1、實驗八實驗八 熒光分光光度法熒光分光光度法測定諾氟沙星片的含量測定諾氟沙星片的含量 儀器名稱儀器名稱熒光分光光度計熒光分光光度計國別廠家：日本島津公司國別廠家：日本島津公司 儀器型號：儀器型號：RF-5301PC一一 概述概述 什么是熒光呢？當紫外光照射到某些物質的時候，什么是熒光呢？當紫外光照射到某些物質的時候，這些物質會發射出各種顏色和不同強度的可見這些物質會發射出各種顏色和不同強度的可見光光，而當紫外光停止照射時，這種光線也隨之很快地消而當紫外光停止照射時，這種光線也隨之很快地消失，這種光線稱為熒光。第一次發現熒光現象失，這種光線稱為熒光。第一次發現熒光現象的是的是1616世紀西班牙的內

2、科醫生和植物學家世紀西班牙的內科醫生和植物學家N.MonardesN.Monardes, ,提提出到在含有一種稱為出到在含有一種稱為“Lignum NephriticumLignum Nephriticum”的木的木頭切片的水溶液中，呈現了極為可愛的天藍色。頭切片的水溶液中，呈現了極為可愛的天藍色。 直到直到18521852年年StokesStokes在考察奎寧和葉綠素的在考察奎寧和葉綠素的熒光時，用分光計觀察到其熒光的波長比熒光時，用分光計觀察到其熒光的波長比入射光的波長稍長些，才判明這種現象是入射光的波長稍長些，才判明這種現象是這些物質在吸收光能后重新發射不同波長這些物質在吸收光能后重新發

3、射不同波長的光，而不是由光的漫射作用所引起的，的光，而不是由光的漫射作用所引起的，從而導入了熒光是光發射的概念。到從而導入了熒光是光發射的概念。到1919世世紀末人們已經知道了包括熒光素、曙紅、紀末人們已經知道了包括熒光素、曙紅、多環芳烴等多環芳烴等600600種以上的熒光物質。種以上的熒光物質。 20 20世紀以來，熒光現象被研究得更多了，世紀以來，熒光現象被研究得更多了，發現了共振熒光、增感熒光，能夠進行熒光產發現了共振熒光、增感熒光，能夠進行熒光產率得絕對測定，還進行了熒光壽命的直接測定率得絕對測定，還進行了熒光壽命的直接測定等等。等等。 熒光分析方法的發展，與儀器應用是分不熒光分析方法

4、的發展，與儀器應用是分不開的。開的。1919世紀以前，熒光的觀察是靠肉眼進行世紀以前，熒光的觀察是靠肉眼進行的，直到的，直到19281928年，才由年，才由JetteJette 和和WestWest提出了第提出了第一臺光電熒光計。一臺光電熒光計。19481948年由年由StuderStuder推出了第一推出了第一臺自動光譜校正裝置，到臺自動光譜校正裝置，到19521952年才出現商品化年才出現商品化的校正光譜儀器。的校正光譜儀器。 近幾十年來，在其它學科迅速發展的影響近幾十年來，在其它學科迅速發展的影響下，隨著激光、微處理機和電子學的新成就等下，隨著激光、微處理機和電子學的新成就等一些新的科學

5、技術的引入，大大推動了熒光分一些新的科學技術的引入，大大推動了熒光分析方法在理論方面的進展，并且相應地加速了析方法在理論方面的進展，并且相應地加速了各式各樣新型熒光分析儀器的問世，使熒光分各式各樣新型熒光分析儀器的問世，使熒光分析法不斷朝著高效、痕量、微觀和自動化的方析法不斷朝著高效、痕量、微觀和自動化的方向發展，方法的靈敏度、準確度和選擇性日益向發展，方法的靈敏度、準確度和選擇性日益提高，方法的應用范圍很寬，包括工業、農業、提高，方法的應用范圍很寬，包括工業、農業、醫藥衛生、環境保護、公安情報和科學研究等醫藥衛生、環境保護、公安情報和科學研究等各個領域中。如今，熒光分析法已發展為一種各個領域

6、中。如今，熒光分析法已發展為一種重要且有效的光譜化學分析手段。重要且有效的光譜化學分析手段。工作工作原理原理熒光分光光度計基本結構和原理圖熒光分光光度計基本結構和原理圖 由光源氙弧燈發出的光通過切光器使其變成由光源氙弧燈發出的光通過切光器使其變成斷續之光以及激發光單色器變成單色光后，此光斷續之光以及激發光單色器變成單色光后，此光即為熒光物質的激發光，被測的熒光物質在激發即為熒光物質的激發光，被測的熒光物質在激發光照射下所發出的熒光，經過單色器變成單色熒光照射下所發出的熒光，經過單色器變成單色熒光后照射于測樣品用的光電倍增管上，由其所發光后照射于測樣品用的光電倍增管上，由其所發生的光電流經過放大

7、器放大輸至記錄儀，激發光生的光電流經過放大器放大輸至記錄儀，激發光單色器和熒光單色器的光柵均由電動機帶動的凸單色器和熒光單色器的光柵均由電動機帶動的凸輪所控制，當測繪熒光發射光譜時，輪所控制，當測繪熒光發射光譜時， 將激發光單色器的光柵，固定在最適當的將激發光單色器的光柵，固定在最適當的激發光波長處，而讓熒光單色器凸輪轉動，激發光波長處，而讓熒光單色器凸輪轉動，將各波長的熒光強度訊號輸出至記錄儀上，將各波長的熒光強度訊號輸出至記錄儀上，所記錄的光譜即發射光譜（所記錄的光譜即發射光譜（emission emission spectrumspectrum）, ,簡稱熒光光譜。簡稱熒光光譜。 當測繪

8、熒光激發光譜時，將熒光單色當測繪熒光激發光譜時，將熒光單色器的光柵固定在最適當的熒光波長處，只器的光柵固定在最適當的熒光波長處，只讓激發光單色口的凸輪轉動，將各波長的讓激發光單色口的凸輪轉動，將各波長的激發光的強度訊號輸出至記錄儀，所記錄激發光的強度訊號輸出至記錄儀，所記錄的光譜即激發光譜的光譜即激發光譜(excitation (excitation spectrumspectrum）。）。 下圖為諾氟沙星的激發光譜下圖為諾氟沙星的激發光譜(A)和發射光譜和發射光譜(B) 當進行樣品溶液的定量分析時，將激當進行樣品溶液的定量分析時，將激發光單色器固定在所選擇的激發光波長處，發光單色器固定在所選

9、擇的激發光波長處，將熒光單色器固定至所選擇的熒光波長處，將熒光單色器固定至所選擇的熒光波長處，由記錄儀得出的信號是樣品溶液的熒光強由記錄儀得出的信號是樣品溶液的熒光強度。度。一、實驗目的一、實驗目的1 1、掌握熒光光度法的基本原理；、掌握熒光光度法的基本原理；2 2、了解熒光分光光度計的基本操作。、了解熒光分光光度計的基本操作。二、實驗原理二、實驗原理 按照受激方法的不同，分子發光可分按照受激方法的不同，分子發光可分為不同類型。如果分子因吸收外來輻射的為不同類型。如果分子因吸收外來輻射的光子能量而被激發，所產生的發光現象稱光子能量而被激發，所產生的發光現象稱為光致發光；如果分子的激發能量是由反

10、為光致發光；如果分子的激發能量是由反應的化學能或由生物體釋放出的能量所提應的化學能或由生物體釋放出的能量所提供，其發光現象分別稱為化學發光和生物供，其發光現象分別稱為化學發光和生物發光。發光。 通俗地講，當紫外光或可見光照射某些物通俗地講，當紫外光或可見光照射某些物質時，這些物質會發射出各種顏色和不同質時，這些物質會發射出各種顏色和不同強度的波長更長的可見光，而當紫外光停強度的波長更長的可見光，而當紫外光停止照射時，這種光線也隨之很快地消失，止照射時，這種光線也隨之很快地消失，這種光線稱為熒光。按分子激發態的類型這種光線稱為熒光。按分子激發態的類型來劃分時，由第一電子激發單重態的產生來劃分時，

11、由第一電子激發單重態的產生的輻射躍遷而伴隨的發光現象稱為熒光，的輻射躍遷而伴隨的發光現象稱為熒光，而由最低的電子激發三重態所產生的輻射而由最低的電子激發三重態所產生的輻射躍遷，其發光現象稱為磷光，如圖所示。躍遷，其發光現象稱為磷光，如圖所示。 熒光是物質在吸光之后發射出的波長熒光是物質在吸光之后發射出的波長較長的輻射，因此，溶液的熒光強度較長的輻射，因此，溶液的熒光強度(F)(F)與該溶液的吸光程度及溶液中熒光物質的與該溶液的吸光程度及溶液中熒光物質的熒光量子產率有關。熒光定量分析基于下熒光量子產率有關。熒光定量分析基于下式公式：式公式： F=2.303IF=2.303IO ObC=kCbC=

12、kC式中式中:F:F為熒光強度為熒光強度, I, Io o為入射光強度，為入射光強度，為物質的熒光量子產率，為物質的熒光量子產率，為摩爾吸光系為摩爾吸光系數，數，b b為光程，為光程，C C為熒光物質的濃度。以為熒光物質的濃度。以F-F-C C或或logF-logClogF-logC作圖，即得標準曲線。樣品作圖，即得標準曲線。樣品測其測其F F值后，根據標準曲線查得相應濃度，值后，根據標準曲線查得相應濃度，即可計算出含量。即可計算出含量。三、試劑三、試劑1.1.諾氟沙星標準溶液的配制諾氟沙星標準溶液的配制2.2.各種不同各種不同pHpH緩沖溶液的配制緩沖溶液的配制 四、實驗步驟四、實驗步驟1 1、掃描諾氟沙星的激發光譜和發射光譜、掃描諾氟沙星的激發光譜和發射光譜2 2、酸度對諾氟沙星熒光強度影響、酸度對諾氟沙星熒光強度影響的測定的測定3 3、諾氟沙星標準曲線的測定、諾氟沙星標準曲線的測定4 4、諾氟沙星藥片的測定、諾氟沙星藥片的測定五、數據處理五、數據處理 1.1.以以F