1、第一章 蛋白質(Protein)蛋白質存在于所有的生物細胞中，是構成生物體最基本的結構物質和功能物質。蛋白質是生命活動的物質基礎，它參與了幾乎所有的生命活動過程。第一節概述一、蛋白質的定義蛋白質：是一切生物體中普遍存在的，由天然氨基酸通過肽鍵連接而成的生物大分子；其種類繁多，各具有一定的相對分子質量，復雜的分子結構和特定的生物功能；是表達生物遺傳性狀的一類主要物質。二、蛋白質在生命中的重要性早在1878年，思格斯就在反杜林論中指出：“生命是蛋白體的存在方式，這種存在方式本質上就在于這些蛋白體的化學組成部分的不斷的自我更新?！?可以看出，第一，蛋白體是生命的物質基礎；第二，生命是物質運動的特殊形

2、式，是蛋白體的存在方式；第三，這種存在方式的本質就是蛋白體與其外部自然界不斷的新陳代謝。現代生物化學的實踐完全證實并發展了恩格斯的論斷1.蛋白質是生物體內必不可少的重要成分蛋白質占干重人體中（中年人）人體 45% 水55%細菌 50%80% 蛋白質19%真菌 14%52% 脂肪19%酵母菌 14%50% 糖類1%白地菌50% 無機鹽7%2.蛋白質是一種生物功能的主要體現者（1）酶的催化作用（2）調節作用(多肽類激素)（3）運輸功能（4）運動功能（5）免疫保護作用(干擾素)（6）接受、傳遞信息的受體（7）毒蛋白3.外源蛋白質有營養功能，可作為生產加工的對象.三、蛋白質的組成1.元素組成蛋白質是一

3、類含氮有機化合物，除含有碳、氫、氧外，還有氮和少量的硫。某些蛋白質還含有其他一些元素，主要是磷、鐵、碘、碘、鋅和銅等。這些元素在蛋白質中的組成百分比約為：碳50氫7氧 23氮16% 硫03其他微量氮占生物組織中所有含氮物質的絕大部分。因此，可以將生物組織的含氮量近似地看作蛋白質的含氮量。由于大多數蛋白質的含氮量接近于16%，所以，可以根據生物樣品中的含氮量來計算蛋白質的大概含量蛋白質含量的測定：凱氏定氮法(測定氮的經典方法)優點：對原料無選擇性，儀器簡單，方法也簡單；缺點：易將無機氮(如核酸中的氮) 都歸入蛋白質中,不精確。一般，樣品含氮量平均在16%，取其倒數100/16=6.25，即為蛋白

4、質換算系數，其含義是樣品中每存在1g元素氮，就說明含有6.25g 蛋白質）；故：蛋白質含量=氮的量×100/16×6.25除了上法外，還有:紫外比色法雙縮脲法 Folin酚考馬斯亮蘭G250比色法（條件：蛋白質必須是可溶的）2.化學組成（兩種類型）單純蛋白質：水解為-氨基酸結合蛋白質=單純蛋白質+輔基第二節氨基酸化學一、氨基酸的結構與分類1.氨基酸的結構氨基酸是蛋白質水解的最終產物，是組成蛋白質的基本單位。從蛋白質水解物中分離出來的氨基酸有二十種，除脯氨酸和羥脯氨酸外，這些天然氨基酸在結構上的共同特點為：(1).與羧基相鄰的-碳原子上都有一個氨基，因而稱為-氨基酸(2).除

5、甘氨酸外,其它所有氨基酸分子中的-碳原子都為不對稱碳原子,所以：A.氨基酸都具有旋光性。B.每一種氨基酸都具有D-型和L-型兩種立體異構體。目前已知的天然蛋白質中氨基酸都為L-型。2.常見氨基酸的分類（1）按R基團的酸堿性分:中性AA酸性AA堿性AA（2）按R基團的電性質分:疏水性R基團AA不帶電荷極性R基團的AA帶電荷R基團的AA（3）按R基團的化學結構分:脂肪族AA芳香族AA雜環族AA3.構成蛋白質的20種氨基酸4.人體所需的八種必需氨基酸賴氨酸(Lys) 纈氨酸(Val) 蛋氨酸(Met)色氨酸(Try) 亮氨酸(Leu) 異亮氨酸(Ile)酪氨酸(Thr) 苯丙氨酸(Phe)嬰兒時期所

6、需: 精氨酸(Arg)、組氨酸(His)早產兒所需：色氨酸(Try)、半胱氨酸(Cys).幾種重要的不常見氨基酸在少數蛋白質中分離出一些不常見的氨基酸，通常稱為不常見蛋白質氨基酸。這些氨基酸都是由相應的基本氨基酸衍生而來的。其中重要的有4-羥基脯氨酸、5-羥基賴氨酸、N-甲基賴氨酸、和3,5-二碘酪氨酸等。這些不常見蛋白質氨基酸的結構如下二.氨基酸的重要理化性質1.一般物理性質常見氨基酸均為無色結晶,其形狀因構型而異(1) 溶解性：各種氨基酸在水中的溶解度差別很大，并能溶解于稀酸或稀堿中，但不能溶解于有機溶劑。通常酒精能把氨基酸從其溶液中沉淀析出。(2) 熔點：氨基酸的熔點極高，一般在200以

7、上。(3) 味感：其味隨不同氨基酸有所不同，有的無味、有的為甜、有的味苦，谷氨酸的單鈉鹽有鮮味，是味精的主要成分。(4) 旋光性：除甘氨酸外，氨基酸都具有旋光性，能使偏振光平面向左或向右旋轉，左旋者通常用（-）表示，右旋者用（+）表示。(5)光吸收：構成蛋白質的20種氨基酸在可見光區都沒有光吸收，但在遠紫外區(<220nm)均有光吸收。在近紫外區(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。n 酪氨酸的lmax275nm，e275=1.4x103;n 苯丙氨酸的lmax257nm，e257=2.0x102;n 色氨酸的lmax280nm，e280=5.6x103;2.

8、氨基酸的離解性質n 氨基酸在結晶形態或在水溶液中，并不是以游離的羧基或氨基形式存在，而是離解成兩性離子。在兩性離子中，氨基是以質子化(-NH3+)形式存在，羧基是以離解狀態(-COO-)存在。n 在不同的pH條件下，兩性離子的狀態也隨之發生變化3.氨基酸的等電點當溶液濃度為某一pH值時，氨基酸分子中所含的-NH3+和-COO-數目正好相等，凈電荷為0。這一pH值即為氨基酸的等電點，簡稱pI。在等電點時，氨基酸既不向正極也不向負極移動，即氨基酸處于兩性離子狀態。側鏈不含離解基團的中性氨基酸，其等電點是它的pK1和pK2的算術平均值：pI = (pK1 + pK2 )/2 同樣，對于側鏈含有可解離

9、基團的氨基酸，其pI值也決定于兩性離子兩邊的pK值的算術平均值。酸性氨基酸：pI = (pK1 + pKR-COO- )/2 鹼性氨基酸：pI = (pK2 + pKR-NH2 )/2 4.氨基酸的化學性質(1)與茚三酮的反應（顏色反應） 氨基酸與水合茚三酮共熱，發生氧化脫氨反應，生成NH3與酮酸。水合茚三酮變為還原型茚三酮。 加熱過程中酮酸裂解，放出CO2，自身變為少一個碳的醛。水合茚三酮變為還原型茚三酮。 NH3與水合茚三酮及還原型茚三酮脫水縮合，生成藍紫色化合物。反應要點A.該反應由NH2與COOH共同參與B.茚三酮是強氧化劑C.該反應非常靈敏，可在570nm測定吸光值D. 測定范圍：0

10、.550µg/ml E.脯氨酸與茚三酮直接生成黃色物質（不釋放NH3）應用：A.氨基酸定量分析（先用層析法分離）B.氨基酸自動分析儀：用陽離子交換樹脂，將樣品中的氨基酸分離，自動定性定量，記錄結果。(2)與甲醛反應反應特點A.為- NH2的反應B.在常溫，中性條件，甲醛與- NH2很快反應，生成羥甲基衍生物，釋放氫離子。應用：氨基酸定量分析甲醛滴定法（間接滴定）A.直接滴定，終點pH過高（12），沒有適當指示劑。B.與甲醛反應，滴定終點在9左右，可用酚酞作指示劑。C.釋放一個氫離子，相當于一個氨基（摩爾比1：1）D.簡單快速，一般用于測定蛋白質的水解速度。(3) 與2,4-二硝基氟苯

11、（DNFB）反應首先由Sanger應用，確定了胰島素的一級結構A.肽分子與DNFB反應，得DNP-肽B.水解DNP-肽，得DNP-N端氨基酸及其他游離氨基酸C.分離DNP-氨基酸層析法定性DNP-氨基酸，得出N端氨基酸的種類、數目(4)與異硫氰酸苯酯（PITC）的反應n 由Edman于1950年首先提出n 為- NH2的反應n 用于N末端分析，又稱Edman降解法n Edman （苯異硫氰酸酯法）氨基酸順序分析法實際上也是一種N-端分析法。此法的特點是能夠不斷重復循環，將肽鏈N-端氨基酸殘基逐一進行標記和解離。 肽鏈（N端氨基酸）與PITC偶聯，生成PTC-肽 環化斷裂：最靠近PTC基的肽鍵斷

12、裂，生成PTC-氨基酸和少 一殘基的肽鏈，同時PTC-氨基酸環化生成PTH-氨基酸 分離PTH-氨基酸 層析法鑒定n Edman降解法的改進方法- DNS-Edman降解法n 用DNS(二甲基萘磺酰氯)測定N端氨基酸n 原理DNFB法相同n 但水解后的DNS-氨基酸不需分離，可直接用電泳或層析法鑒定n 由于DNS有強烈熒光，靈敏度比DNFB法高100倍，比Edman法高幾到十幾倍n 可用于微量氨基酸的定量n 用Edman降解法提供逐次減少一個殘基的肽鏈n 靈敏度提高，能連續測定。n 多肽順序自動分析儀n 樣品最低用量可在5pmol5）與熒光胺的反應 - NH2的反應 氨基酸定量6）與5,5-雙

13、硫基-雙(2-硝基苯甲酸)反應 -SH的反應 測定細胞游離- SH的含量（7）其他反應 成鹽、成酯、成肽、脫羧反應第三節蛋白質的分子結構 蛋白質是由一條或多條多肽(polypeptide)鏈以特殊方式結合而成的生物大分子。 蛋白質與多肽并無嚴格的界線，通常是將分子量在6000道爾頓以上的多肽稱為蛋白質。 蛋白質分子量變化范圍很大, 從大約6000到1000000道爾頓甚至更大一.基本問題-肽 一個氨基酸的氨基與另一個氨基酸的羧基之間失水形成的酰胺鍵稱為肽鍵，所形成的化合物稱為肽。 由兩個氨基酸組成的肽稱為二肽，由多個氨基酸組成的肽則稱為多肽。組成多肽的氨基酸單元稱為氨基酸殘基。1.多肽n 在多

14、肽鏈中，氨基酸殘基按一定的順序排列，這種排列順序稱為氨基酸順序n 通常在多肽鏈的一端含有一個游離的a-氨基，稱為氨基端或N-端；在另一端含有一個游離的a-羧基，稱為羧基端或C-端。n 氨基酸的順序是從N-端的氨基酸殘基開始，以C-端氨基酸殘基為終點的排列順序。如上述五肽可表示為：Ser-Val-Tyr-Asp-Gln2.肽鍵 肽鍵的特點是氮原子上的孤對電子與羰基具有明顯的共軛作用。 組成肽鍵的原子處于同一平面。 肽鍵中的C-N鍵具有部分雙鍵性質，不能自由旋轉。 在大多數情況下，以反式結構存在。3.天然存在的重要多肽 在生物體中，多肽最重要的存在形式是作為蛋白質的亞單位。 但是，也有許多分子量比

15、較小的多肽以游離狀態存在。這類多肽通常都具有特殊的生理功能，常稱為活性肽。 如：腦啡肽；激素類多肽；抗生素類多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。二.蛋白質的一級結構1. 蛋白質的一級結構(Primary structure)包括：(1)組成蛋白質的多肽鏈數目.(2)多肽鏈的氨基酸順序，(3)多肽鏈內或鏈間二硫鍵的數目和位置。其中最重要的是多肽鏈的氨基酸順序，它是蛋白質生物功能的基礎。2.蛋白質的一級結構的測定蛋白質氨基酸順序的測定是蛋白質化學研究的基礎。自從1953年F.Sanger測定了胰島素的一級結構以來，現在已經有上千種不同蛋白質的一級結構被測定。(1) 測定蛋白質的一級結構的要求A.樣品必需純

16、（>97%以上）；B.知道蛋白質的分子量；C.知道蛋白質由幾個亞基組成；D.測定蛋白質的氨基酸組成；并根據分子量計算每種氨基酸的個數。E.測定水解液中的氨量，計算酰胺的含量。2)測定步驟多肽鏈的拆分：由多條多肽鏈組成的蛋白質分子，必須先進行拆分。幾條多肽鏈借助非共價鍵連接在一起，稱為寡聚蛋白質，如，血紅蛋白為四聚體，烯醇化酶為二聚體；可用8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍處理，即可分開多肽鏈(亞基).測定蛋白質分子中多肽鏈的數目：通過測定末端氨基酸殘基的摩爾數與蛋白質分子量之間的關系，即可確定多肽鏈的數目。 二硫鍵的斷裂：幾條多肽鏈通過二硫鍵交聯在一起?？稍诳捎?mol/L尿素或6mo

17、l/L鹽酸胍存在下，用過量的b-巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑保護生成的巰基，以防止它重新被氧化?？梢酝ㄟ^加入鹽酸胍方法解離多肽鏈之間的非共價力；應用過甲酸氧化法或巰基還原法拆分多肽鏈間的二硫鍵。巰基的保護測定每條多肽鏈的氨基酸組成，并計算出氨基酸成分的分子比；分析多肽鏈的N-末端和C-末端末端氨基酸的測定：多肽鏈端基氨基酸分為兩類，N-端氨基酸和C-端氨基酸。在肽鏈氨基酸順序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。末端氨基酸測定的主要方法有：A. 二硝基氟苯（DNFB）法B. 丹磺酰氯法:在堿性條件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以與N-端氨基酸的游離氨基作用，得到丹磺酰

18、-氨基酸。此法的優點是丹磺酰-氨基酸有很強的熒光性質，檢測靈敏度可以達到1´10-9mol。C. 肼解法：此法是多肽鏈C-端氨基酸分析法。多肽與肼在無水條件下加熱，C-端氨基酸即從肽鏈上解離出來，其余的氨基酸則變成肼化物。肼化物能夠與苯甲醛縮合成不溶于水的物質而與C-端氨基酸分離。D. 氨肽酶法：氨肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的N-端逐個的向里水解。根基不同的反應時間測出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數量，按反應時間和氨基酸殘基釋放量作動力學曲線，從而知道蛋白質的N-末端殘基順序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸殘基為N-末端的肽鍵速度最大。E. 羧肽酶法：羧肽酶是一種

19、肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的C-端逐個的水解。根基不同的反應時間測出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數量，從而知道蛋白質的C-末端殘基順序。目前常用的羧肽酶有四種：A,B,C和Y；A和B來自胰臟；C來自柑桔葉；Y來自面包酵母。羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸殘基；B只能水解Arg和Lys為C-末端殘基的肽鍵。多肽鏈斷裂成多個肽段，可采用兩種或多種不同的斷裂方法將多肽樣品斷裂成兩套或多套肽段或肽碎片，并將其分離開來。多肽的選擇性降解的方法有：A. 酶解法:胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜熱菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶B. 化學法：溴化氰水解法，它能選擇性地切割由甲硫氨酸的羧基

20、所形成的肽鍵。測定每個肽段的氨基酸順序。確定肽段在多肽鏈中的次序：利用兩套或多套肽段的氨基酸順序彼此間的交錯重疊，拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順序。確定原多肽鏈重二硫鍵的位置：一般采用胃蛋白酶處理沒有斷開二硫鍵的多肽鏈，再利用雙向電泳技術分離出各個肽段，用過甲酸處理后，將每個肽段進行組成及順序分析，然后同其它方法分析的肽段進行比較，確定二硫鍵的位置。三.蛋白質的空間結構1.蛋白質的二級結構蛋白質的二級(Secondary)結構是指肽鏈的主鏈在空間的排列,或規則的幾何走向、旋轉及折疊。它只涉及肽鏈主鏈的構象及鏈內或鏈間形成的氫鍵。主要有a-螺旋、b-折疊、b-轉角。(1). a-螺旋在a-螺旋中肽平

21、面的鍵長和鍵角一定,肽鍵的原子排列呈反式構型,相鄰的肽平面構成兩面角.多肽鏈中的各個肽平面圍繞同一軸旋轉，形成螺旋結構，螺旋一周，沿軸上升的距離即螺距為0.54nm,含3.6個氨基酸殘基；兩個氨基酸之間的距離0.15nm.肽鏈內形成氫鍵，氫鍵的取向幾乎與軸平行，第一個氨基酸殘基的酰胺基團的-CO基與第四個氨基酸殘基酰胺基團的-NH基形成氫鍵。蛋白質分子為右手a-螺旋。（2）b-折疊b-折疊是由兩條或多條幾乎完全伸展的肽鏈平行排列，通過鏈間的氫鍵交聯而形成的。肽鏈的主鏈呈鋸齒樁折疊構象。在b-折疊中，a-碳原子總是處于折疊的角上，氨基酸的R基團處于折疊的棱角上并與棱角垂直，兩個氨基酸之間的軸心距

22、為0.35nm.b-折疊結構的氫鍵主要是由兩條肽鏈之間形成的；也可以在同一肽鏈的不同部分之間形成。幾乎所有肽鍵都參與鏈內氫鍵的交聯，氫鍵與鏈的長軸接近垂直。b-折疊有兩種類型。一種為平行式，即所有肽鏈的N-端都在同一邊。另一種為反平行式，即相鄰兩條肽鏈的方向相反。（3）b-轉角在b-轉角部分，由四個氨基酸殘基組成.四個形成轉角的殘基中，第三個一般均為甘氨酸殘基彎曲處的第一個氨基酸殘基的-C=O 和第四個殘基的 N-H 之間形成氫鍵，形成一個不很穩定的環狀結構。這類結構主要存在于球狀蛋白分子中。）自由回轉沒有一定規律的松散肽鏈結構，但仍是緊密有序的穩定結構，通過主鏈間及主鏈與側鏈間氫鍵維持其構象

23、不同的蛋白質，自由回轉的數量和形式各不相同分兩類：緊密環連接條帶超二級結構和結構域（）超二級結構在蛋白質分子中，由若干相鄰的二級結構單元組合在一起，彼此相互作用，形成有規則的、在空間上能辨認的二級結構組合體。幾種類型的超二級結構：；超二級結構在結構層次上高于二級結構，但沒有聚集成具有功能的結構域（）結構域對于較大的蛋白質分子或亞基，多肽鏈往往由兩個或兩個以上相對獨立的三維實體締合而成三級結構。這種相對獨立的三維實體就稱結構域。 結構域通常是幾個超二級結構的組合，對于較小的蛋白質分子，結構域與三級結構等同，即這些蛋白為單結構域。 結構域一般由100200 個氨基酸殘基組成，但大小范圍可達 404

24、00 個殘基。氨基酸可以是連續的，也可以是不連續的 結構域之間常形成裂隙，比較松散，往往是蛋白質優先被水解的部位。酶的活性中心往往位于兩個結構域的界面上 結構域之間由“鉸鏈區”相連，使分子構象有一定的柔性，通過結構域之間的相對運動，使蛋白質分子實現一定的生物功能。 在蛋白質分子內，結構域可作為結構單位進行相對獨立的運動，水解出來后仍能維持穩定的結構，甚至保留某些生物活性 結構域與功能域的關系：有時一個結構域就是蛋白質的功能域，但不總是。包含一個但通常是多個結構域蛋白質的三級結構蛋白質的三級結構是指多肽鏈在二級結構的基礎上進一步盤旋、折疊，從而生成特定的空間結構。包括主鏈和側鏈的所有原子的空間排

25、布一般非極性側鏈埋在分子內部，形成疏水核，極性側鏈在分子表面蛋白質的四級結構許多蛋白質是由兩個或兩個以上獨立的三級結構通過非共價鍵結合成的多聚體，稱為寡聚蛋白。寡聚蛋白中的每個獨立三級結構單元稱為亞基。蛋白質的四級結構是指亞基的種類、數量以及各個亞基在寡聚蛋白質中的空間排布和亞基間的相互作用。如，血紅蛋白的四級結構得測定由佩魯茨1958年完成，其結構要點為： 球狀蛋白，寡聚蛋白，含四個亞基 兩條鏈，兩條鏈，22 鏈：141個殘基；鏈：146個殘基 分子量65 000 含四個血紅素輔基 親水性側鏈基團在分子表面，疏水性基團在分子內部蛋白質分子中的共價鍵與次級鍵一級結構二級結構超二級結構結構域三級

26、結構亞基四級結構ü 維系蛋白質分子的一級結構：肽鍵、二硫鍵ü 維系蛋白質分子的二級結構：氫鍵ü 維系蛋白質分子的三級結構：疏水相互作用力、氫鍵、范德華力、鹽鍵ü 維系蛋白質分子的四級結構：范德華力、鹽鍵a鹽鍵（離子鍵）b氫鍵c疏水相互作用力d 范德華力e二硫鍵f 酯鍵Ø 氫鍵、范德華力、疏水相互作用力、鹽鍵，均為次級鍵Ø 氫鍵、范德華力雖然鍵能小，但數量大Ø 疏水相互作用力對維持三級結構特別重要Ø 鹽鍵數量小Ø 二硫鍵對穩定蛋白質構象很重要，二硫鍵越多，蛋白質分子構象越穩定第四節蛋白質分子結構與功能的關系

27、一.蛋白質一級結構與功能的關系研究蛋白質一級結構與功能的關系主要是：研究多肽鏈中不同部位的殘基與生物功能的關系。進行這方面的研究常用的方法有：同源蛋白質氨基酸順序相似性分析、氨基酸殘基的化學修飾及切割實驗等。例1 鐮刀形貧血病l 患者血紅細胞合成了一種不正常的血紅蛋白（Hb-S）l 它與正常的血紅蛋白（Hb-A）的差別：僅僅在于鏈的N-末端第6位殘基發生了變化l （Hb-A）第6位殘基是極性谷氨酸殘基，（Hb-S）中換成了非極性的纈氨酸殘基l 使血紅蛋白細胞收縮成鐮刀形，輸氧能力下降，易發生溶血l 這說明了蛋白質分子結構與功能關系的高度統一性例2 一級結構的局部斷裂與蛋白質的激活體內的某些蛋白

28、質分子初合成時，常帶有抑制肽，呈無活性狀態，稱為蛋白質原.蛋白質原的部分肽鏈以特定的方式斷裂后，才變為活性分子.例：胰島素，在剛合成時，是一個比成熟的胰島素分子大一倍多的單鏈多肽，稱為前胰島素原 前胰島素原的N-末端有一段肽鏈，稱為信號肽. 信號肽被切去，剩下的是胰島素原。 胰島素原比胰島素分子多一段C肽，只有當C肽被切除后才成為有51個殘基，分A、B兩條鏈的胰島素分子單體.例3 同源蛋白同源蛋白：是指在不同有機體中實現同一功能的蛋白質.同源蛋白中的一級結構中有許多位置的氨基酸對所有種屬來說都是相同的，稱為不變殘基；其他位置的氨基酸稱可變殘基.不同種屬的可變殘基有很大變化.可用于判斷生物體間親

29、緣關系的遠近.例：細胞色素Cl 60 個物種中，有 27 個位置上的氨基酸殘基完全不變，是維持其構象中發揮特有功能所必要的部位，屬于不變殘基.l 可變殘基可能隨著進化而變異，而且不同種屬的細胞色素 C氨基酸差異數與種屬之間的親緣關系相關。親緣關系相近者，氨基酸差異少，反之則多（進化樹）.二.蛋白質的構象與功能的關系別構效應：又稱變構效應，是指寡聚蛋白與配基結合，改變蛋白質構象，導致蛋白質生物活性改變的現象.它是細胞內最簡單的調節方式.例：血紅蛋白的別構效應 一個亞基與氧結合后，引起該亞基構象改變 進而引起另三個亞基的構象改變 整個分子構象改變 與氧的結合能力增加第五節蛋白質的性質一.蛋白質的分

30、子大小蛋白質是分子量很大的生物分子，相對分子質量大于10 000.最高可達40 000 000（煙草花葉病毒）蛋白質相對分子質量的測定方法1.根據化學成分測定最小相對分子質量 此法首先利用化學分析方法測定蛋白質分子中某一特殊成分的百分含量 然后，假定蛋白質分子中該成分只有一個，據其百分含量可計算出最低相對分子質量： 最小相對分子質量（已知成分的相對分子、原子質量）/已知成分的百分含量 如果蛋白質分子中所含已知成分不是一個單位，則真實相對分子質量等于最小相對分子質量的倍數。2.超離心法 在60 00080 000r/min的高速離心力作用下，蛋白質分子會沿旋轉中心向外周方向移動 用光學方法測定界

31、面移動的速度即為蛋白質的離心沉降速度 蛋白質的沉降速度與分子大小和形狀有關 沉降系數是溶質顆粒在單位離心場中的沉降速度，用S表示。 一個S單位，為1×10-13秒 相對分子質量越大，S值越大 蛋白質的沉降系數：1200S由沉降系數S可根據斯維得貝格Svedberg方程計算蛋白質分子的相對分子質量： M=RST/D1i R：氣體常數 T：絕對溫度 D：擴散系數：溶劑的密度3.凝膠過濾法 凝膠過濾所用介質為凝膠珠，其內部為多孔網狀結構 一定型號的凝膠網孔大小一定，只允許相應大小的分子進入凝膠顆粒內部，大分子則被排阻在外 洗脫時大分子隨洗脫液從顆粒間隙流下來，洗脫液體積?。恍》肿釉陬w粒網狀

32、結構中穿來穿去，歷程長，后洗脫下來，洗脫體積大 測定蛋白質分子量一般用葡聚糖，商品名：Sephadex 測得幾種標準蛋白質的洗脫體積Ve 以相對分子質量對數（logM）對Ve作圖，得標準曲線 再測出未知樣品洗脫體積Ve 從標準曲線上可查出樣品蛋白質的相對分子質量4.SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法 SDS:十二烷基硫酸鈉，變性劑 普通蛋白質電泳的泳動速率取決于荷質比（凈電荷、大小、形狀） 用SDS和巰基乙醇（打開二硫鍵）處理 蛋白質變性（肽鏈伸展）并與SDS結合，形成SDS-蛋白質復合物 不同蛋白質分子的均帶負電（SDS帶負電）；且荷質比相同（蛋白質分子大，結合SDS多；分子小，結合SDS少） 不

33、同蛋白質分子具有相似的構象 用幾種標準蛋白質相對分子質量的對數值對它們的遷移率作圖 測出待測樣品的遷移率 從標準曲線上查出樣品的相對分子質量影響遷移率的主要因素 凝膠的分子篩效應對長短不同的棒形分子會產生不同的阻力主要因素 凝膠的濃度和交聯度 同一電泳條件下，分子小，受阻小，游動快，遷移率大。相對分子質量大者，遷移率小優點：快速，樣品用量少，可同時測幾個樣品缺點：誤差大，約為±10（誤差主要來源于遷移距離的測量誤差）此方法只能測得亞基肽鏈的相對分子質量二. 蛋白質的兩性離解和電泳現象 蛋白質與多肽一樣，能夠發生兩性離解，也有等電點。在等電點時(Isoelectric point pI

34、)，蛋白質的溶解度最小，在電場中不移動。 在不同的pH環境下，蛋白質的電學性質不同。在等電點偏酸性溶液中，蛋白質粒子帶負電荷，在電場中向正極移動；在等電點偏堿性溶液中，蛋白質粒子帶正電荷，在電場中向負極移動。這種現象稱為蛋白質電泳(Electrophoresis)。 蛋白質在等電點pH條件下，不發生電泳現象。利用蛋白質的電泳現象，可以將蛋白質進行分離純化。三.蛋白質的膠體性質 由于蛋白質的分子量很大，它在水中能夠形成膠體溶液。蛋白質溶液具有膠體溶液的典型性質，如丁達爾現象、布郎運動等。 由于膠體溶液中的蛋白質不能通過半透膜，因此可以應用透析法將非蛋白的小分子雜質除去。四.蛋白質的沉淀作用 蛋白

35、質膠體溶液的穩定性與它的分子量大小、所帶的電荷和水化作用有關。 改變溶液的條件，將影響蛋白質的溶解性質 在適當的條件下，蛋白質能夠從溶液中沉淀出來。1.可逆沉淀(1)在溫和條件下，通過改變溶液的pH或電荷狀況，使蛋白質從膠體溶液中沉淀分離。(2) 在沉淀過程中，結構和性質都沒有發生變化，在適當的條件下，可以重新溶解形成溶液，所以這種沉淀又稱為非變性沉淀。(3)可逆沉淀是分離和純化蛋白質的基本方法，如等電點沉淀法、鹽析法和有機溶劑沉淀法等。2.不可逆沉淀(1)在強烈沉淀條件下，不僅破壞了蛋白質膠體溶液的穩定性，而且也破壞了蛋白質的結構和性質，產生的蛋白質沉淀不可能再重新溶解于水。(2)由于沉淀過

36、程發生了蛋白質的結構和性質的變化，所以又稱為變性沉淀。(3)如加熱沉淀、強酸堿沉淀、重金屬鹽沉淀和生物堿沉淀等都屬于不可逆沉淀。五.蛋白質的變性蛋白質的性質與它們的結構密切相關。某些物理或化學因素，能夠破壞蛋白質的結構狀態，引起蛋白質理化性質改變并導致其生理活性喪失。這種現象稱為蛋白質的變性.變性蛋白質通常都是固體狀態物質，不溶于水和其它溶劑，也不可能恢復原有蛋白質所具有的性質。所以，蛋白質的變性通常都伴隨著不可逆沉淀。引起變性的主要因素是熱、紫外光、激烈的攪拌以及強酸和強堿等。六.蛋白質的紫外吸收大部分蛋白質均含有帶芳香環的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。這三種氨基酸的在280nm 附近有最大吸收

37、。因此，大多數蛋白質在280nm 附近顯示強的吸收。利用這個性質，可以對蛋白質進行定性鑒定。七.蛋白質的顏色反應1.雙縮脲反應：兩分子雙縮脲與堿性硫酸銅作用，生成粉紅色的復合物含有兩個或兩個以上肽鍵的化合物，能發生同樣的反應肽鍵的反應，肽鍵越多顏色越深受蛋白質特異性影響小蛋白質定量測定；測定蛋白質水解程度2.米倫氏反應酪氨酸的顯色反應（酚羥基反應）米倫試劑為硝酸、亞硝酸、硝酸汞、亞硝酸汞的混合物蛋白溶液中，加入米倫試劑，產生白色沉淀，加熱后變成紅色3.乙醛酸反應在蛋白質溶液中加入HCOCOOH，將濃硫酸沿管壁緩慢加入，不使相混，在液面交界處，即有紫色環形成色氨酸的反應（吲哚環的反應）鑒定蛋白質中是否含有色氨酸明膠中不含色氨酸4.坂口反應精氨酸的反應（胍基的反應）精氨酸與-萘酚在堿性次氯酸鈉（或次溴酸鈉）溶液中發生反應，產生紅色產物鑒定蛋白質中是否含有精氨酸定量測定精氨酸5.福林試劑反應酪氨酸、色氨酸的反應（還原反應