果我的實驗中需要將重組腺病毒注射入動物體內，如果貴公司提供的純化產品比較濃，需要如何稀釋病毒產品，有特殊要求嗎？在實驗過程中稀釋病毒產品的等滲溶液沒有其他特殊要求，常規(guī)的動物試驗用等滲溶液即可，如PBS生理鹽水等。稀釋后的樣品盡量一次用完，在沒有保護劑的情況下，腺病毒在28c保存時間越短越好。9、小鼠體內注射腺病毒，一只小鼠肌注大概多少量？體內表達時間和表達高峰如何？大部分文獻顯示，腺病毒用量范圍在108-10IU/只小鼠。根據經驗，小鼠肌注腺病毒后，34天目的蛋白的表達達到高峰，一周后逐漸下降，持續(xù)表達時間在兩周左右。10、腺病毒載體對小鼠的半致死劑量（LD50）大概是多少？根據經驗，靜脈注射小鼠（昆明鼠），半致死劑量LD50大約為1X1011v.p./只；裸鼠和SCID鼠可能更敏感一些。肌注方式的LD50