1、重組的DM分子是在DM連接酶的作用下，有Mg2、ATP存在的連接緩沖系統 中，將分別經酶切的載體分子與外源DNA分子進行連接。DNA連接酶有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶。兩種DNA連接 酶都有將兩個帶有相同粘性末端的DNA分子連在一起的功能，而且T4噬菌體DM連 接酶還有一種大腸桿菌DNA連接酶沒有的特性，即能使兩個平末端的雙鏈DNA分子連 接起來。但這種連接的效率比粘性末端的連接率低，一般可通過提高T4噬菌體D7A 連接酶濃度或増加DNA濃度來提高平末端的連接效率。T4噬菌體DNA連接酶催化 DNA連接反應分為3步：首先，T4 DNA連接酶與輔因子ATP形成W-ATP復

2、合物；然 后，酶-ATP復合物再結合到具有5'磷酸基和3'軽基切口的D對上，使DNA腺昔化; 最后產生一個新的磷酸二酯鍵，把切口封起來。連接反應通常將兩個不同大小的片斷 相連。很多DNA聚合酶在進行PCR擴增時會在PCR產物雙鏈DNA每條鏈的3'端加上一 個突出的堿基A。pUCm-T載體是一種已經線性化的載依，載體每條鏈的3'端帶有一 個突出的T。這樣，pUCm-T載體的兩端就可以和PCR產物的兩端進行正確的AT配對, 在連接酶的催化下，就可以把PCR產物連接到pUCm-T載體中，形成含有目的片斷的 重組載體。連接反應的溫度在37T時有利于連接酶的活性。但是在這

3、個溫度下粘末端的氫鍵 結合是不穩定的。因此采取折中的溫度，即12-16£,連接12-16h （過夜），這樣既 可最大限度地發揮連接酶的活性，又兼顧到短暫配對結構的穩定。二.感受態制備原理細菌在0 ° C CaC4低滲溶液中脹成球形，丟失部分膜蛋白，成為容易 吸收外源DNA的感受態。三.B-半乳糖甘酶顯色反應選擇法LacZ基因是大腸桿菌乳糖操縱子中的一個基因，可以編碼B半乳糖核昔酶。半乳糖核昔酶是由4個亞基組成的四聚體，可催化乳糖的水解.用X-Gal為底物 進行染色時，呈藍色。現在一些待定的質粒（比如pUC/PBS等），常帶有B-半乳糖核昔酶的調控序列 和B半乳糖核昔酶N端1

4、46個氨基酸（a肽段）的編碼序列，在這個編碼序列里還 插入一個多克隆位點（HCS），它并不影響lacZ的表達。另外，常用的大腸桿菌帶有 B半乳糖核昔酹C端部分序列（0肽段），的編碼序列。在各自獨立的情況下，這 些質粒與大腸桿菌各自編碼的卩一半乳糖核昔酶片段都沒有酶的活性。只有當攜帶a 肽編碼信息的克隆載體成功進入宿主細胞，在培養基誘導物IPTG的誘導下，載體質 粒能夠合成B半乳糖核昔酶N端（a肽段），這樣就與宿主細胞合成的半乳糖 核昔酶C端部分序列（B肽段）互補，形成完整的B半乳糖核昔酶活性蛋白。而當外源基因插入到此種載體質粒lacZ的多克隆位點后，會造成lacZ基因不能 表達，從而不能合成B

5、半乳糖核昔酶；而對于空載體，lacZ基因正常表達，通過a 互補合成B半乳糖核昔酶，分解培養基里的色素底物X-gal,最終形成藍色的化合 物，出現藍色菌斑。實驗準備：清洗，5個100ml錐形瓶（外加1個小的），6副培養皿，3個小試劑瓶, 接種環，涂布棒。準備100ml超純水。溶液:LB300ml（液體50ml+50ml,固體100ml）,0. lmol/L CaC12 10ml, lOOmg/mlAmp 1 ml, 20mg/mlX-gal 1 ml, 200mg/ml IPTG 1 ml o大腸桿菌菌液lml。感受態細胞連接產物4管4x5= 20ul 做 4 份目的基因T載體T4連接酶10x沖

6、液4 x 4uL4xluL4x0. 5uL4xluL滅菌：5個lOOnd錐形瓶（外加1個小的），6副培養皿，3個小試劑瓶，接種 環，涂布棒，10ml超純水，LB培養基 1.5mlEP管，大小槍頭，過濾用具2副0. lmol/L CaC12實際配置20mg/ml X-gal X-gal為5-漠-4-氯-3引喙-B-D半乳糖昔。用二基甲醜 胺（DMF）溶解X-gal配制成的20mg/ml （取0. 02gX-gal,用DMF定容為lml）的貯存 液。保存于一玻璃管或聚丙烯管中，裝有X-gal溶液的試管須用鋁箔封裹以防因受光 照而被破壞，并應貯存于-20X：o X-gal溶液無須過濾除菌。（DMF二

7、甲基甲酰胺； Dimethylfo r mam ide； NtNDi methyl formamide； DMF； CAS： 68-12-2 理化性質：無色、 淡的胺味的液體。分子式C3-H7-N-0o分子量73. 10。相對密度0.9445（25°C）。熔點 -61°Co沸點152. 8°Co ） 溶于DMSO,溶解度可達20mg/mlo也溶于DMF溶于DMSO, 溶解度可達20mg/mlo也溶于DMF200mg/ml IPTG在0. 8ml蒸榴水中溶解0. 2g IPTG后，用蒸館水定容至lml,用 0. 22u m濾器過濾除菌，貯存于-20。（2。LB培養基

8、：配制每升培養基，應該在950 ml去離子水中加入：腹化蛋白腺10g酵母提取物 5g NaCl 10R揺動容器直至溶質溶解用5mol/LNa0H調pH至7. 3用去離子水定容至 1L在15psi高壓下蒸汽滅菌20min. （ 100mlLB培養基加入15g瓊脂粉為固體培養 基）0. lmol/LCaC12:取0. 11098g氯化鈣固體定容至10mlAmp （lOOmg/ml）:溶解0. lg氨節青霉素鈉鹽于足量的水中，最后定 容至lml,用0.22 m m濾膜過濾除菌.實驗過程（一）.目的基因片段與載體連接器材旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5ml微量離心管，雙 面離心管架，臺式

9、離心機，干式恒溫氣浴。試劑T載體，T4 DNA連接酶，連接酶緩沖液，無菌dd Water。操作步驟PCR產物與T載體直接連接：（1）事先將干式恒溫儀（或冰盒里的水）溫度設定在1416。C。（2）取4個滅菌的200ul M量離心管，加入：（需要調整）4ml目的基因； lml T 載體；0.5ml T4 DNA 連接酶（TAKARA, 350U/ul） ； lml 連接酶緩沖液 10 x buffer ； 3. 5 ml dd Water 總量 10ml 體系。（3）述混合液輕輕震蕩后再短暫離心，然后置于14° C干式恒溫儀（或14° C 水中）中保溫過夜（12-16h） &l

10、t;>（4）連接后的產物可以立即用來轉化感受態細胞或置4° C冰箱備用。（二）大腸桿菌感受態細胞的制備細菌轉化儀器：旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，50ml微量離心管， 1.5ml微量離心管，臺式冷凍離心機，制冰機，恒溫搖床，分光光度計， 超凈工作臺，恒溫培養箱，搖菌試管，三角燒瓶，接種環，恒溫搖床，培 養皿（已鋪好固體LB-Amp），酒精燈，玻璃涂棒，恒溫培養箱，濾膜和過 濾器試劑：E. coli 粛護,LB 培養基,0. 1 mol/L CaC12 溶液，無菌 dd Water , LB培養基（不加抗菌素），LB培養基（加抗菌素），無菌dd water, IPTG,

11、 X-galo步驟（1）在超凈工作臺中，將lml大腸桿菌菌液加入100ml LB液態培養基（不含 抗菌素），37X2搖床培養過夜。（2）取0.5ml上述菌液轉接到含有50mL LB培養基的三角燒瓶中，37°C下 250r/min 搖床培養 2'3h,測定 0D590 為 0. 35、0. 4 左右（<0.40.6,細胞數<108/mL, 此為關鍵參數?。?。（注意：此步搖菌的時候，要有一管不加菌的LB培養液同時搖 菌）（3）將lml菌液加入到4支1.5mL預冷無菌的聚丙烯離心管中，于冰上放置 10min,然后于 4°C, 5000rpm 離心 5min。（

12、4）將離心管倒置以倒盡上清液，加入lml冰冷的0. 1 mol/L CaC12溶液， 立即在渦旋混合器上混勻，插入冰中放置30min。（5）4乜，5000rpm離心5min,棄上清液后，用100 u L冰冷的0. 1 mol/L CaC12 溶液垂懸，插入冰中放置2h,可以直接用作轉化實驗，或立即放入-4攝氏度冰柜中 保藏。（6）事先將恒溫水浴的溫度調到42弋。（7）從-70£超低溫冰柜中取出一管（100 PL）感受態菌，立即用手指加溫融 化后插入冰上，冰浴5、10min。（8）加入5uL連接好的質?；旌弦海―NA含量不超過100ng）,輕輕宸蕩后敖 置冰上20min。（9）輕輕搖勻

13、后插入42乜水浴中90s進行熱休克，然后迅速放回冰中，靜置 3min。（10）在超凈工作臺中向上述各管中分別加入300 p L LB培養基（不含抗菌素） 輕輕混勻，然后固定到揺床的彈簧架上37乜宸蕩lh。（11）在超凈工作臺中取上述轉化混合液200 uL,分別滴到含合適抗菌素（Amp 100ug/L）的固體LB平板培養皿中，再在平板上滴加40 pL 20mg/ml X-gal, 7 u L 200mg/nil IPTG,用酒精燈燒過的玻璃涂布棒涂布均勻（注意：一個不含抗生素作為 對照組，玻璃涂布棒上的酒精熄滅后稍等片刻，待其冷卻后再涂，菌液涂皿操作時， 應避免反復來回涂布，因為感受態細菌的細胞

14、壁有了變化，過多的機械擠壓涂布會使 細胞破裂，影響轉化率。）。（12）在涂好的培養皿上做上標記，先放置在37X：恒溫培養箱中30min直到表 面的液體都滲透到培養基里后，再倒置過來敖入37乜恒溫培養箱過夜。（13）在被細菌污染的桌面上噴灑70%乙醇，擦干桌面。（14）觀察平板上長出的菌落克隆，以菌落之間能互相分開為好。注意白色菌 斑O（三）轉化克隆的篩選和鑒定器材旋渦混合器，小鑲子，微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5ml微量離心管， 雙面離心管架，干式恒溫氣浴（或恒溫水浴鍋），制冰機，恒溫搖床，超凈工作臺， 酒精燈，無菌牙簽，搖菌管。試劑LB培養基（加抗菌素），PCR用試劑，引物，質粒提取用試

15、劑，酶切需要 的限制性且酶及其緩沖液，65%甘油（65%甘油,0. lmol/LMgS04, 0. 025mol/L Tris Cl pH8. 0） o操作步驟 方法一：快速PCR篩選法（1）在轉化的平板培養基上隨機選取4個邊緣清晰的白色菌落，并用記號筆 在其所在的培養皿底部玻璃背面畫圈做標記編號。（2）在0. 2ml PCR微量離心管中配制25u 1反應體系。dd water 16 u 110XPCR buffer （不含 MgC12） 2. 5 p 125mM MgC12 1. 5 U12. 5mmol/L dNTP 2 u 1 （每種 dNTP 終濃度 0加M）10 u mol/L Pr

16、imer 1 1 u 1 （12.525pmoles ）10umol/L primer2 1 u 1 （12.525pmoles）模板質粒 用小tip頭輕輕粘一下選中的白色菌落，再伸入PCR混合液中洗一洗Taq 酶 0.5U1 （ 1. 5u）總體積25 y 1（2）根據廠商的操作手冊設置PCR儀的循環程序（本實驗室已經設置為WZ）： 94°C5min 94°Clmin 60°Clmin 72°C IminSOsgoto29 times 72°C10min（2）PCR結束后，取10u 1產物進行瓊脂糖凝膠電泳（與原始插入片斷同時比 對）。觀察膠上是否有預計的主要產物帶。（3）按照編號找到培養皿中的原菌斑。根據需要進行放大培養提取其質粒（4）提取到的質粒與原先的空載體（或已知分子量的質粒）再對比電泳，以進 步確認。方法二：提質粒再PCR或酶切鑒定（1）在超凈工作臺中取3支無菌揺菌管，各加入3mL LB （含50mg/mL氨節青寄 素），用記號筆寫好編號。（2）在超凈工作臺中將70%乙醇浸泡的小躡子頭用酒精燈烤過，鍍取一支無菌牙 簽。用牙簽的尖部接觸轉化的平板培養基上的一個白色菌落，然后將牙簽放入盛有 3mLLB