1、葡萄酒的釀造及其中酵母菌對發酵過程的影響實驗設計方案一、前言：葡萄酒是用新鮮的葡萄或葡萄汁經發酵釀成的酒精飲料。通常分紅葡萄酒和白葡萄酒兩種。前者是紅葡萄帶皮浸漬發酵而成；后者是葡萄汁發酵而成的。我們所要釀造的是紅葡萄酒。葡萄酒有增進食欲，滋補作用的作用。葡萄酒中含有糖、氨基酸、維生素、礦物質。這些都是人體必不可少的營養素。它可以不經過預先消化，直接被人體吸收。非凡是對體弱者，經常飲用適量葡萄酒，對恢復 -健康有利。同時還有助于消化，葡萄酒能刺激胃酸分泌胃液，每60-100克葡萄酒能使胃液分泌增加120 毫升。自釀的葡萄酒，不用添加發酵劑，也不添加任何防腐劑和澄清劑。家釀的葡萄酒利用葡萄皮上的

2、野生酵母菌分解葡萄中的糖份轉化為酒精，另加點糖提高酒精度。一般保質期不超過兩年，所以成酒后應在兩年內喝光。二、實驗目的：1、熟悉釀造葡萄酒的過程和原理。2、學會葡萄酒中酵母菌的分離純化。3、熟悉酵母菌形態觀察和菌落計數法4、對比來說明，酵母菌對葡萄酒發酵的影響，殺菌劑(SO2)對發酵過程的影響。三、材料和儀器：（一）材料： 葡萄3 斤（因葡萄還未上市，可用提子代替，蘇果超市有，但比較貴）。白糖半斤（二）儀器： 1、主發酵器：玻璃罐（壇、瓶）、陶瓷壇、能耐受酒精又對人無害的塑料瓶罐等均可。2、二次發酵容器及裝酒的容器：可以用空酒瓶、飲料瓶、礦泉水瓶等都可3、一根細塑料管。用來在發酵完成后利用虹吸

3、法將葡萄酒從發酵容器中倒出。4、木棒或筷子。用來在發酵過程中攪拌葡萄皮和葡萄汁。5、絲襪或細紗布。用來過濾葡萄酒汁。四、實驗步驟：（一）葡萄酒的釀造1、清洗：將主發酵器（即玻璃壇等）充分洗干凈，控干。2、浸泡：將葡萄摘除蒂，把剪好的葡萄沖洗干凈后用淡鹽水浸泡十分鐘左右，這是為了去掉葡萄皮上的農藥和其他有害物質，再次沖洗，晾干至表面沒有水珠。3、裝瓶：將葡萄捏破，葡萄肉連同葡萄皮擠到主發酵器中。當把葡萄裝到發酵器容量的70%左右時， 停止裝葡萄，蓋上蓋子，但不要完全擰緊。14、發酵：將裝好葡萄的發酵器放在28恒溫培養箱內。葡萄裝入發酵器后，大約會在12 個小時以內啟動發酵，表現為葡萄汁中有較多氣

4、泡產生。在發酵啟動后，每天兩次用木棒或筷子將葡萄皮壓入酒液中，然后蓋上蓋子。5、加糖：發酵啟動后一到兩天內，放入250g 白糖，作用是提高酒精度。發酵啟動后三到四天時，再次放入白糖250g ，將糖浸入葡萄汁中攪拌均勻。6、二次發酵：當酒精發酵完成后，首先利用虹吸法，將葡萄酒汁倒入二次發酵器，然后將剩下的葡萄皮、籽、糟等用絲襪或細紗布過濾，過濾后的酒液也混入二次發酵器中。葡萄皮、籽、糟扔掉。注意二次發酵器留有1/10 空隙，蓋子也不要擰的很緊。放在陰涼處。二次發酵主要是蘋果酸-乳酸發酵，不再產生酒精。7、加入澄清劑，加入少量酒精。二次發酵完成，即得到葡萄酒原酒。8、口味：自釀出的葡萄酒是酸的,還

5、有一些的刺激性味。附：葡萄酒的質量檢測葡萄酒的質量指標是現行國家標準GB/T15037-94 中規定的檢驗指標； 色澤：紫紅、深紅、寶石紅、紅微帶棕色澄清程度：澄清透明、有光澤、無明顯懸浮物（使用軟木塞封口的酒允許有3 個以下不大于1mm 的軟木渣）。葡萄酒應是澄清的，若酵母菌生長，則會出現渾濁，所以要檢測出我們自釀的葡萄酒中酵母菌的含量是否合格。香氣：具有純正、優雅、怡悅、和諧的果香甜味：具有純凈、幽雅、爽怡的口味和新鮮（二）酵母菌的分離純化1、制備葡萄酒稀釋液取發酵 2-3 天時的葡萄酒液，稱量1g 于盛有 99mL 無菌水的三角瓶中，充分振蕩，此即為10-2 濃度的菌懸液。用無菌移液管吸

6、取懸液0.5mL 于 4.5mL 無菌水試管中，用移液管吹吸三次，搖勻，此即為10-3 濃度。同樣方法，依次稀釋到10-7。稀釋過程需在無菌室或無菌操作條件下進行。（稀釋倍數是根據微生物 的數量進行選擇，不固定。可以直接涂布、或劃線法分離純化。）2、涂布法分離（酵母菌定量分離用）依前法向無菌培養皿中傾倒已融化并冷卻至4550的馬鈴薯葡萄糖培養基，待平板冷凝后，用無菌移液管分別吸取三個不同稀釋度（10-4,10-5,10-6 ）菌懸液0.1mL-0.2 ，依次滴加于相應編號已制備好的馬鈴薯葡萄糖培養基平板上，右手持無菌玻璃涂棒，左手拿培養皿，并用拇指將皿蓋打開一縫，在火焰旁右手持玻璃涂棒于培養皿

7、平板表面將菌液自平板中央均勻向四周涂布擴散，切忌用力過猛將菌液直接推向平板邊緣或將培養基劃破。3 培養觀察接種后的所有平板倒置與適宜溫度培養箱中培養。大約 28-30 度，時間兩到三天。 將葡萄分為兩組發酵，一組為空白對照，另一組加入提取出的酵母菌，觀察其在發酵過程中酵母菌的生長對葡萄酒發酵時間的影響。4、酵母菌形態觀察2將每個發酵階段的葡萄汁用顯微鏡觀察其中酵母菌的菌體特征（三）酵母菌的檢測利用血球計數法測定材料與儀器：葡萄酒汁，血球計數板，顯微鏡，蓋玻片，無菌毛細管。操作步驟：1、鏡檢計數室在加樣前，先對計數板的計數室進行鏡檢。若有污物，則需清洗后才能進行計數。2、加樣品將清潔干燥的血球計

8、數板蓋上蓋玻片，再用無菌的細口滴管將稀釋的葡萄酒汁由蓋玻片邊緣滴一小滴（不宜過多） ，讓菌液沿縫隙靠毛細滲透作用自行進入計數室，一般計數室均能充滿菌液。注意不可有氣泡產生。3. 顯微鏡計數靜止 5 分鐘后，將血球計數板置于顯微鏡載物臺上，先用低倍鏡找到計數室所在位置，然后換成高倍鏡進行計數。在計數前若發現菌液太濃或太稀，需重新調節稀釋度后再計數。一般樣品稀釋度要求每小格內約有 510 個菌體為宜。每個計數室選5 個中格（可選4 個角和中央的中格）中的菌體進行計數。位于格線上的菌體一般只數上方和右邊線上的。如遇酵母出芽，芽體大小達到母細胞的一半時，即作兩個菌體計數。計數一個樣品要從兩個計數室中計

9、得的值來計算樣品的含菌量。4. 清洗血球計數板使用完畢后，將血球計數板在水籠頭上用水柱沖洗，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹風機吹干。鏡檢，觀察每小格內是否有殘留菌體或其他沉淀物。若不干凈，則必須重復洗滌至干凈為止。次數各中格中細胞數平均菌液濃度/( 個/ml ）1234512345實驗結果：注意事項：1、各類容器一定要洗干凈，葡萄在釀制過程中不能碰到油污、鐵器、銅器、錫器等，但可以接觸干凈的不繡鋼制品。2、在發酵時，發酵器的蓋子一定不要蓋死，防止爆炸。3、糖不要多放，那樣會影響發酵過程，產生我們不希望的成分，如果想喝甜葡萄酒，可以在發酵完成后飲用時加糖。3五、具體操作過程和實驗現象及分析

10、（一）第一次發酵：葡萄的清洗，捏碎，裝罐，加蓋（稍微透氧）做成兩個瓶葡萄酒，一瓶對照（加入分離純化后的酵母菌），一瓶空白。將兩個發酵罐放在28 恒溫培養箱中發酵。注意不要太用力搓洗葡萄，以防把葡萄皮上的野生酵母菌洗掉。每天都到實驗室里，將浮在上面的葡萄按下去，以便皮上的酵母菌得到充分的利用。加糖：第一次加糖發酵兩天后，第二次發酵五天后。每次每瓶加75 克糖。（二）第一次培養和觀察： （ 1-3 天）實驗準備：制備PDA 培養基，滅菌，低溫保存；培養皿滅菌，制備無菌水并保存。1、據實驗方案， 12 小時后酒精發酵啟動，所以1 天后，我們提取了適量葡萄汁，進行酵母菌的分離培養。取 0.5ml 的葡

11、萄汁， 梯度稀釋成10-1，10-210-6，采用平板涂布的方法，進行第一次培養。取 10-4,10-510-6 的三個梯度的稀釋菌液進行涂布接種，每個梯度三個培養皿。涂布完成后，放入28恒溫培養箱倒置培養，一到兩天。2、葡萄汁的制片觀察：取適量葡萄汁和無菌水混合，再附上載玻片，置于十倍鏡下觀察現象：由于葡萄汁成分非常多，所以鏡頭里背景很模糊，而且，只能觀察到很少的類似于酵母菌的單個細胞，放置于40 倍鏡下，觀察也不是很清楚，其他大多是雜菌和雜物在亂跑。（分析，發酵未真正啟動， 葡萄皮上的酵母菌，還未在葡萄汁中大量繁殖，所以是視野里的現象模糊，酵母菌很少）3、葡萄酒的觀察現象從之前強烈的果香味

12、轉變為有淡淡的酒香味，而且 3-4 天時，發酵罐中有大量的氣泡，葡萄皮顏色變暗， 葡萄汁增多，且顏色更深。葡萄酒中的酵母菌的觀察，此時，由于，酵母菌的大量繁殖，在顯微鏡的視野里已經能，觀察到很清晰的酵母菌個體，而且數量較多，圖像背景亮了很多，（可能是酵母菌的生長抑制了其他雜菌的生長，是的葡萄之中的雜質變得很少了。）4、三天后，去取培養好的九個培養基，觀察其中菌落的生長情況現象：實驗結果似乎沒有那么理想，培養基中的菌落，可謂五彩繽紛，有白色的菌落，有黃色的粉狀的菌落，有綠色的干燥的菌落，最多的就是黑色霉菌的菌落，散發出來的味道更偏于霉菌的味道，而且， 大多的菌落干燥，且成絨毛絲狀。顯微鏡觀察：盡

13、量挑取一些，純凈的白色菌落的菌種，和無菌水混合置于顯微鏡下觀察，發現，菌種不純，有一些清晰可見的酵母菌細胞，但也參雜著一些霉菌的特征結構。結果處理方案：挑取一些疑似的白色菌種，進行涂布培養，方法同上，培養1-2 天。同時，也要再做一個備份，萬一，白色的菌落不是酵母菌，所以，再取此時的葡萄汁，再做六個培養基，進行培養，原理同上。（三）第二次培養觀察： （ 4-5 天）葡萄酒里發酵現象的觀察：葡萄酒里產生了濃郁的酒精味到，而且葡萄酒里有很多泡沫。4疑似菌落的觀察：觀察上次疑似菌種培養基的培養結果，發現效果還是不佳，雖然有很少的的黑色霉菌生長，但是通過顯微鏡觀察，發現，它應該是霉菌的一種，而不是酵母

14、菌備份培養基的觀察：有意外的收獲，發現，備份的六個培養基，酵母菌生長的都很好，有很多的乳白色的圓形斑點，濕潤且光滑，聞起來有酒香味，且沒有其他的雜菌，很符合，酵母菌的菌落培養特征。且通過顯微鏡的觀察，觀察到了很清晰的酵母菌細胞。對比分析：第一次培養的失敗的原因：1、可能是剛一開始，葡萄汁中的酵母菌很少，而稀釋的倍數太大，導致涂布培養時，其他雜菌的數量優勢甚于酵母菌，所以才會出現那樣的結果。2、也有可能在超凈工作臺進行涂布操作時，沒有嚴格做到無菌，培養基被污染。3、而備份成功的緣由是3-4 天時，酵母菌生長旺盛，抑制了其他雜菌的生長，使得生長出來的菌落， 很純凈。（四）第三次培養觀察： （ 6-

15、7 天）準備工作： PDA 培養基的制備，麥芽汁培養基的制備，培養皿的滅菌。將備份培養基中長出的酵母菌，進行涂布接種，在10-4、10-5、10-6 三個稀釋度，每組做四個培養基（兩個 PDA ，兩個麥芽汁） ，做好后放入28 度恒溫的培養箱內進行培養。觀察：兩天后取出觀察，PDA培養基上菌落長勢良好，10-4 的兩個培養基上菌落數過多，無法計數，而 10-5、10-6 的培養基上，菌落分布均勻，可以計數。可能是由于涂布不均勻的問題，麥芽汁培養基上菌落，太過集中，沒有PDA 上生長的好。由于時間的有限，我們將此組培養基的菌種接種到對照的葡萄酒中。由于7 天左右已經是酒精發酵的后期，我們發現在空白的葡萄酒中，已經幾乎看不到氣泡，而在對照的試驗中，我們發現還有很多的泡沫，而且酒精味更濃。（五）第二次發酵8-9 天后，過濾進行第二次發酵，發現葡萄果肉大部分已變為酒，發酵基本完成，過濾出的葡萄酒，顏色呈暗紫色，而且很渾濁。葡萄酒放入到第二次發酵罐中進行二次發酵。二次