1、第二章核酸的化學(xué)第一節(jié)核酸的概念和化學(xué)組成一、核酸的發(fā)現(xiàn)及研究進(jìn)展1、最早1868年，瑞士科學(xué)家Miescher從繃帶膿細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)含磷2.5%的化合物，稱為核素。2、1881年，Altmann從小牛胸腺、酵母中得到，它不含Pro，命名為核酸。3、1914年，把小牛胸腺中得到的核酸稱胸腺核酸（動(dòng)物核酸），把從酵母中分離得到的核酸稱酵母核酸(植物核酸)。 又根據(jù)戊糖分為脫氧核糖核酸DNA和核糖核酸RNA4、1944年，Avery研究肺炎球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，證明DNA是遺傳物質(zhì)的結(jié)論。最初是1928年，Gniffith以肺炎球菌作為轉(zhuǎn)化的材料。肺炎球菌 光滑型（S型）：菌落光滑、有莢膜、有毒性。 粗糙型（

2、R型）：菌落粗糙、無莢膜、無毒性?；铙w轉(zhuǎn)化，四組實(shí)驗(yàn)： 活S型菌Ratdie 活R型菌Ratlive 加熱殺死的S型菌Ratlive加熱殺死的S型菌Ratdie活R型菌 說明R型菌可以轉(zhuǎn)化為活S型菌，加熱殺死的S型菌中有一種物質(zhì)可使活R型菌轉(zhuǎn)化為S型菌。1944年美國科學(xué)家Avery做了大量實(shí)驗(yàn)確定這種物質(zhì)是DNA（轉(zhuǎn)化因子）。5、1953年，沃森和克里克提出DNA的雙螺旋模型結(jié)構(gòu)，不但闡明了DNA結(jié)構(gòu)，而且對(duì)DNA的復(fù)制、遺傳物質(zhì)的傳遞、都作了重要的說明。6、20世紀(jì)70年代，DNA重組技術(shù)應(yīng)用基因工程誕生。7、20002002年人類基因組計(jì)劃完成。二、核酸的概念和重要性核酸是由核苷酸組成的

3、具有復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)的大分子物質(zhì)，包括DNA和RNA。DNA主要分布在細(xì)胞核中；RNA分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，主要有三種信使RNA（mRNA）、核蛋白體（rRNA）、轉(zhuǎn)運(yùn)（tRNA）。真核生物中還有HnRNA和SnRNA，HnRNA是mRNA的前體，SnRNA參與RNA的修飾加工等。DNA是遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)。（一）核酸是遺傳物質(zhì)細(xì)胞核內(nèi)DNA含量恒定，不受外界環(huán)境的影響。生物遺傳特征的延續(xù)和生物進(jìn)化都由基因所決定的?；蚴蔷哂羞z傳效應(yīng)的DNA片段。（二）核酸參與蛋白質(zhì)的生物合成mRNA是蛋白質(zhì)合成材料，rRNA是核糖體的成分。三、核酸在醫(yī)藥上的應(yīng)用1、RNA：來源與微生物發(fā)酵，動(dòng)物內(nèi)臟，可用于改善精

4、神遲緩，記憶衰退，刺激造血，促進(jìn)白細(xì)胞再生，治療初級(jí)癌癥。2、DNA：來源于微生物發(fā)酵，可用于改善疲勞，提高抗癌療效。3、免疫核糖核酸（iRNA）：來源于免疫的動(dòng)物內(nèi)臟，用于腫瘤的免疫治療。4、多聚核苷酸（polyC，polyI）：來源于微生物發(fā)酵和化學(xué)合成，作為干擾素的誘導(dǎo)劑。5、核苷-磷酸（IMP、CMP、UMP）：來源于微生物發(fā)酵。IMP：治療肝炎、腎炎、白血球升高等癥CMP；治療肝炎、腎炎、白血球、血小板升高四、核酸的基本結(jié)構(gòu)單位單核苷酸（一） 核苷酸的概念核酸水解生成核苷酸，核苷酸進(jìn)一步水解生成核苷和磷酸，核苷再水解生成堿基和戊糖。核苷酸：由堿基、戊糖和磷酸組成和化合物，是核酸的基本

5、結(jié)構(gòu)單位。核酸分子中的堿基有兩類：嘌呤堿和嘧啶堿，嘌呤堿主要有腺嘌呤A、鳥嘌呤G；嘧啶堿主要有胞嘧啶C、尿嘧啶U和胸腺嘧啶T，稱為基本堿基。有些核酸分子中還有1-甲基腺嘌呤、次黃嘌呤、N6-甲基腺嘌呤等，它們?cè)诤怂岱肿又胁⒉欢嘁姡Q為稀有堿基。核酸分子中的戊糖有兩種：D-核糖、D-脫氧核糖，結(jié)構(gòu)式如下：DNA和RNA分子的化學(xué)組成為 RNA DNA堿基 AGCU AGCT 戊糖 R dR磷酸 磷酸 磷酸（二）核苷酸的分子結(jié)構(gòu)1、核苷 核苷：由堿基和戊糖縮合形成的化合物。 堿基與核糖縮合形成核糖核苷，堿基與脫氧核糖核苷縮合形成脫氧核糖核苷，如腺嘌呤與核糖縮合生成腺嘌呤核苷，簡(jiǎn)稱腺苷，其它核苷可依

6、此命名，它們的分子結(jié)構(gòu)如下：（投影膜） 在核苷分子中，嘌呤堿基的N9與戊糖的C1連接，連接鍵為N-C鍵，一般稱為N-糖苷鍵，并且戊糖環(huán)的C1-OH為構(gòu)型，所以堿基與戊糖的連接為-糖苷鍵。為了與堿基相區(qū)別，將核苷分子中戊糖上原子的定位加“”表示。2、核苷酸核苷分子中戊糖環(huán)上的羥基磷酸酯化，形成核苷酸，也可稱磷酸核苷。根據(jù)核苷酸分子中戊糖的不同，核苷酸可分為核糖核苷酸和脫氧核糖苷酸兩類。核糖有3個(gè)游離羥基（2，3，5）因此可形成三種核苷酸；脫氧核糖只有兩個(gè)游離羥基（3，5）。自然界中存在的游離核苷酸多為5-核苷酸（代號(hào)可略）。如5-腺嘌呤核苷酸，簡(jiǎn)稱腺苷酸。，其它核苷酸的命名依次類推。（投影膜）五

7、、核苷酸的衍生物（一） 多磷酸核苷酸凡含有一個(gè)磷酸基的核苷酸稱為一磷酸核苷。其中5-一磷酸核苷的磷酸基可進(jìn)一步磷酸化，生成5-二磷酸核苷和5-三磷酸核苷。以腺苷酸為例，結(jié)構(gòu)式如下：（投影）常用的核苷酸及其簡(jiǎn)化符號(hào)見投影：常用的核苷酸及簡(jiǎn)化符號(hào)見表2-2一磷酸二磷酸三磷酸腺苷AMPADPATP鳥苷GMPGDPGTP胞苷CMPCDPCTP尿苷UMPUDPUTP脫氧胸苷dTMPdTDPdTTP生物體內(nèi)多磷酸核苷具有重要的生物學(xué)作用。四種三磷酸核苷是合成RNA的重要原料，四種三磷酸脫氧核苷是合成DNA的重要原料。ATP在生物體內(nèi)化學(xué)能的儲(chǔ)存和利用中起重要的作用。（二） 環(huán)核苷酸5-核苷酸的磷酸基可與戊

8、糖上的3-OH縮合形成3，5-環(huán)核苷酸。重要的環(huán)核苷酸有3，5-環(huán)腺苷酸（cAMP）和3，5-環(huán)鳥苷酸（cGMP），它們?cè)诮M織細(xì)胞中起著傳遞信息的作用，稱為“第二信使”。（三）輔酶類核苷酸一些輔酶屬于核苷酸類衍生物。輔酶（NAD+）和輔酶（NADP+）都是腺嘌呤與尼克酰胺組成化合物，黃素單核苷酸（FMN）是異咯嗪、核醇和磷酸組成的化合物，黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）是由黃素單核苷酸與腺嘌呤核苷酸組成的化合物。輔酶A（CoA-SH）是由腺嘌呤、氨基乙硫醇和葉酸組成的化合物，它們?cè)谔?、脂肪和蛋白質(zhì)代謝中起著重要的作用。第二節(jié)核酸的分子結(jié)構(gòu)一、 DNA的分子結(jié)構(gòu)(一)DNA的堿基組成 參與DNA組成

9、主要四種堿基：A、C、G、T，還有少量稀有堿基。20世紀(jì)50年代應(yīng)用紙層析及紫外分光光度計(jì)對(duì)各種生物DNA的堿基組成進(jìn)行定量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)如下規(guī)律：1、所有DNA中A和T的摩爾含量相等，即A=T，G和C的摩爾含量相等，即G=C，因此A+G=C+T。2、DNA的堿基組成具有種的特異性，即不同生物種的DNA具有獨(dú)特的堿基組成，但無組織和器官的特異性，且生長發(fā)育階段、營養(yǎng)狀態(tài)、環(huán)境都不會(huì)影響DNA的堿基組成。（二）DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)1977年，英國科學(xué)家Sanger首次測(cè)定噬菌體X174的DNA，它是單鏈，由5386個(gè)堿基組成?，F(xiàn)已測(cè)定的最大噬菌體為-噬菌體。 DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的定義：構(gòu)成DNA的各個(gè)單核苷

10、酸的數(shù)目和排列順序。實(shí)驗(yàn)分子表明，核酸分子中相鄰核苷酸之間通過3，5-磷酸二酯鍵連接。因?yàn)?，5-磷酸二酯鍵是在一個(gè)核苷酸的3-羥基與另一個(gè)核苷酸的5-磷酸之間形成的，所以由此連接的開鏈多核苷酸具有兩端，戊糖3-羥基指向的一端稱為3-末端，5-羥基指向的末端稱為5-末端。DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)即是DNA分子中核苷酸的排列。多核苷酸的分子結(jié)構(gòu)書寫格式可以寫成線條式或文字縮寫式如圖:（投影膜） P和斜線代表3，5-磷酸二酯鍵,豎線表示核糖的碳鏈。（三）DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)1953年，Waston and Crick提出DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。（投影膜）1、DNA雙螺旋模型提出的依據(jù)1）DNA堿基組成的分析：

11、發(fā)現(xiàn)腺嘌呤和胸腺嘧啶含量相同（摩爾含量）A=T， C=G，說明可能A和T，G和C是配對(duì)的。2）堿基的理化數(shù)據(jù)分析：嘌呤堿大，嘧啶堿小，因此A-T，G-C配對(duì)是較合理的。3）DNA纖維X-光衍射結(jié)構(gòu)分析：Franklin制得精致的DNA纖維X-光衍射圖，表明DNA分子中3.4Á和34Á的周期性結(jié)構(gòu)，說明DNA可能存在著雙螺旋性。2、DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)1）DNA雙螺旋分子由兩條多核苷酸鏈組成，反向平行，即一條鏈走向35，另一條鏈為53，兩條鏈均為右手螺旋，圍繞同一中心軸形成右手螺旋。2）脫氧核苷酸和磷酸基形成的鏈為基本骨架，在螺旋外側(cè)，堿基分布在螺旋內(nèi)側(cè)3）內(nèi)側(cè)互補(bǔ)的堿基通

12、過氫鍵性形成，A-T之間形成三個(gè)氫鍵，G-C之間形成兩個(gè)氫鍵。4）每個(gè)堿基對(duì)位于同一個(gè)平面內(nèi)，堿基平面與中心軸垂直，相鄰兩個(gè)堿基距離為0.34nm，每螺旋一圈有10對(duì)堿基，相鄰堿基平面距離為3.4 nm。5）雙螺旋結(jié)構(gòu)上有二條螺形凹槽，一條較深，一條較淺。較深的溝稱大溝，較淺的溝稱小溝。3、維持DNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的作用力1）堿基平面之間堆積力是維持雙螺旋結(jié)構(gòu)的主要力量。2）堿基對(duì)之間的氫鍵。3）磷酸基團(tuán)上的負(fù)電荷和介質(zhì)中的陽離子形成的離子鍵。4、DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)種類1）右手螺旋結(jié)構(gòu)：由于DNA纖維的含水量不同，可分為三種：B-DNA、A-DNA、C-DNA。 B-DNA：Waston and Cr

13、ick提出的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)為B-DNA，另外溶液和細(xì)胞中天然狀態(tài)的DNA可能是B-DNA。 A-DNA：堿基與中心軸不相垂直，而呈20傾角。 C-DNA：可能存在于染色體與某些病毒的DNA中。三者區(qū)別見書本P91。2）左手螺旋DNA1979年，美國麻省理功學(xué)院Rich從d（GpCpGpCpGpCp）一段脫氧核苷酸鏈X衍射中發(fā)現(xiàn)，糖與磷酸的走向是曲折的，又把左手螺旋稱為Z-DNA螺旋。Z-DNA和B-DNA的區(qū)別見P92。（五）DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)定義：指DNA雙螺旋鏈的扭曲或壓縮。常見的形成超螺旋結(jié)構(gòu)。1、DNA超螺旋結(jié)構(gòu)形成原因由于某種原因使雙螺旋多旋轉(zhuǎn)或少旋轉(zhuǎn)幾圈，這樣雙螺旋內(nèi)的原子偏離正常

14、位點(diǎn)，產(chǎn)生額外壓力，能量增大。如果雙螺旋末端是開放的，這種張力可通過鏈的轉(zhuǎn)動(dòng)釋放出來，DNA就恢復(fù)到原來正常狀態(tài)。如果螺旋雙端是閉和或固定（ 不能轉(zhuǎn)動(dòng)），那么這些張力就不能釋放出來，只能在DNA分子內(nèi)部，使原子位置重新排列，這樣使得DNA發(fā)生扭曲，即超螺旋結(jié)構(gòu)。2、生物體內(nèi)的超螺旋結(jié)構(gòu)在細(xì)菌、真核生物中的環(huán)狀DNA，葉綠體DNA是超螺旋結(jié)構(gòu)。生物的細(xì)核內(nèi)DNA是線形雙螺旋DNA，當(dāng)兩端固定時(shí)，可形成，例如：人的染色體DNA與組蛋白結(jié)合，成環(huán)狀DNA，形成核小體，許多核小體串聯(lián)在一起，再經(jīng)過反復(fù)折疊纏繞、壓縮形成超螺旋結(jié)構(gòu)。二、RNA的種類和分子結(jié)構(gòu)生物細(xì)胞內(nèi)含有三種主要的RNA，即轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（

15、tRNA）、核糖體RNA（rRNA）信使RNA（mRNA）。（一） 轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA）占全部RNA的15%，分子量較小，在2.5×104左右，由7090個(gè)核苷酸組成。tRNA在蛋白質(zhì)生物合成過程中具有轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸的作用。細(xì)胞內(nèi)tRNA種類很多，每一種氨基酸都有相應(yīng)的一種或幾種tRNA。對(duì)tRNA的分子結(jié)構(gòu)較為清楚，它的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)主要有：1、分子量25kd左右，由7090個(gè)核苷酸組成，沉降系數(shù)在4S左右；2、堿基組成中有較多的稀有堿基；3、3末端都為CpCpAOH，用來接受活化的氨基酸。稱為接受末端4、5-末端大多為pG，也有pC的；5、tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)都呈三葉草（見投影膜）。雙螺旋

16、區(qū)成了葉柄，突出區(qū)好象三葉草的三片小葉。由于雙螺旋所占的比例較高，tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)定。三葉草型結(jié)構(gòu)由氨基酸臂、二氫尿嘧啶環(huán)、反密碼環(huán)、額外環(huán)和TC環(huán)等五部分組成。1）氨基酸臂：由7對(duì)堿基組成，富含鳥嘌呤，末端為CCA，接受活化的氨基酸。2）二氫尿嘧啶環(huán)：由812個(gè)核苷酸組成，具有兩個(gè)二氫尿嘧啶，通過3-4對(duì)堿基組成的雙螺旋區(qū)與其余部分相連。3）額外環(huán)反密碼環(huán)：由7個(gè)核苷酸組成。環(huán)中部為反密碼子，由3個(gè)堿基組成，反密碼環(huán)通過由5對(duì)堿基組成的雙螺旋區(qū)與其余部分相連。4）額外環(huán)：由318個(gè)核苷酸組成。不同的tRNA具有不同大小的額外環(huán)，是tRNA分類的重要指標(biāo)。5）假尿嘧啶-胸腺嘧啶核糖核苷

17、環(huán)（TC），由7個(gè)核苷酸組成，5對(duì)堿基組成的雙螺旋區(qū)與其余部分相連。6、tRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu) 酵母丙氨酸t(yī)RNA三級(jí)結(jié)構(gòu)呈倒L型（見投影膜）（二） 信使RNA（mRNA）大多數(shù)真核生物細(xì)胞mRNA在3末端有一段約200個(gè)核苷酸的polyA（多聚腺嘌呤）。原核生物細(xì)胞mRNA一般無3polyA 。polyA 的功能主要是：與mRNA從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)移有關(guān)；與mRNA的半衰期有關(guān)，新合成的mRNA，polyA鏈較長，而衰老的mRNA，polyA鏈較短。真核生物細(xì)胞5-末端還有一個(gè)特殊結(jié)構(gòu)：即7-甲基鳥嘌呤核苷三磷酸，稱為5-cap。目前認(rèn)為5-cap可能于蛋白質(zhì)合成的正確起始作用有關(guān)。（三） r

18、RNA含量大，占細(xì)胞RNA總量的80%。是構(gòu)成核糖體的骨架。動(dòng)物細(xì)胞核糖體rRNA有四類：5 SRNA、5.8 SRNA、18 SRNA、28 SRN。rRNA的功能迄今仍不清楚。第三節(jié) 核酸的理化性質(zhì)與常用的研究方法一、核酸的分子量大分子化合物，。DNA分子量特別巨大，一般在1061010 之間。不同生物、不同種類DNA分子量差異很大，如多瘤病毒DNA分子量為3×106，而果蠅染色體DNA分子量為8×1010。DNA具有雙螺旋結(jié)構(gòu)，使分子具有一定的剛性，但DNA極為細(xì)長，又具有柔性。RNA分子量在數(shù)百至數(shù)千萬之間。二、核酸的溶解性和粘度DNA和RNA屬于極性化合物，微溶于

19、水，不溶于乙醇、乙醚、氯仿等有機(jī)溶劑。但其鈉鹽在水中的溶解度大，如RNA在水中的溶解度可達(dá)4%。DNA分子細(xì)長，分子長度有的達(dá)數(shù)厘米，如人的第十三對(duì)染色體DNA分子量為6.4×1010，伸展長度可達(dá)3.2厘米，而分子直徑只有2nm，因此即使稀溶液也有很大的粘度。當(dāng)DNA變性時(shí)，分子形狀由雙螺旋變?yōu)闊o規(guī)線團(tuán)，空間伸展長度變短，使溶液粘度降低，因此可用粘度作為DNA變性的指標(biāo)。三、核酸的的酸堿性質(zhì)核酸分子中具有很多呈酸式解離的磷酸殘基和呈堿式解離的氮原子，因此核酸是兩性電解質(zhì)，在水溶液中能發(fā)生兩性電離，具有等電點(diǎn)。DNA雙螺旋兩條鏈間氫鍵的形成與其解離狀態(tài)有關(guān)，在PH4.011.0范圍內(nèi)

20、堿基最穩(wěn)定。由于磷酸基的PK值較低，所以當(dāng)溶液PH大于4.0時(shí)，核酸呈多介陰離子狀態(tài)，易于堿性蛋白，如組氨酸結(jié)合。四、核酸的紫外吸收嘌呤堿與嘧啶堿具有共軛雙鍵，使堿基、核苷、核苷酸和核酸在240290處有吸收峰，其中在處有最大的吸收值。對(duì)待測(cè)樣品中是否純品可用紫外吸收分光光度計(jì)讀出260nm與 280nmOD的OD值，從OD260nm /OD280nm的比值中即可判斷樣品的純度。純的DNA的OD260nm /OD280nm應(yīng)為1.8，純的RNA應(yīng)為2.0。樣品中如含有雜雜蛋白及苯酚，OD260nm /OD280nm比值明顯下降。不純的樣品不能用紫外吸收法定量測(cè)定。對(duì)于純的樣品只要讀出260nm

21、的OD值，即可知含量。通常以1OD值相當(dāng)于50微克/毫升雙螺旋DNA，或40微克/毫升單雙螺旋DNA（或RNA，或20微克/毫升寡核苷酸計(jì)算。這個(gè)方法既快速又相當(dāng)準(zhǔn)確，而且不會(huì)浪費(fèi)樣品。五、核酸的沉降特性溶液中的核酸分子在引力場(chǎng)中可以沉降。不同構(gòu)象的核酸，蛋白質(zhì)及其它雜質(zhì)，在超速離心機(jī)的強(qiáng)大離心場(chǎng)中，沉降的速率差異很大，所以可以用超速離心法純化核酸或?qū)⒉煌瑯?gòu)象的核酸進(jìn)行分離，也可測(cè)定核酸的沉降系數(shù)與分子量。應(yīng)用不同介質(zhì)組成密度梯度進(jìn)行超離心分離核酸，效果更好。RNA分離常用蔗糖梯度。分離DNA時(shí)用得最多的是氯化銫梯度。應(yīng)用啡啶溴紅-氯化銫梯度平衡超離心，很容易將不同構(gòu)象的DNA，RNA及蛋白質(zhì)

22、分開。這個(gè)方法是目前實(shí)驗(yàn)中純化質(zhì)粒DNA最常用的方法。離心完畢后，離心管中各種成分的分布可以在紫外光照下顯得一清二楚（如圖），蛋白質(zhì)漂浮在最上面，RNA沉淀在底部，超螺旋DNA沉降較快，開環(huán)及線形DNA沉降較慢。六、凝膠電泳（一）瓊脂糖電泳以瓊脂糖為支持物。電泳的遷移率決定于以下因素：1、核酸分子大?。哼w移率與分子量對(duì)數(shù)成反比2、膠濃度：遷移率與膠濃度成反比。常用1%膠分離DNA3、DNA的構(gòu)向：一般條件下超螺旋DNA的遷移率最快，線形DNA其次，開環(huán)形最慢。但在膠中假如啡啶溴紅時(shí)，上述分布次序回發(fā)生改變4、電流：一般不大于5V/cm，在適當(dāng)?shù)碾妷合拢w移率與電流大小成正比5、堿基組成：有一定

23、影響，但不大6、溫度：430都可瓊脂糖凝膠電泳常用于分析DNA。由于瓊脂糖制品中往往帶有核糖核酸酶雜質(zhì)，所以用于分析RNA時(shí)，必須加入蛋白質(zhì)變性劑，如甲醛。電泳完畢后，將膠在熒光染料啡啶溴紅的水溶液中染色。DNA與啡啶溴紅結(jié)合后，經(jīng)紫外光照射，可發(fā)出紅-橙色可見光。0.1g的DNA即可用此法檢出，十分靈敏。（二）聚丙烯酰胺凝膠電泳以聚丙烯酰胺作為支持物。由于這種凝膠的孔徑比瓊脂糖凝膠的要小，所以可用于分析分子量小于1000bp的DNA片段，聚丙烯酰胺凝膠中不含Rnase，所以常用于RNA的分析。聚丙烯酰胺凝膠的核酸樣品，經(jīng)啡啶溴紅染色，在紫外光照下，發(fā)出的熒光很弱，所以濃度很低的核酸樣品不能用

24、此法檢出。四、核酸的變性、復(fù)性及雜交（一）變性指核酸雙螺旋區(qū)的氫鍵斷裂，變成單鏈，并不涉及共價(jià)鍵的斷裂。多核苷酸骨架上共價(jià)鍵（3，5-磷酸二酯鍵）的斷裂稱核酸的降解。降解引起核酸分子量的降低。引起核酸變性的因素主要有：溫度引起的熱變性；由酸堿度引起的酸堿變性；尿素是聚丙烯酰胺凝膠時(shí)測(cè)定DNA序列時(shí)常用的變性劑。當(dāng)將DNA的稀鹽溶液加熱到80100時(shí)，雙螺旋結(jié)構(gòu)即發(fā)生解體，形成無規(guī)線團(tuán)。其理化性質(zhì)也隨之發(fā)生改變：1、260nm區(qū)紫外吸收值升高，原因是堿基的暴露2、粘度降低，因?yàn)槭チ穗p螺旋結(jié)構(gòu)，把粘度的改變作為DNA變性的指標(biāo)3、浮力密度升高4、生物活性喪失DNA的變性的特點(diǎn)是爆發(fā)式的，變性作用

25、發(fā)生在一個(gè)很窄的溫度范圍內(nèi)。通常把DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半時(shí)的溫度稱該DNA的熔點(diǎn)或熔解溫度，用Tm表示。DNA的Tm值一般在7085之間。DNA的Tm大小與下列因素有關(guān)：1、DNA的均一性 均一性愈高的樣品，熔解過程愈是發(fā)生在一個(gè)很小的溫度范圍之內(nèi)。2、G-C含量 G-C含量越高高，Tm越高。這是因?yàn)镚-C對(duì)比A-T對(duì)更穩(wěn)定。所以測(cè)定Tm值即可推出G-C含量。其經(jīng)驗(yàn)公式為：G-C%=（Tm69.3）×2.443、介質(zhì)的離子強(qiáng)度 一般說離子強(qiáng)度較低的介質(zhì)中，DNA的熔解溫度較低，熔解溫度的范圍也很窄。而在離子強(qiáng)度較高的介質(zhì)中，情況相反。所以常在1mol/LnaCl中保存。（二）復(fù)性

26、定義：變性DNA在適當(dāng)條件下，分開的DNA單鏈重新締和為雙螺旋結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象。DNA復(fù)性的條件：1、有適當(dāng)?shù)年栯x子濃度 如鈉離子濃度0.01mol/L2、適當(dāng)?shù)腜H值，常用PH6.83、適當(dāng)?shù)臏囟龋?0）4、適當(dāng)?shù)腄NA濃度和恢復(fù)性質(zhì)時(shí)間（一） 核酸的雜交將不同來源的DNA放在試管里，經(jīng)熱變性后，慢慢冷卻，讓其復(fù)性。若這些異源DNA之間在某些區(qū)域有相同的序列，則復(fù)性時(shí)，會(huì)形成雜交DNA分子。DNA與互補(bǔ)的RNA之間也可發(fā)生雜交。以Southern印跡法為例，介紹DNA-DNA的雜交：將DNA樣品經(jīng)限制性內(nèi)切酶降解后，用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離。將膠浸泡在堿（NaOH）中使DNA進(jìn)行變性，然后將變性D

27、NA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜上（硝酸纖維素薄膜只吸附變性后的DNA），在80烤46小時(shí)，使DNA牢固地吸住在纖維素薄膜上。然后與放射性同位素標(biāo)記的變性后的DNA探針進(jìn)行雜交。雜交須在較高的鹽濃度及適當(dāng)?shù)臏囟龋ㄒ话?8）下進(jìn)行數(shù)小時(shí)或數(shù)十小時(shí)，然后通過洗滌除去未雜交的標(biāo)記物。將纖維素薄膜進(jìn)行放射自顯影。除DNA外，RNA也可用探針進(jìn)行雜交。第四節(jié)核酸的分離與含量測(cè)定一、核酸的提取、分離與純化核酸的分離純化是研究核酸的結(jié)構(gòu)、功能，開展基因工程的基礎(chǔ)對(duì)核酸的分離純化有兩個(gè)要求：1、盡可能保持核酸的完整性和天然結(jié)構(gòu)2、避免直接的污染。原因：1、在細(xì)胞中核酸大多數(shù)以核蛋白形式存在，脫氧核糖核蛋白（DNP）與

28、核糖核蛋白（RNP）往往是混雜在一起。2、細(xì)胞中，還有許多蛋白質(zhì)、糖、脂類（除核酸外）與核酸混雜在一起。3、核酸是大分子物質(zhì)，本身不穩(wěn)定，容易受熱，強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、機(jī)械張力的影響，核酸變性降解。4、在細(xì)胞中，還有DNase和RNase ，分別使DNA、RNA降解（一）DNA的分離純化1、材料選擇和處理根據(jù)分離純化目的要求，選擇合適材料1）如制備DNA制劑，選含DNA豐富的動(dòng)物組織2）從植物中分離純化DNA，選小麥組織在黑夜中培養(yǎng)35天生成黃化苗，以黃化苗為材料，容易破碎，干擾小。3）從細(xì)胞核細(xì)胞器中提取DNA，先分離所需的細(xì)胞核、細(xì)胞器。2、細(xì)胞的破碎1）動(dòng)物細(xì)胞或植物可采取研磨破碎法，研成勻漿（

29、低溫操作）2）細(xì)菌細(xì)胞肽聚糖不易破碎其破壁法有：（1）化學(xué)方法：去垢劑法：SDS（十二烷基硫酸鈉）酶解法：溶菌酶SDS作用：A：溶解膜蛋白及脂肪 B：溶解核蛋白上的蛋白使核蛋白體解聚（Pro與核酸分開）C：抑制DNA酶和RNA酶（2）物理方法：冰凍復(fù)融法：滲透壓碎裂法超聲波震動(dòng)法研磨法在破碎的細(xì)胞中要防止DNAse對(duì)DNA的降解，往往在提取過程中加入DNase的抑制劑。常用的抑制劑有：EDTA（乙二胺四乙酸鈉）、檸檬酸鈉（兩者都+能螯二價(jià)Mg2，降低DNAse的活性），SDS。3、DNP的分離在細(xì)胞中，DNA與蛋白質(zhì)形成核蛋白DNP，而DNP又和RNP混雜在一起，根據(jù)DNP與RNP在NaCL中的溶解度不同，可以把它們分離在低濃度（0.14M）NaCL中，RNP的溶解度大于DNP在高濃度（2M）NaCL中，RNP的溶解度小于DNP4、蛋白質(zhì)的去除1）有機(jī)溶劑法：氯仿異戊醇法（24/1）、苯酚法、苯酚氯仿法（1/1）2）蛋白水解酶法：在鏈霉菌中分離出來的光譜蛋白酶需進(jìn)口，可用胰蛋白酶代替。然后用有機(jī)溶劑將酶蛋白去掉5、RNA的去除1）RNase法，RNA的濃度為50100