1、化合物黃酮提取以及檢測方法的研究黃酮類化合物是廣泛存在于自然界的一大類化合物, 在銀杏葉、山楂、杜仲、山香圓葉、水芹、竹葉、黃芪、丹參等植物中均有檢出。到目前為止, 已經發現有5000 多種植物中含有黃酮類和異黃酮類化合物1。黃酮類化合物的結構特點是具有C6- C3- C6 的基本骨架,根據中間三碳鏈的氧化程度、B 環( 苯基) 連接位置( 2-或3- 位) 以及三碳鏈是否呈環狀等特點, 分為許多不同類型: 包括黃酮、黃酮醇、二氫黃酮、二氫黃酮醇、異黃酮、二氫異黃酮、查爾酮等化合物2。現代研究證明黃酮類化合物是重要的抗氧化劑, 其生理作用是多種多樣的, 例如蘆丁、槲皮素等能夠增強心臟收縮; 杜

2、鵑素具有止咳祛痰作用; 黃芩苷具有抗菌消炎、抑制腫瘤細胞作用; 水飛薊素具有保肝作用等3; 此外, 黃酮類化合物還有降血脂、止血、抑制血小板聚集等多種藥理作用。正是其上述生物活性引起了人們的廣泛重視, 對該類化合物的研究已成為國內外醫藥界研究的熱門課題, 是一類具有廣泛開發前景的天然藥物4。黃酮類化合物在人體不能直接合成, 只能從食品中獲得。主要是作為食品添加劑或直接應用于食品中增加其保健作用。例如茶多酚在功能食品中的應用主要是以茶葉及其提取物的形式添加到食品中。茶多酚具有抗疲勞、抗輻射、抗衰老等功能特性, 茶葉具有獨特的色、香、味、形, 能使食品增香、調味、著色, 因此茶多酚以茶葉的形式在食

3、品中的應用十分廣泛。近年來科學家都積極關注從植物體中提取純度高、活性強的天然黃酮成分, 并進一步將其加工成有特異功能的保健食品和藥品等產品。1 黃酮類化合物的提取方法1.1 有機溶劑提取法甲醇和乙醇是最常用的黃酮類化合物提取溶劑,高濃度的醇( 如90 %左右) 適宜于提取苷元, 60 %左右濃度的乙醇或甲醇水溶液適宜于提取苷類。田呈瑞5采用索氏提取法, 利用乙醇提取銀杏葉黃酮, 通過單因素試驗和正交試驗, 確定乙醇提取銀杏葉總黃酮的最佳條件為: 銀杏葉粉碎至50 目60 目, 以70 %乙醇按照液固比61 的比例, 于80 條件下提取2 次, 每次1 h,銀杏葉總黃酮提取率可達87.6 %。此

4、外, 歐美國家采用的主要溶劑法工藝有: 醇(酮)浸提- 鹵代烴萃取- 酮/銨鹽萃取法、酮浸提- 氨水沉淀- 混合酮萃取法、酮浸提-綜述154食品研究與開發2008 年1 月第29 卷第1 期鹵代烴萃取- 鉛化物沉淀法和醇(酮)浸提- 甲苯/丁醇萃取樹脂法6。該工藝采用中等溫度50 60 浸泡, 雜質較少, 經濃縮、水析可除去烷基酚等脂溶性物質, 用CCl4 等非極性溶劑萃取除去蠟質、葉綠素等脂溶性雜質; 調節pH89 或Pb( OH) 2 沉降, 可除去原花青素、蛋白質、高分子單寧等雜質, 加入( NH4) 2SO4 等鹽, 增加相密度, 有利于C4- C6 酮和醇萃取有效成分和減少乳化現象,

5、 改善分層, 提高有效成分的萃取率7。1.2 微波提取法微波加熱是透入內部的能量被物料吸收置換成熱能對物料的加熱, 形成獨特的物料受熱方式, 具有均勻性的特點, 同時具有反應高效性和強選擇性等特點, 而且操作簡便, 副產物少, 提取率高及產物純度高等優點。本法多用在藥材的浸出, 在黃酮類化合物的提取上取得了良好的效果。段蕊8等人對微波法提取銀杏葉中黃酮類物質進行研究, 用175 W 微波強度處理5 min后, 以體積分數80 %的乙醇, 在70 提取1 h, 得到提取物的黃酮類物質質量濃度比未經微波處理的高出18.8 %。此外李嶸與金美芳9在以水為介質的條件下,對銀杏葉進行微波處理, 提取效果

6、與傳統方法對照, 表明此方法提取率高, 省溶劑, 大大提高了提取效率。實驗方法是稱取100 g 銀杏葉絲, 加160 mL 蒸餾水, 微波解凍處理5 min 及15 min, 提取液以440 mL60 %乙醇,55 回流提取。結果表明, 微波處理后進行乙醇水浸提比同樣方法未用微波處理可以提高銀杏葉中有效成分的提取率達22.6%, 而且大大縮短了提取所需時間。1.3 超臨界萃取法超臨界流體萃取是利用超臨界流體在臨界壓力和臨界溫度附近具有的特殊性能作為溶劑進行萃取的一門科學, 最常用的超臨界流體為CO2。應用CO2- SPE 技術提取分離黃酮類物質, 具有萃取速度快, 效率高, 操作簡單等特點,

7、產品中沒有殘留有機溶劑, 與傳統的萃取分離工藝相比優勢是明顯的。此外, 超臨界CO2 萃取較易與其它先進技術聯用, 成為新型而有效的分離分析技術。孫婷10利用超臨界CO2 萃取法從銀杏葉中提取黃酮類化合物, 確定了超臨界流體萃取的最佳條件: 壓力為20MPa, 萃取罐的溫度為40 , 流量為14 mL/min,萃取時間為2 h, 在此條件下測得總黃酮的含量為29.1 %, RSD 為3.1%。張玉祥11通過正交試臉, 確定最優化的提取工藝是: 20 MPa 的壓力下, 夾帶劑15 %,50 萃取40 min, 含量測定顯示, CO2 超臨界流體萃取法能有效萃取銀杏葉中的總黃酮和總內酯, 含量高

8、于歐洲( EGb761) 的質量標準。游海等人12在提取銀杏葉中的黃酮類化合物藥用活性成分的實驗中, 確定了實驗最佳條件: 萃取壓力12 665.6 kPa, 萃取溫度為45 ,萃取時間為30 min45 min, 分離壓力為6 586.1 kPa, 其中黃酮含量達28%以上。1.4 酶浸漬萃取法最近幾年, 隨著酶技術的快速發展, 科學工作者充分利用了酶的特性發展了新的提取方法。酶浸漬法是指在黃酮提取過程中, 通過加入恰當的酶發生轉糖反應和酶解反應而使產品黃酮得率和含量大大提高的新興技術。傳統的水提取只能提取水溶性黃酮, 致使類黃酮得率和含量過低; 此時如選用恰當的酶加入, 不僅可以將油溶性的

9、類黃酮轉化為易溶于水的糖苷類而利于提取, 而且還可通過酶反應將植物組織分解, 使提取傳質阻力減小; 另外也可使提取液中的雜質分解去除, 從而簡化后續分離純化工序。并且其提取條件溫和, 有利于黃酮類活性保護, 且成本低、安全4。1.5 超聲波輔助提取法用超聲波法提取黃酮類物質, 是目前比較新的方法。其原理主要是利用超聲波在液體中的空化作用加速植物有效成份的浸出提取。另外,還利用其次效應,如機械振動, 擴散, 擊碎等, 使其加速被提取成份的擴散, 釋放。超聲波提取法大大縮短了提取時間, 提高了有效成分的提取率、原料的利用率。吳傳茂13等用超聲波振蕩法提取大豆和豆豉中的大豆異黃酮苷元, 其提取方法最

10、佳方案是: 樣品中加入100 %乙醇300 mL, 超聲振蕩30 min, 通過檢測得出大豆中大豆黃素的含量為106.5 g/g, 染料木黃酮的含量為155.1 g/g; 豆豉中大豆黃素的含量為312.8 g/g, 染料木黃酮的含量為555.6 g/g。王延峰14等人研究了銀杏葉黃酮的超聲提取法, 并與連續熱回流中的索氏提取作了比較研究, 最佳操作條作為超聲波頻率40 kHz, 處理時間10 min,靜置時間12 h, 結果表明超聲波法優于索式提取法。2 黃酮類物質的測定方法2.1 分光光度法黃酮類化合物多采用硝酸鋁比色法測定。其基本原理是以蘆丁為標準品, Al( NO3) 3 絡合體系顯色,

11、 全波段掃描在510 nm 處有最大吸收峰, 測定其吸光度, 以此來計算含量。羅憲堂15等人利用該法測定了山香圓葉中的黃酮類成分的含量, 但硝酸鋁比色法專一性較差, 測定受處理過程顏色變化的影響。研究人員對此法進行了多項改進以提高其準確度。尉芹16等人在測定杜仲總黃酮的實驗中認為綠原酸是主要干擾因素, 他們采用紙層析法將樣品中的黃酮與綠原酸分離后, 再進行測定, 從而提高了測定的準確度。劉佳佳17等用硼綜述1552008 年1 月食品研究與開發第29 卷第1 期酸- 檸檬酸比色法測定了銀杏葉黃酮的含量。徐燕18以黃芩苷為對照品, 采用雙波長分光光度法測定黃芩總黃酮含量。另外, 周榮琪19將過濾

12、法應用于竹葉黃酮測定中, 并對濾紙對于黃酮類物質的吸附進行了校對, 發現濾紙對黃酮類物質吸附甚微, 此方法應用于竹葉黃酮體系大大提高了測定穩定性, 且準確度較高, 重現性良好。2.2 紙色譜法紙色譜用于黃酮類分析選擇性和重現性較差, 一般作為定性檢測。余戟20采用高于臨界膠束濃度( CMC)的十二烷基硫酸鈉( SDS) , 溴化十二烷基甲基卞胺水溶液作展開劑, 通過紙色譜法分離和檢測桑色素、楊梅黃素等8 種黃酮苷和苷元, 發現了適宜于分離其黃酮苷類的展開體系。2.3 薄層色譜法( TLC)薄層色譜又叫薄板層析, 是色譜法中的一種, 是快速分離和定性分析少量物質的一種很重要的實驗技術, 屬固-

13、液吸附色譜, 它兼備了柱色譜和紙色譜的優點, 一方面適用于少量樣品( 1 g, 甚至0.01 g) 的分離; 另一方面在制作薄層板時, 把吸附層加厚加大, 因此, 又可用來精制樣品。此法具有設備簡單、操作方便、分離速度快等特點, 但離線操作使分辯率和重現性等不如高效液相色譜法和氣相色譜法, 常被作為定性和半定量的手段。固定相一次性使用, 樣品無需復雜處理, 分離物的性質不受限制, 應用廣泛; 可同時平行分離多個樣品, 測試速度快, 所需溶劑量少, 選擇范圍寬,并有不同展開方式, 有利于不同性質的物質分離; 此方法可以在同一色譜板上可根據組分性質選擇不同顯色劑或檢測方法進行定性或定量; 薄層色譜

14、圖像可提供原始彩色圖像, 不僅便于保存原始圖像, 而且可以提供較多信息, 直觀性、可比性均較好都是此法的獨特之處4。2.4 極譜法極譜分析是在特殊條件下進行電解分析, 其特殊性在于采用了一個面積很大的參比電極和一個面積很小的滴汞電極進行電解。孫仕萍21等為了測定保健食品中的黃酮含量, 探討用單掃示波極譜法測定總黃酮含量的快速方法, 以蘆丁為對照品, 建立了良好的直線關系。2.5 氣相色譜法氣相色譜法( GC) 具有進樣量少、高靈敏度、高選擇性、高特異性等優點; 但需樣品需要衍生, 步驟較為復雜, 耗時長, 且儀器較為昂貴, 從而限制該法推廣應用。Liggins 等22采用毛細管- 質聯法測定8

15、0 余種蔬菜和堅果中大豆黃素和染料木素, 其中36 種含有被測物質, 而大豆中大豆黃素和染料木素總含量達2 g/kg。孫艷梅23選取SE- 30 毛細管柱, 在柱溫為恒溫260 時,利用氣相色譜法, 進行了大豆- 葡萄糖苷酶水解大豆異黃酮糖苷的研究, 確定黃豆苷元含量工作曲線方程為Y=71 519X- 85 913, X 為黃豆苷元的含量( g/L) , 相關系數R2=0.993 7。2.6 高效液相色譜法( HPLC)HPLC 分析黃酮類化合物, 正相系統一般采用乙烷或異辛烷等體系為流動相, 以極性較大的乙醇、丙醇、乙腈等有機溶劑調節。反相體系則一般優先選擇甲醇/水及乙腈/水體系為流動相,

16、還需要加入酸調節pH,抑制解離, 克服拖尾現象。為了提高分離度需要梯度洗脫, 多用C18 柱分離。胡芳弟24以甲醇- 水為流動相, 梯度洗脫, 在254 nm 檢測波長下測定黃芪中黃芪甲苷和2 個黃酮類化合物含量。劉斌25建立了苦參湯有效部位中4 種黃酮類成分的HPLC 含量測定方法。此外鄭瑩26等人使用反相高效液相色譜法對三七葉中的黃酮類化合物進行了含量測定。其方法為: 使用ZORBAX Extend C8 柱( 250 mm×4.6 mm, 5 m) , 流動相為甲醇-0.15 %乙酸水溶液( 3565) , 流速1.2 mL/min, 檢測波長268 nm, 柱溫25 。實驗結

17、果如下: 山柰酚- 3- O- BD-半乳糖葡萄糖苷與槲皮素- 3- O- B- D- 半乳糖葡萄糖苷在進樣量0.5 g20 g 范圍內均有良好的線性關系, 相關系數r2 皆為0.999 9。池靜端27等人用反相高效液相色譜法測定了銀杏葉中6 種黃酮成分即槲皮素、異鼠李素、山萘酚、白果黃素、銀杏黃銀杏黃素、西阿多黃素。色譜柱為ZORBAX ODS 柱, 流動相: 甲醇以及THF- H2O- HCOOH( 34651) , 梯度洗脫, 流速:1.0 mL/min, 檢測波長: 350nm, 線性范圍0.10g2.57g,相關系數2= 0.999 40.999 8, 回收率98.0 %102.0

18、%。2.7 液相色譜與質譜聯用法液相色譜- 質譜( LC-MS) 成為現代實驗室一種確定的分析工具, 是由于它相對于通常的檢測方式, 能提供更優越的選擇性和更低的檢測限, 對混合物的分析有很高的靈敏度和選擇性以及廣泛的適用性, 可大大縮短分析時間, 減少原料的浪費。馬強28等人采用高效液相色譜與電噴霧質譜聯用技術研究了紅車軸草中的異黃酮類化合物。實驗采用反相C18 色譜柱, 二元線性梯度洗脫, 分離并檢測了紅車軸草中的14 種異黃酮類化合物; 通過與電噴霧質譜聯用獲得了相應化合物的分子量信息, 并利用質譜的源內碰撞誘導解離技術鑒定這些化合物的可能結構。董淮海29等人應用高效液相色譜- 電噴霧質

19、譜聯用法, 直接對大豆胚芽的70 %乙醇室溫提取液進行檢測。根據各色譜峰的質譜特征,綜述156食品研究與開發2008 年1 月第29 卷第1 期在室溫提取液中鑒定出9 種異黃酮, 7 種A 組皂苷,4 種B 組皂苷和2 種E 組皂苷。肖貽菘30等人使用液相色譜- 質譜聯用技術對苦竹葉中的黃酮類化合物進行了分析。結果證明對于復雜天然產物的定性定量分析, 高效液相色譜- 電噴霧質譜( HPLC/ESI-MS)聯用分析法是一種方便快捷有效的方法。2.8 毛細管電泳法毛細管電泳以高效、快速、進樣量少、重現性好、不易污染等優點, 近幾年用于分析天然產物得到較大的發展。陳剛31等人用毛細管電泳電化學檢測法

20、測定了葛根和葛藤中葛根素、大豆甙元和蘆丁含量。以碳圓盤電極為檢測電極, 電極電位為0.90 V( VS.SCE) , 在50 mmol/L 硼酸鹽緩沖液( pH=9.0) 中, 使用長40 cm 熔融石英毛細管。當分離電壓為9 kV, 上述三組分在12 min 內完全分離。此外, 吳婷32等人用毛細管電泳-電化學檢測( CE- ED) 法同時測定了益母草及3 種益母草沖劑中的根皮苷、橙皮素、蘆丁、山奈酚、洋芹素和槲皮素6 種黃酮類化合物的含量。采用300 m 碳圓盤電極為工作電極, 檢測電位為+0.95 V( VS.SCE) ,在80 mmol/L 的Na2B4O7- H3BO3 ( pH=8

21、.7) 的運行緩沖液中, 上述各組分在20 min 內能完全分離。3 結語黃酮類化合物的主要提取方法是有機溶劑提取法、超聲波輔助提取法、微波提取法、超臨界CO2 萃取法、酶浸漬萃取法。超臨界萃取法速度快、操作簡單, 產品無溶劑殘留; 超聲波輔助提取無需加熱, 對有效成分具有保護作用。在提取某些中草藥黃酮類成分時, 可以將二者合理地結合利用。測定方法有比色法、薄層色譜法、高效液相色譜法、高效液相色譜- 質譜聯用法、以及毛細管電泳法。比色法適于測定總黃酮, 但不適用于單一成分的測定。高效液相色譜是測定黃酮類化合物的有效方法。它克服了傳統定量方法繁瑣、費時、分離度欠佳以及GC 法的拖尾現象或制成相應

22、衍生物操作繁瑣等缺點, 分離效率高, 在該類化合物中的應用日趨增多。高效液相色譜- 質譜聯用法為黃酮類化合物的指紋圖譜的建立提供了高效準確的方法。毛細管電泳以高效、快速、進樣量少、節省溶劑、重現性好、不易污染等優點, 近幾年在黃酮類化合物的分析中得到了較大的發展。由于黃酮類化合物具有降壓、降血脂、鎮痛、抑制血小板聚集、抗骨質舒松、抗心律失常、抗過敏及抗缺氧等多種藥理及保健作用, 而且黃酮類化合物在人體不能直接合成, 只能從食品中獲得, 所以近年來科學家都積極關注從植物體中提取純度高、活性強的天然黃酮成分。因此, 對黃酮類化合物的提取以及測定方法的研究具有廣泛的前景。參考文獻:1 蔡健, 華景清

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