1、遠距離調控元件與遺傳性疾病作者：李亞王丹何浪王玉明 【摘要】 組織和發育表達特異性基因通常具有高度復雜的表達調控模式。除啟動子外，該類基因的正常表達尚需要其它調控元件參與。這些調控元件主要包括增強子和沉默子等，它們可位于距離轉錄基因很遠的DNA序列中，甚至存在于與轉錄基因功能上不相關的鄰近基因內。含有組織特異性轉錄因子結合位點的調控元件，通過參與調控相關基因的表達，促進組織器官的分化與發育。這種精確的調控機制一旦破壞，將導致疾病的發生。而且，某些調控元件的異常能導致臨床表型與相應基因編碼區突變截然不同的疾病。 【關鍵詞】 增強子；啟動子；沉默子 Abstract：Tissue-specific

2、 or developmental regulator genes often have highly complex expression patterns.In addition to the promoter,many other regulatory elements mainly including enhancer and repressor are required for such gene expression.These elements may extend long distances outside the transcriptional gene or even l

3、ocate in unrelated neighboring genes.Such elements harboring sites for tissue-specific transcription factors can facilitate the differentiation and development of many tissues and organs by participating in the gene expression.Disruption of this precise mechanism can lead to disorder.Moreover,Mutati

4、ons in some regulatory elements will be associated with clinical phenotypes distinct from any identified in coding-region mutations. Key words:enhancer；promoter；silencer 迄今為止，已知超過1500種基因與遺傳性疾病的發生存在密切的關系1。除基因編碼區突變外，轉錄調控序列的異常，也可擾亂基因的正常表達，破壞基因正常功能，從而導致疾病的發生2。遠距離調控元件主要包括增強子、沉默子、隔離子等順式作用元件，這些轉錄調控序列在調控組織和

5、發育特異性基因表達中扮演著至關重要的角色3。深入探討遠距離調控元件的作用機制及其異常相關疾病的發病機理，對于該類疾病的預防、診斷和治療具有十分重要的意義。 1 遠距離調控元件 1.1 遠距離調控元件的概念 組織和發育特異性基因的表達，除啟動子、啟動子上游元件和終止子等基本調控元件外，通常還需其它類型的順式作用元件參與，這些元件主要包括加強基因轉錄的增強子；抑制轉錄的沉默子；能防止鄰近阻遏狀態的異染色質或活化狀態的常染色質向側翼擴散的隔離子4；結構更復雜且跨度更大，能克服異染色質沉默效應，促進同一位點內多個基因協調表達的位點控制區（LCR）等。和啟動子不同，上述組織和發育特異性表達基因特有的轉錄

6、調控序列通常無距離和方向限制，可位于轉錄基因的上、下游；甚至存在于遠離轉錄基因的DNA序列中5；許多還分布于與轉錄基因功能上不相關的鄰近基因內含子中6；由此稱之為遠距離調控元件（以下簡稱元件）。 1.2 遠距離調控元件的產生 元件所調控的基因主要編碼一些組織特異性轉錄因子和發育信號分子，在發育的不同階段，這些基因視機體的需要而表達，從而在細胞、組織器官的分化、形成中發揮著關鍵作用。必須指出，元件的獲得是物種在長期進化過程中，通過自然選擇而非人工方式實現的6。元件的獲得主要有兩種途徑，隨機的序列突變和基因組DNA片段插入7，基因重復后的分化3。而且，與此相關的染色體運動和重排常造成元件嵌入到鄰近

7、的其它基因內含子中，這些鄰近基因通常是一些組成性表達或者是與被調控基因功能上不相關的基因8、9。一般來講，進化過程中產生的新元件，只要能與啟動子相互作用而不干擾基因原有的表達調控體系，并能使物種保持進化上的優勢，即可在物種基因組中固定下來。另外，通過與原有的元件協同作用，新元件還可優化基因的表達，賦予物種選擇優勢。因此，元件的分布通常具有這樣的規律：距離轉錄基因相對較近的元件與基因原有的功能相關；而決定基因在新組織中表達的元件往往與其調控的基因相距較遠10。 1.3 遠距離調控元件的查找與鑒定 轉基因技術和表達組織染色質DNase I高敏感位點作圖11，是發現和鑒定元件的兩種基本方法。前者通過

8、構建增強子缺失的轉基因小鼠12、13來實現；后者則基于這樣一種認識，即轉錄活躍基因的順式作用元件對DNase 敏感，此外，若在作圖過程中發現元件靠近啟動子區域，還可進一步運用足跡法確定元件內轉錄因子結合位點。 近年來，隨著人類基因組計劃和各種模式生物測序工作的相繼完成，出現了另一種大規模簡便快速查找元件的方法序列比較法14，其依據的原理是，人類基因組中大多數已知元件在脊椎動物中具有高度的保守性。通過物種間DNA序列比較，已在不同物種基因組的非編碼區發現大量的高度保守序列，這些序列可能具有基因表達調控相關的潛在功能。因此，可將物種間序列保守性比較作為尋找未知元件的第一步，之后，再結合轉基因動物模

9、型等技術，對候選序列進行功能分析與鑒定。Loots等第一次將序列比較成功地運用于未知元件的查找，通過物種間序列比較，在細胞因子基因IL4和IL3之間發現一段保守序列，后經轉基因小鼠基因缺失研究證實，該序列為調控IL4、IL3以及與之相距更遠的IL5基因表達的增強子。目前，該方法已相對成熟，正廣泛地應用于篩查組織特異性表達基因兩側大范圍區域的調控元件。 2 遠距離調控元件的異常 目前，已知主要有三種元件異常的方式，元件DNA序列突變。染色體結構畸變導致的轉錄基因與元件分離。元件所在區域染色質結構的改變15、16。三種方式均通過干擾啟動子、轉錄基因與元件的相互作用破壞正常的基因轉錄調控。 3 遠距

10、離調控元件異常與遺傳病的關系 長期以來，由于元件與轉錄基因間位置的不確定性，給元件及其異常所致的遺傳病的鑒定帶來極大的困難。近年來，隨著以轉基因技術為代表的一批分子生物學技術的廣泛運用，迄今為止，已發現20余種元件異常相關的人類遺傳病（表1）。其中，絕大多數為調控特異性轉錄因子和發育信號分子基因的元件異常導致的先天性發育畸形。按照發病分子機理的不同，可將相關疾病劃分為如下3類： 3.1 位置效應與遺傳病 自1995年首次在果蠅中發現染色體結構畸變導致的基因轉錄異常以來，陸續在許多人類遺傳病中發現轉錄基因外染色體結構重排現象17。 Wallrath等把這類由轉錄基因外的染色體結構畸變引起的遺傳病

11、形象地描述為位置效應遺傳病17。這些疾病的共同特征是致病基因雖已明確，但在患者中檢測不到致病基因的突變，而與疾病表型相關的染色體結構畸變則發生在致病基因之外。隨后，國外學者利用轉基因小鼠模型對位置效應疾病的發病機理進行了深入地研究，結果表明染色體結構畸變（如缺失、易位、倒位）導致元件破壞或與轉錄基因分離，從而使其調控的組織和發育特異性基因表達異常，是該類遺傳病發生的根本原因18。由于染色體結構畸變很容易借助細胞學方法觀察到，而且許多相關的遺傳病，其臨床表型又與相應致病基因編碼區突變導致的臨床癥狀相似，故位置效應遺傳病是發現最早、最多，也是最容易發現的一類遠距離調控元件異常相關的遺傳病。必須指出

12、，盡管目前已知的大多數位置效應遺傳病的臨床癥狀與相應基因編碼區突變相似，但仍有部分位置效應遺傳病的臨床表型完全不同于編碼區突變。下面以無鞏膜（MIM106210）和肢體內側多趾癥（MIM 174500）為例分別加以說明。 無鞏膜是由PAX6基因表達量缺乏引起的遺傳性眼病。致病基因定位于11p13，編碼一種特異性轉錄因子。然而，在一些患者基因組中檢測不到PAX6基因突變；卻發現PAX6基因下游存在染色體結構重排；其中，最遠的染色體斷裂點與PAX6基因相距達125kb。進一步的研究顯示，這些斷裂點全部位于組成型表達的ELP4基因最后3個內含子中，但ELP4基因缺陷卻不足以引起該病的發生9。用低濃度

13、DNA酶處理PAX6基因表達組織染色質，發現距斷裂點下游不遠的ELP4基因其它內含子中存在DNase 高敏感位點。用人工酵母染色體（YAC）構建轉基因小鼠模型，結果顯示，覆蓋了上述DNase 高敏感位點的YAC，使無編碼區突變的患病雜合子小鼠的子代表型恢復正常；相反，未涵蓋DNase I高敏感位點的YAC則無此作用，提示這些DNase 高敏感位點位于組織特異性增強子中11。若用人、鼠的體細胞進行雜交，則PAX6基因表達于保留有完整人類11號染色體的雜種細胞中；而在有患者 11號染色體的雜種細胞中卻不表達；因為患者細胞11號染色體雖有完整的PAX6基因，但缺失了下游增強子18，以上結果充分表明，

14、在ELP4基因內含子中存在調控PAX6基因表達的增強子，正是由于這些增強子在染色體重排過程中丟失或易位，引起PAX6基因在患者病灶組織中表達不足，從而導致與 PAX6基因編碼區突變相同的臨床表型。前面提及，有些元件異常相關疾病的表型明顯不同于相應基因編碼區的突變，這是由于遠距離調控元件的破壞引起基因表達異常僅影響到部分表達組織的緣故。肢體內側多趾癥（PPD）是人類較常見的遺傳性畸形，其致病基因SHH編碼一種信號轉導蛋白，在肢體前后樞軸形成中發揮著關鍵作用。轉基因突變小鼠-Ssq為PPD提供了很好的研究材料。Ssq小鼠SHH基因上游1Mb的LMBR1基因第5個內含子中有一段插入的DNA片段，純合

15、子Ssq小鼠的癥狀較雜合子嚴重的多，也未發現其它轉基因小鼠表現出PPD癥狀。提示該片段的插入是導致PPD的原因。正常情況下，SHH基因僅在小鼠新生肢體后部表達，但Ssq小鼠新生肢體前端和后部均發現有SHH基因表達8，SHH基因在Ssq小鼠的異位表達不僅可以解釋PPD產生的原因，并且提示插入片段破壞了SHH基因在新生肢體中正確表達。通過序列比較，在Ssq小鼠插入位點周圍發現保守序列，轉基因研究證實，該保守序列為調控SHH基因在小鼠新生肢體后部表達的組織特異性增強子12。此外，保守序列破壞引起SHH基因在Ssq小鼠新生肢體前端的表達，可以推測，該保守序列可能還含有抑制SHH基因在新生肢體前端表達的

16、沉默子。 3.2 染色質構象改變與遺傳病 元件所在的染色質空間結構改變，也可引起相關基因的異常表達，導致遺傳病的發生。目前，已知的該類遺傳病不多，一種常染色體顯性遺傳的神經肌肉性疾病-FSHD（MIM158900）是其典型。FSHD發生與4q35末端的一段串聯重復序列完全或部分缺失有關。該序列的重復單元稱為D4Z4，正常人有11150個D4Z4拷貝，而受累個體其中一條染色體的拷貝數小于或等于10。一般來講，患者D4Z4拷貝數越少，病情越嚴重，發病年齡也越早。研究表明，D4Z4重復區無結構基因存在，因此，普遍認為FSHD是由D4Z4重復序列缺失導致元件破壞引起。最新的研究表明，低拷貝的D4Z4重

17、復序列可形成一個環狀結構，該環直接與4q35區域的基因相互作用，導致這些基因在不恰當的時間和組織表達19，因此，可以認為FSHD是由4號染色體長臂末端染色質上，轉錄因子間或調控染色質結構的蛋白間不作用所致。 地中海貧血主要由一個或幾個-和-珠蛋白基因突變、缺失或-珠蛋白基因LCR缺失引起。人類-珠蛋白基因簇位于16q13，每條染色體上均有兩個 -珠蛋白基因（HBA1和HBA2）。-珠蛋白基因表達受其上游的HS-40區的控制。正常情況下，以4個-珠蛋白基因為模板進行轉錄。 Tufarelli等16發現一患病家系，受累成員的一條4號染色體均有一包括HBA1基因在內的片段缺失，但缺失染色體保留了完整

18、的HBA2基因和 HS-40區。病情程度提示，缺失染色體上HBA2基因表達同樣受到影響。隨后發現，患者體內所有組織都有一個涵蓋HBA2 CpG島的2kb區域被甲基化。正常情況下，即使非表達組織中的HBA2 CpG島也總保持非甲基化狀態。進一步研究表明，這種HBA2啟動子的沉默，和甲基化與鄰近的LUC7L基因轉錄的反義RNA有密切的關系。除HBA1基因外，上述缺失片段還涵蓋了LUC7L基因最后3個外顯子及其加尾信號區，致使LUC7L基因轉錄延伸至HBA2基因及其啟動子中。LUC7L基因轉錄異常，導致HBA2啟動子的沉默和甲基化僅存在于缺失染色體中，提示這種沉默和甲基化是通過順式作用機制實現的。上

19、述病例為人們展示了一種完全不同的突變機制，這種基因突變導致鄰近基因表達關閉，雖未涉及元件的破壞，但對基因分布密集的染色質區域而言，它代表了一種疾病發生的機制。 3.3 元件突變與遺傳病 事實上，元件的點突變或微缺失，也可引起基因表達組織特異性的獲得或丟失而導致疾病的發生，甚至出現臨床表型與基因編碼區突變完全不同的疾病。與位置效應疾病不同，這類調控序列改變引起的遺傳病沒有明顯的染色體結構的變化，對其發病機理的認識主要通過轉基因小鼠模型12，或對候選基因側翼區精細作圖和序列分析13獲得。由于元件鑒定及其異常的檢出難度很大，因此，盡管潛在的相關疾病甚多，但當前實際得到闡明的病種并不多。例如，人類SH

20、H基因上游1Mb的位置存在一種稱為ZRS的元件，該元件具有促進SHH基因在肢體前端表達，限制在肢體后部表達的雙重調控功能。通過對部分肢體內側多趾癥（PPD）患者的ZRS進行測序，在患者中已發現ZRS多種類型的點突變。 表1 轉錄調控異常相關的人類疾病 Table 1 Human Disease caused by aberrant transcriptional controlGeneGene FunctionDiseaseFurthest Distance of Breakpoint(kb)3or 5of TFPAX6TFAniridia1253TWISTTFSaethre-Chotzen

21、Saethre-Chotzen syndrome2603POU3F4TFX-linked deafness9005PITX2TFRieger syndrome905GLI3TFGreig syndrome103MAFTFgenetic Cataract10005FOXC1TFGlaucoma/autosomal dominant iridogoniodysgenesis25/12005FOXC2TFLymphedema distichiasis1203SRYTFSex reversal35/3SIX3TFHoloprosencephaly(HPE2) 2005SHHSignalingHolop

22、rosencephaly(HPE3)2655SHHSignalingPreaxial polydactyly10005SHFM1TFSplit-hand/split-foot malformation4505/3FSHDunknownFacioscapulohumeral dystrophy1003HBBOxygen carrier-Thalassemia505HBAOxygen carrier-Thalassemia183HoxdTFMesomelic dysplasia and vertebral defects603 TF：transcription factor 4 小結與展望 多數情況下，遺傳病由基因編碼區突變所致，但調控區突變也可干擾正常的轉錄過程，導致疾病發生。雖然染色體結構重排引起的位置效應遺傳病，是最容易發現的一類遠距離調控元件異常疾病，然而，有時要弄清元件的破壞究竟影響到何種基因的表達也是十分困難的，因為被破壞的元件可能完全位于某個基因內，但卻影響另一個基因的表達。此外，元件異常導致的疾病表型，可能與相應致病基因編碼區突變產生的臨床癥狀完全不同。更為艱巨的是檢出元件內小缺失和點突變，有時，在距轉錄基因很遠位置上僅僅一個堿基置換突變，都