1、試劑及配制LB培養(yǎng)基:胰蛋白月東酵母提取物(3)LB/IPTG/Xgal平板：1LLB培養(yǎng)基+15g瓊脂粉，高壓滅菌，冷卻至70c以下，加入1mlIPTG/Xgal,立即鋪板，4c避光保存。(4)頂層瓊脂糖凝膠:胰蛋白月東10g酵母提取物5gNaCl5gMgCl2.6H2O1g瓊脂糖7g溶于適量去離子水中，至總體積為1L。高壓滅菌，分裝為50ml/份，室溫保存，使用時于微波爐內(nèi)融化。2XM9鹽：Na2HPO412gKH2PO46gNaCl1gNH4Cl2g溶于適量去離子水中，至終體積為1L。(6)小型平板：500ml2XM9鹽500ml3%瓊脂粉20ml20%葡萄糖2ml1MMgSO40.1m

2、l1MCaCl21ml硫胺素(10mg/ml)在混合之前，將上述成分分別高壓滅菌并冷卻至70c以下，葡萄糖和硫胺素采用過濾除菌。平板儲存于4o(7)封閉緩沖液：0.1MNaHCO3(PH8.6)5mg/mlBSA0.02%NaN3過濾除菌，儲存于4C。(8)TBS:篩選多肽(2)NaCl溶于去離子水，至IPTG/Xgal:稱取1.25gIPTG,5g1L,高壓滅菌,4c保存。1.0gXgal,溶于二甲基甲酰胺，至總體積25ml,-20c避光保存。(1)10g5g50mMTris-HCl(PH7.5)150mMNaCl高壓滅菌，室溫儲存。(9)PEG/NaCl:20%(w/v)聚乙二醇-8000

3、2.5MNaCl高壓滅菌，室溫儲存。(10)碘化物緩沖液：10mMTris-HCl(PH8.0)1mMEDTA4MNaI室溫避光保存。操作步驟：1 .第一天(1)以0.1MNaHCO(PH8.6)制備100科g/ml的靶分子溶液。如果需要穩(wěn)定靶分子，可以用含有金屬離子的相似離子強度緩沖液。(2)在每孔內(nèi)加入1.5ml靶分子溶液，重復(fù)渦旋直至表面完全濕潤(這一步要多注意，盡量避免溶液形成液珠)。(3)在濕盒中，4c溫和振蕩孵育過位。4c保存于濕盒中備用。(4)二天(4)將ER2537(滴度測定時用來鋪板的細菌培養(yǎng)物)接種至10mlLB培養(yǎng)基中。如果是在同一天擴增洗脫的噬菌體，也可以將ER2537

4、過夜培養(yǎng)物接種于含有20mlLB培養(yǎng)基的250ml錐形瓶中(比例為1:100)。37c劇烈振搖。(5)將平皿反扣在潔凈的紙巾上，去除包被液，加滿封閉液，4c孵育至少1h。(6)去除包被液。用TBST(TBS+0.1%Tween-20)快速洗滌6次。反復(fù)旋轉(zhuǎn)確保孔底及孔側(cè)面都被洗滌。按照步驟5的方法去除洗滌液(也可利用自動洗板機洗滌)。洗滌要迅速，避免平皿干燥。(注意每次更換紙巾，以避免交叉污染)。(7)用1mlTBST稀釋4X1010噬菌體(10“原庫)， 加至包被后的平皿內(nèi)， 室溫下輕緩搖動10-60min。(8)以步驟5的方法去除未結(jié)合的噬菌體。(9)以步驟6的方法用TBST洗滌板子10次

5、，每次換用潔凈的紙巾，避免交叉污染。(10)用1ml的洗脫緩沖液洗脫結(jié)合的噬菌體。洗脫液可以是含有配體(0.1-1mM)的TBS,或是含有靶蛋白(100g/ml)的TBS以和固化在平皿上的靶蛋白競爭結(jié)合噬菌體。室溫下輕緩搖動10-60min。將洗脫液轉(zhuǎn)入微量離心管中。(10a)或使用通用緩沖液，0.2M甘氨酸-鹽酸(PH2.2),1mg/mlBSA。輕緩搖動不超過10min,將洗脫液轉(zhuǎn)入微量離心管中，以150dl1MTris-HCl(PH9.1)中和。(11)取小量洗脫液(1)測定滴度， 如果有必要， 可將第一輪或第二輪測定滴度的噬斑進行測序(見后續(xù)操作)。(未用的洗脫物可4c保存過夜，第二天

6、進行擴增。在這種情況下，用LB過夜培養(yǎng)ER2537,第二天，用LB培養(yǎng)基以1:100將該培養(yǎng)物稀釋至20ml,加入未擴增的洗脫液，在250ml的錐形瓶內(nèi)，37c劇烈振搖孵育4.5h,進入步驟13)。(12)將剩余的洗脫物進行擴增：將洗脫物加入20mlER2537培養(yǎng)物中(對數(shù)早期)，37c劇烈振搖孵育4.5h。(13)將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入微量離心管中，4C,10000轉(zhuǎn)離心10min,將上清轉(zhuǎn)入新的離心管中，再次離心。(14)將80%勺上清轉(zhuǎn)入新的離心管中，加入1/6體積的PEG/NaCl。4c沉淀噬菌體至少60min或過夜。(5)第三天(15) 4C,10000轉(zhuǎn)離心PEG勺沉淀物15min,傾去上

7、清，再次離心，吸去多余的上清。(16)用1mlTBS懸浮沉淀物并轉(zhuǎn)入微量離心管中，4c離心5min使殘留的細胞沉淀。(17)將上清轉(zhuǎn)入新的離心管中，用1/6體積的PEG/NaCl再次進行沉淀，冰上孵育15-60min。4c離心10min,棄上清，再次短暫離心，用微量槍頭吸去殘留的上清。(18)用200“TBS,0.02%NaN3懸浮沉淀物，離心1min,將上清轉(zhuǎn)入新管中，即為擴增的洗脫液。(19)測定洗脫物在擴增后的濃度，貯存于4C。(20)包被平皿進行第二輪篩選，同步驟1-3。4 .第四天和第五天(21)計數(shù)藍色噬斑，確定噬菌體的滴度，計算對應(yīng)于1X10-2X1011pfu的噬菌體體積。如果

8、滴度太低，在篩選時可采用對應(yīng)于109pfu的噬菌體體積。(22)進行第二輪篩選：重復(fù)步驟4-18,用含1X1011-2X1011pfu噬菌體的第一輪擴增洗脫液進行篩選，將洗滌液中的Tween20濃度增至0.5%。(23)測定第二輪篩選擴增洗脫液的滴度。(24)包被平皿進行第三輪篩選，步驟1-3。5.第六天(25)進行第三輪篩選：用第二輪擴增洗脫液中1X10”-2X1011pfu噬菌體進行篩選，洗滌日Tween20的濃度仍為0.5%。(26)測定未擴增的第三輪洗脫液的滴度。如果不進行第四輪篩選則不必擴增第三輪的篩選洗脫物。滴度測定時的藍色噬斑可用于測序：平板的孵育時間不得長于18h,因為時間過長

9、可能造成噬菌體感染率下降。將剩余得洗脫物保存于4C。(27)選取單克隆ER2537過夜培養(yǎng)。噬菌體滴度的測定材料和試劑(1)微波爐。(2)LB/IPTG/Xgal培養(yǎng)板。(3)LB培養(yǎng)基。(4)頂層瓊脂糖凝膠。操作步驟(1)在5-10mlLB培養(yǎng)基中接種單個ER2537克隆，振搖孵育直至對數(shù)生長中期(ODO0=0.5)(2)在細胞生長時，微波融化頂層瓊脂糖凝膠，分裝至無菌培養(yǎng)管內(nèi)，每管3ml。維持在45c備用。(3)37c預(yù)熱LB/IPTG/Xgal培養(yǎng)板，備用。(4)以LB培養(yǎng)基10倍比稀釋噬菌體。建議稀釋范圍：對擴增的噬菌體培養(yǎng)上清，108-10；對未擴增的篩選洗脫液，101-104。每次

10、稀釋都換用新的加樣槍頭，最好使用氣溶膠阻隔槍頭以避免交叉污染。(5)一旦ER2537培養(yǎng)物長至對數(shù)生長中期，分裝至微量離心管中，每管200科l。(6)將倍比稀釋的噬菌體上清加入含細菌培養(yǎng)物的微量離心管中，一支微量離心管中僅加入一種稀釋液10(il,快速渦旋，室溫孵育1-5min。(7)轉(zhuǎn)移至含有45c頂層瓊脂糖凝膠的管中，快速渦旋混勻，立即傾倒至預(yù)熱的LB/IPTG/Xgal平板上，輕緩搖動平板使頂層膠均勻分布。(8)冷卻平板5min,37c倒置培養(yǎng)過夜。(9)噬斑計數(shù)以噬斑數(shù)為100左右的平皿為準，噬斑數(shù)乘以稀釋度即可獲得每101噬菌體的滴度-噬斑形成單位(pfu)。噬斑的擴增材料和試劑(1

11、)恒溫搖床(2)培養(yǎng)管(3)LB培養(yǎng)基(4)甘油操作步驟(1)以LB培養(yǎng)基稀釋ER2537過夜培養(yǎng)物。1ml分裝至培養(yǎng)管，每管中接種一個克隆。第三輪篩選后，每10個克隆就可能獲得一個共同序列。(2)使用消毒牙簽或槍頭，穿刺噬斑，接種至上述培養(yǎng)管中。注意：要挑選噬斑數(shù)不超過100的平板上的噬斑，從而保證每一個噬斑僅包含單個DN際列。(3)37c振搖孵育4.5-5h(不能過長)。(4)可做可不做。除了測定單個克隆的序列，也可將篩選到的全部噬菌體進行測序，一步就可能獲得12個殘基中的共有序列。取10科l未擴增的洗脫物加至1ml宿主菌稀釋液中37c振搖孵育4.5-5h。(5)將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)至微量離心管，離

12、心30s,取上清轉(zhuǎn)入新的離心管中再次離心，取上部約80%勺上清轉(zhuǎn)至新的離心管。這是擴增的噬菌體貯存液，能4c保存數(shù)周，若需長期保存，以無菌甘油1:1稀釋后，-20C保存。測序模板的快速純化材料和試劑(1)真空泵(2)PEG/NaCl溶液(3)碘化物緩沖液(4)70%L醇(5)TE緩沖?10mMTris-HCl,PH8.01mMEDTA操作步驟(1)擴增噬斑(見上述)，在第一次離心后，將500dl含有噬菌體的上清轉(zhuǎn)入新的離心管中。(2)加入200dlPEG/NaCl,顛倒混勻，室溫靜置10min。(3)離心10min,傾去上清。(4)再次短暫離心，仔細吸去殘留上清。(5)用100dl碘化物緩沖液

13、完全重懸沉淀物， 加入250“乙醇。 室溫孵育10min,室溫短暫孵育將選擇性沉淀單鏈噬菌體DNA而大部分噬菌體蛋白保留在溶液中。(6)離心10min,傾去上清，用70%L醇洗滌沉淀物，真空吸干。(7)用30“TE緩沖液重懸沉淀物。(8)取5作為測序模板，或根據(jù)需要增減。ELISA檢測篩選到的靶分子結(jié)合肽材料和試劑(1)酶標板，酶標儀。(2)濕盒。(3)吸水紙。(4)LB培養(yǎng)基。PEG/NaCl。(6)TBS0.1MNaHCQ(PH8.6)。(8)HR麻物緩沖液。ABTS貯存液：在100ml50mM勺檸檬酸鈉溶液(PH4.0)中溶解22mgABTS過濾除菌貯存在4C。操作步驟(1)噬斑擴增上清

14、部分用于DNA列測定，其余保存于4C。(2)將ER2537接種至20mlLB培養(yǎng)基中，37c孵育至輕微混濁，或?qū)⑦^夜培養(yǎng)的ER2537按1:100稀釋至20ml。(3)加入5科l噬菌體上清，37c劇烈通氣培養(yǎng)4.5h。(4)將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入離心管，10000轉(zhuǎn)離心10min。取上清轉(zhuǎn)入新的離心管，再次離心。(5)吸取上層80%勺上清轉(zhuǎn)入新離心管中，加入1/6體積的PEG/NaCl,4c沉淀1h或過夜。(6)4C,10000轉(zhuǎn)離心PEGM淀物15min。傾去上清，再次短暫離心，吸去殘留上清。(7)用1mlTBS懸浮沉淀物，并轉(zhuǎn)至微量離心管中，4c離心5min以沉淀殘留細胞。(8)將上清轉(zhuǎn)至新離心管中

15、，再次用1/6體積的PEG/NaCl沉淀噬菌體。冰上孵育15-60min,4c離心10min。傾去上清，再次短暫離心，吸去殘留上清。(9)用50“TBS懸浮沉淀物。測定滴度，貯存于4C。(10)取100-200“溶于0.1MNaHCPH8.6)的100g/ml靶蛋白包被酶標板的加樣孔，在密封的濕盒內(nèi)4c孵育過夜。每一個克隆包被一列。(11)傾去靶溶液，并將板子反扣在吸水紙上盡量吸干。在每一個孔中加滿封閉緩沖液。另外，每個克隆都需要封閉一列未包被的加樣孔，以檢測其與BSA包被板子的結(jié)合。封閉另一個酶標板用來稀釋噬菌體，這樣可以保證稀釋過程中噬菌體不被靶蛋白吸收。4c封閉1-2h。(12)傾去封閉液，用1(TBS/Tween洗滌板子6次，每次都將酶標板反扣在吸水紙上盡量吸干。Tween的濃度應(yīng)該與篩選洗滌步驟的濃度相同。(13)用TBS/Tween4倍比稀釋噬菌體，200“/孔，第一孔為1012顆粒，第十二孔為2乂105顆粒。(14)用多道加樣槍，將每一列倍比稀釋的噬菌體轉(zhuǎn)至靶蛋白包被的酶標板內(nèi)。室溫振蕩孵育1-2h。(15)用1xTBS/Tw