1、傳代細胞制備流感病毒疫苗工藝研究進展，呂宏亮I,付秀花'，鄭明2(1.乾元浩生物股份有限公司，北京】00081；2.中國獸醫藥品監察所，北京100081)收稿日期2009-05-05文獻標識碼A文章編號1002-1280(2009)06-0043-06中圖分類號S859.797摘要目前人及動物用流行性感冒病毒疫苗(流感疫苗)的生產大多采用雞胚。這種傳統的方法勞動強度大，雞胚用量大，需要繁瑣的純化工藝去除雞胚蛋白減少過敏反應，流感的大流行性以及新發流感的流行迫切需要一種新的疫苗生產方法：用哺乳動物細胞生產疫苗。細胞生產流感疫苗經過研究和發展，從可用于生產的Vero、MDCK、PER-C6

2、細胞的生物學鑒定、分析到流感病毒的重配、適用、培養以及下游工藝的懸浮培養、濃縮、純化、安全以及效果觀察都取得長足進展。本文從細胞流感疫苗的細胞基質、病毒適用、重配、培養、濃縮、純化及其疫苗的安全、效果觀察方面綜述了細胞流感疫苗的研發重點。關鍵詞傳代細胞；流感疫苗；研究進展AdvanceinCellDerivedInfluenzaVirusVaccineProcessDevelopmentLUHong-liang1,FUXiu一hua1,ZHENGMing2(1.QianyuanhaoBiologicalCo.,Ltd,Beijing100081；2.ChinaInstituteofVeteri

3、naryDrugControl,Beijing100081China)Abstract:Thisarticlediscussedthemammaliancelllineusedtogrowinfluenzavirusadaptedcultivation,aswellasdownstreamprocessdevelopment,suspensioncultivation,concentration,purificationforinfluenzavaccines.Influenzavirusesforproductionwerepresentlyproducedinembryonatedhen&

4、#39;seggs.Thisconventionalstandardmethodologywasextremelycumbersome;itrequiredmillionsofeggsandanextensivepuriGcationtoreducetheamountofcontaminatingeggproteinsandtominimisetheriskofallergiesagainsteggalbumin.Theshortageofeggsinapandemicsituation,theselectionofegg-adaptedvariantsandthepresenceofadve

5、ntitiousviruseshasemphasisedthenecessityforproductionofinfluenzavaccinesonawellcharacterisedstablemammaliancellline.Mammaliancell-derivedvaccines,producedinnontumorigeniccelllines,havebeendevelopedandshowntobeeffectiveproductionsystemsasalternativestoeggs.EstablishedVero,MDCK,PER-C6technologyhasbeen

6、successfullyadaptedtoisolation,reassortantviruswithreversegeneticstogeneratehighgrowthvirusstrainaswellastolargescaleproductionofahugevarietyofinfluenzavirusstrains.TTieproductionin11200literfermenterculturesunderserumfreeconditionsgaveantigenyieldscomparabletotheconventionalembryonatedeggtechnology

7、.ThedevelopmentofarapidandefficientpuriGcationschemeresultedinasafehighpurityvaccinewhichwasatleastasimmunogenicasconventionalegg一derivedvaccinesinamousemodel.Clinicaltrialsindifferentregiondemonstratedthatthecell一derivedinfluenzavaccinewaswelltolerated,safeandhighlyimmunogenicinhumans.Keywords：cell

8、line；influenzavirusvaccine；researchprogress作者簡介：呂宏亮（1%6年-），博士，主要從事病逐性疫苗研究和生產。E-mail：hongliangnvsi人和動物的流感總是不斷地危及人和動物的健康以致生命安全,造成嚴更的社會影響和經濟損失。近年來禽流感不僅在一些國家和地區流行，給養禽業帶來重大的損失，而且禽流感病毒感染人并致人發病和死亡。特別是最近源自墨西哥的新流感毒株引起的人甲型H1N1流感在不長的時間里已波及世界達74個國家和地區，發病人數超過二萬人,其中死亡一百多人;在加拿大還出現該新流感毒株由人傳至豬群并致其發病的病例。一些流感病毒打破了感染宿主

9、的種屬界限，應引起我們高度的警惕,并做出相應的對策。接種人和動物流行性感冒病毒疫苗(流感疫苗)是預防流感、控制人和動物流感大流行、預防動物流感感染人或人流感感染動物的最經濟旦行之有效的方法。傳統的制備流感疫苗的方法需采用雞胚,培養周期過長，不得不對數百萬個雞胚逐一進行接種和收獲，生產過程很難實現全程自動化，勞動強度大，時間消耗多，不易于質量控制和保證，有時病毒不能在雞胚上復制，產量低。如果要保證雞胚的供應，疫苗生產前6個月就要做好詳細的安排。雞胚存在潛在污染的可能，且雞胚培養的流感病毒經過連續傳代后常常引起變異,使所制備的流感疫苗抗原性與人群(或畜禽群)中的流感毒株不能完全匹配。雞胚尿囊液中雜

10、質比較多,使疫苗生產后期的濃縮難度(容易堵塞)增加，雞胚還可能因存在潛在病毒的污染而降低敏感性。只有那些經過認證的養雞場才可以提供無抗體、無潛在致病因子污染的SPF雞胚。另外，在禽流感高發期，可能會因為雞的大量感染死亡而缺乏制備疫苗的原料，旦此時如果仍使用雞胚生產流感疫苗,則存在著極大的安全隱患。因此,WHO建議使用哺乳動物細胞培養流感病毒來替代雞胚制備流感疫苗，使其抗原性更接近自然流行株，還可減少宿主蛋白成分,降低接種對象的變態反應，如牛腎傳代細胞(Madin_Darbycaninekidney,MDCK)、非洲綠猴腎細胞(Africangreenmonkeykidneycell,Vero)

11、或其他細胞系。此外，利用雞胚生產流感疫苗,在處理使用后的雞胚殘體時只能采用焚燒或其他無害化的處理方法,既增加成本，又污染環境，而利用細胞生產疫苗則擺脫了對雞胚的依賴，沒有處理雞胚殘體這一環節，既經濟又環保。在人和動物對流感疫苗的需求不斷增加的形勢下，研制出可以擺脫對雞胚的依賴、在短期內提供足夠疫苗產品以滿足流感大規模流行時需要的流感疫苗，已成為目前流感疫苗研制中的方向。用細胞生產流感疫苗，除了在質最、產最上都優于目前的雞胚，在其他方面的優勢如表1所示。表1雞胚與細胞培養流感病毒的優缺點過程優點缺點對胚分離、培養候選疫苗株已經使用多年,工藝成熟高產株多次傳代產生不可逆轉的突變，雞勝的供應需要作計

12、劃,H3N2難以用雞厘分離檢測雞胚疫苗的單向免疫擴散試劑容易在WHO范圍內標準化和接受可能低估細胞疫苗的效力細胞培養分離候選疫苗株范圍大、快速需要適'底細胞系的鑒定，外源因子的去除和安全性研究檢奩細胞疫苗的引向免疫擴散試劑細胞與疫苗基質細胞必須匹配缺乏細胞系的標椎化細胞培養疫苗的制造可規模化、快速、不依賴于生物材料的供應、清潔、易于質底控制，生產貝險低、純度高、穩定性好、不含卵清蛋白需要研究和發展，外源病毒需要控制，生產設施比較貴下面從細胞基質、病毒培養、生產工藝幾個方面對使用細胞生產流感疫苗的研究進展加以綜述。1細胞基質的研究過去曾經采用原代雞腎、雞胚腎細胞培養制備流感疫苗，現主要使

13、用Vero、MDCK、PER-C6、傳代雞胚腎細胞(PBS-1)等細胞系。這些細胞系無外源因子污染、無致腫瘤性、對流感病毒易感、病毒滴度高，且PBS-1細胞可將病毒釋放到液體中，減低了后續工藝的勞動強度。Solvay.GSK及Chiron選擇MDCK細胞系,Baxter-AG選擇Vero細胞系，Sanofi-pasetur與Crucell公司合作開發PER-C6細胞流感疫苗。傳代細胞如Vero細胞系可用于很多病毒的分離培養，是世界衛生組織和我國生物制品規程許可的疫苗生產細胞系，在160代次以內可用于疫苗生產，如脊儲灰質炎疫苗、狂犬病疫苗、乙型腦炎疫苗等。在我國獸用生物制品質量標準匯編(2006

14、-2008)中也匯集了一些已采用傳代細胞作為基質生產的動物疫苗，如豬細小病毒病疫苗，豬繁殖與呼吸綜合征疫苗，豬回腸炎疫苗,犬瘟熱、腺病毒、細小病毒、副流感病毒2型呼吸道感染癥四聯疫苗等。目前用于甲型、乙型流感病毒增殖和感染性滴度檢測的細胞主要是MDCK細胞，并經常用雞胚培養，進行流感病毒分離o1995年Govorkova等：首次嘗試使用Vero細胞分離、繁殖甲型流感病毒，證明Vero細胞是適合流感病毒生長的。1996年乙型流感病毒也得以在Vero細胞上分離成功，并進一步證明在Vero細胞上獲得的流感病毒血凝素（Haemagglutinin,HA）與在MDCK上得到的HA比較，氨基酸序列一致，但

15、與從雞胚上得到的HAM基酸序列在196198上不同。電鏡和免疫學試驗還證明甲型、乙型流感病毒在Vero細胞上形態變化、感染過程與在MDCK上是一樣的。1998年開始,Kistner等在奧地利用Vero細胞研制滅活全病毒流感疫苗，免疫BALB/c小鼠后所獲得的血凝抑制抗體滴度比雞胚苗高很多，主要為】gGl和IgG2a/2b,誘導的T細胞免疫應答和細胞因子都好于雞胚苗。從Vero細胞最初分離夏制病毒，分離株的HA抗原性、遺傳穩定性、Vero細胞受體的特異性和流感病毒感染右效性、流感病毒感染Vero細胞后的蛋白合成和感染病毒后細胞的超微結構變化等方面可得出以下結論:Vem細胞可用于臨床樣本的流感病毒

16、分離，并可有效復制產生較高的感染滴度;能保持樣本中流感病毒HA分子的遺傳穩定性;流感病毒在感染Vero和MDCK細胞時，其蛋白合成過程和細胞形態變化非常相似。2流感病毒的改造、培養以人用流感疫苗為例，流感疫苗毒株的制備通常是WHO推薦的流行株與國家實驗室保存的在雞胚中具有高滴度的PR8株進行雙重感染產生商生長性的重配株（Highgrowthreassortant,HGR），分發給疫苗生產企業用于每年的疫苗生產。用逆向遺傳學制備疫苗毒株和傳統方法相比具有以下優勢:定向改造毒株,避免過去傳統方法的肓目性、不確定性;去除沒有經過驗證的細胞系、野毒株污染或其他病原;排除HA的致病性，可用于非致病性、高

17、致病性毒株的重配。這樣重配的流感病毒疫苗株不但具備流行株的表面抗原（HA和NA）,同時也獲得PR8毒株的毒力減弱和在細胞中高效復制能力。目前反向遺傳學技術多用于流感毒株的改造和細胞適應，以便獲得高滴度的病毒。Ozaki等把野毒株A/England/1/53與在雞胚中繁殖較快的疫苗株PR8根據2+6策略基因重配，并篩選出Vero細胞生K適應重組株Eng53/v-a。感染Vero細胞后發現Eng53/v-a比PR8繁殖生長得更好，試驗證明NS基因（非結構基因）發揮了作用，而NS基因產物在293T細胞中使病毒滴度下降了10310倍，在MDCK中降低了5倍。Ma-血等用反向遺傳學突變了豬流感病毒H1N

18、1（A/SW/SK/18789/02）的HA基因，獲得2個突變體，突變體高度減毒并能在MDCK細胞匕大量復制，遺傳學性質穩定，有望作為疫苗的后選株。巴斯德研究所對兒種不同的細胞系（BHK.Vero和MDCK細胞系）、培養基、靜止培養、不同類型微載體的轉瓶培養，最后通過連續提供新鮮培養基并調整pH值的大容量:生物反應器進行研究，在生產過程中添加胰蛋白酶。研究發現Roux瓶或轉瓶培養Vero細胞，為獲得生K快旦產fl：高的病毒（7d后HA滴度為256512/mL）,整個過程都應在無血清培養基MDSS2中進行。如采用含血清的培養基進行病毒生產后,在病毒生產階段采用MDSS2,病毒產最相當低（7d后H

19、A滴度為0128/mL）°由于病毒HA滴度不會超過128512/mL,且在病毒接種于Vero細胞與病毒產生之間需要較長的時間。通常用MDCK分離新病毒的細胞實驗發現，將無血清培養基略作改進后，可在反應器中灌注培養MDCK細胞，快速大量生產病毒，在無血清條件下生長數代的MDCK細胞生產的病毒產量最高。毒種可以是雞胚傳代株、細胞培養適應株或僅在MDCK細胞中傳了1代或2代的新分離病毒。早期研究發現流感病毒在Vero細胞中不能很好的復制增殖w-。因為流感病毒非裂解的血凝素阻止了病毒對細胞的感染性，通過在細胞維持液中加入適量:的胰酶，有效地裂解其血凝素后，使病毒能吸附感染細胞，但在病毒培養過

20、程中病毒滴度下降很快，無法得到大量有效的繁殖，甚至有時測不到HA,沒有感染的病毒粒子釋放。經培養液胰酶檢測發現，胰酶活性在孵育30min時已完全被滅活,是因為Vero細胞在生長中不斷地分泌出一種50-100kD的蛋白抑制因子，并游離于基質中，滅活胰前的活性。如果在病毒復制過程中間隔補充胰酶量，結果顯示病毒的滴度、產率得到極大的提高，即使傳5代、10代后病毒滴度仍能維持在較高水平,與在雞胚中獲得的滴度相當'。胰酶對流感病毒在大多數細胞中的復制增殖發揮重要的作用，將Vem細胞單層用PBS沖洗3遍，加入含1.0jig/mLTPCK(TolylsuIfonylphenylalanylchlor

21、omethylketone,TPCK,甲苯磺酰苯丙氨酰氨甲酮)-胰酶的MEM-BSA(牛血清白蛋白)，在37T、5%CO,條件下,分別在50mL培養瓶、6孔板和24孔板中進行培養,48h后胰酶的活性基本消失殆盡，旦50mL培養瓶下降最快,6孔板次之,24孔板最慢。同時在恒河猴腎細胞(LLC-MK?)、豬腎細胞(MDSK)和MDCK細胞培養過程中也發現了胰前活性消失現象，但比在Vero細胞中消失得要慢一些。用Vero細胞在6孔板中進行試驗時，當每孔中的培養液量不同時，胰酶的活性降低速度也有不同,2.2mL/孔、3.0miy孔和4.5mI7孔組培養24h后，胰酶的最終濃度分別下降為初始濃度的9.1

22、%、30.0%和42.7%,說明單位面積細胞的培養液體積越多，胰酶抑制因子的濃度越低，細胞的生長越好。研究表明，當HIN1和H3N2流感病毒在Vero細胞中連續傳15代后，即使反復添加胰酶，病毒的產最也會稍微低于在MDCK細胞中的產批，然而傳至10代時,病毒的產量與MDCK細胞相當。因此，流感病毒培養中適量的胰酶是細胞生產病毒不可缺少的因素。3生產工藝的研究人用流行性感冒病毒疫苗的工藝技術是19世紀40-50年代發展起來的，每年全球生產3億5千萬人份，每人份含H3N2、H1N】、B型流感病毒HA各15展,整個過程包括流感的預測、毒株篩選、候選疫苗株的確定、生產、分發等。傳統的雞胚流感疫苗的生產

23、，一般是采用雞胚接種，經35勾培養72h后，置4幻冷卻過夜,收獲尿囊液。分別對不同批次的尿囊液進行無菌、滅活試驗血凝滴度檢測。合格的尿囊液合并，經.22頭m進行過濾,300kDcutoff的膜包進行3050倍濃縮,然后進行成糖密度區帶超速離心純化。由于病毒培養方式的改變，后續的工藝也隨之改變，呈現提高疫苗的安全性、生產效率的趨勢。動物用流感疫苗也用雞胚生產，但一般沒有后期的濃縮和純化過程。目前3家公司已獲得細胞生產人用流感疫苗的生產許可。Vero細胞生產的流感疫苗已經進行了免疫原性的評價并被批準規模化生產'成。Baxter利用微載體Cytodex-3懸浮培養Vero細

24、胞，批次培養細胞可達2x10”個細胞，接毒感染復數(Multiplicityofinfection,MOI)為0.01TCID/細胞，病毒吸附1h后加入胰酶,32P35T孵育4872h,研制成功了人用季節性流感裂解苗和大流行流感全病毒疫苗，并成功通過了臨床試驗。生物反應器或Wave""培養MDCK或Vero細胞，培養基有含血清或無血清的，細胞經4d培養，密度可達106107個/mL,微載體密度25g/L,微載體類型為Cytodexl或Cytodex3,病毒滴度HA可達到2.32.9log/100jiL,MOI為0.050.1TCJDjo/細胞。流感季節性流行和可能的大流行促

25、使人們研究快捷的生產方法,Kistner等”們采用野毒株直接在Vero細胞上培養以生產滅活全病毒疫苗。通過30L或100L生物反應器培養流感病毒，病毒滴度達loglOTCID/mL,經滅活，在動物試驗中具有較強的免疫原性，可誘導交叉中和抗體、細胞免疫反應，對同型或異型的流感病毒攻擊產生保護。最近的一項工藝研究發現，細胞懸浮培養病毒原液的HA達393HAU/100皿，濁度到0.479OD(700nm)，蛋白和DNA含量分別為72jig/mL、5.73jig/mL時進行收獲、合并，經0.65jim膜過濾J/4000B-丙內酯滅活A4531微濾、750kD切向流波器超濾、分子篩層析、離子交換層析純化

26、、配苗等后續工藝，澄清工藝的抗原收獲率為79%,微濾工藝收獲率為93%,濁度下降2%左右，采用750kD中空纖維柱超濾時，收獲率為97%，蛋白和DNA的含量下降分別為16%和33%,濃縮液經Sepharose4FF純化,HA活性的收獲率可達85%,截量每小時處理0.15倍柱體積的濃縮液，蛋白和核酸減少35%和34%,收集的病毒純化液再經陰離子交換層析純化,收獲率為80%,1mL介質吸附160kHAU的病毒，宿主DNA減少67倍。整個工藝過程的病毒產量50%-60%，總蛋白減少19倍，宿主DNA減少500倍，基本滿足細胞流感疫苗的生產需求也有實驗室研究用一種Euonymuseumpaeus的親和

27、素做配體制成瓊脂糖、纖維素、多聚化合物、玻璃顆粒的親和介質分離純化流感病毒。試驗結果表明，用纖維素、多聚化合物作成的膜親和層析比傳統親和層析具有更高的效率，去除DNA的效率達到0.2%1%,雜蛋白去除率31%50%,和流感病毒具有高親和性，有希望代替目前的兩步層析用于MDCK細胞流感疫苗的純化切。隨著細胞培養制備流感疫苗的研究發展，安全性、有效性的研究也在不斷深入。Novatis疫苗公司）用MDCK細胞制備的疫苗已通過歐盟n期臨床試驗,和雞胚流感疫苗相比,具有相同的免疫原性,無明顯的輕度、中度反應，在老人和其他人群中具有艮好的耐受性。Halperin等利用MDCK細胞培養流感病毒制成裂解滅活疫

28、苗，對112名健康成人注射此疫苗，同時與同類的雞胚培養的疫苗比較，結果兩種疫苗在注射后的不良反應與免疫后抗體滴度水平均無明顯差異，證明細胞培養的流感疫苗是安全有效的，應值得進一步推廣。加拿大的Percheson等使用源于MDCK細胞的BV-5F1細胞（被證實無致腫瘤性），經擴增后轉至大規模發酵罐中的微載體上培養,接種流感病毒，繼續培養，收獲的病毒液按照雞胚培養的裂解流感疫苗的純化方法進行純化，主要包括高心、超濾、甲醛滅活、裂解、配苗。然后運用隨機、雙盲的臨床人體觀察方法對此類細胞滅活疫苗和雞胚滅活疫苗同時接種健康人群，結果證明此類新型疫苗在成人試驗中是安全有效的。4今后的研究方向和重點細胞基質

29、生產流感疫苗，涉及流感病毒分離、流感病毒重配、適應、培養、濃縮、純化以及質域控制的過程，實際上是生產流感疫苗的安全性、有效性、穩定性，因此我們應在以F環節加強研究：4.1病毒種子的安全性流感病毒臨床樣本的分離通常采用MDCK細胞。該細胞系的生物學特性未經驗證，同時來自人呼吸道的分泌物以及未驗證的細胞系均有潛在的外源病毒污染，不能用于疫苗候選株的培養。使用WH。認證的細胞系分離、培養病毒是保證疫苗、毒種安全性的重要方面。加強細胞基質外源病毒檢測是保證疫苗安全的重要環節。目前快速的PCR檢測細胞系中特定外源病毒方法獲得認證和風險評估3，可用該方法檢測流感病毒株的外源病毒。4.2臨床樣本分離方法使用

30、MDCK細胞能成功地分離流感病毒，但Vero、PER-C6等其他細胞系在分離流感病毒的作用如何？是否優于MDCK細胞仍值得研究。4.3高產重配株與候選疫苗株通過雞胚感染重配的高產重配株難以在細胞系上生長，需要在細胞上重配的高產株方能作為細胞候選疫苗株。通過逆向遺傳學技術進行重組構建候選疫苗株廣泛應用于大流行疫苗和活疫苗株的構建，由于其過程采用特殊的PCR基因質粒操作、細菌轉化和傳代,實際上去除了外源病毒污染,降低了分離病毒株到疫苗病毒株種子批轉化的危險，可用于分離病毒的重配、純化而去除可能的外源污染。因此疫苗公司要加大對該技術的掌握，而不能只依賴國家實驗室。4.4單向免疫擴散(SingleRa

31、dicalImmunodiffusionAssay,SRD)試劑在SRD分析中，一般要求抗原必須與疫苗中的抗原一致，多數是雞胚生產的抗原，缺乏細胞生產抗原的分析數據。但也有抗原制備來源不同影響分析結果的報道，因此要加強SRD分析中抗原來源影響抗原含量的研究。4.5緊急預防和治療用抗體制劑流感疫苗的研制還需時日，因此除有效的藥物(如此次甲型H1N1流感中使用達菲)治療以外，在人和動物(名貴的種用動物或寵物)發生流感的早-期，對其感染的個體是否可用有效抗體進行治療,并對與其接觸的小群體用抗體進行緊急被動免疫。利用傳代細胞復制分離到的病毒制成抗原，并采用現有的技術制備成精制的抗體,本文認為值得深入研

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