1、第十章第十章 原核生物基因原核生物基因 表達的調控表達的調控n生物的遺傳信息是以基因的形式儲藏在細生物的遺傳信息是以基因的形式儲藏在細胞內的胞內的DNA(或或RNA)分子中的。隨著個體分子中的。隨著個體的發育，的發育，DNA有序地將遺傳信息，通過轉有序地將遺傳信息，通過轉錄和翻譯的過程轉變成蛋白質，執行各種錄和翻譯的過程轉變成蛋白質，執行各種生理生化功能，完成生命的全過程。從生理生化功能，完成生命的全過程。從DNA到蛋白質的過程，叫做基因表達到蛋白質的過程，叫做基因表達(gene expression)，對這個過程的調節，對這個過程的調節就稱為基因表達調控就稱為基因表達調控(gene regu

2、lation或或gene control)。n基因調控是現階段分子生物學研基因調控是現階段分子生物學研究的中心課題。要了解生物生長究的中心課題。要了解生物生長發育的規律、形態結構特征和生發育的規律、形態結構特征和生物學功能，就必須弄清楚基因表物學功能，就必須弄清楚基因表達調控的時間和空間概念。達調控的時間和空間概念。基因表達調控在兩個水平上體現基因表達調控在兩個水平上體現 (1)轉錄水平上的調控轉錄水平上的調控(transcriptional regulation); (2)轉錄后水平上的調控轉錄后水平上的調控(post-transcriptional regulation)，包括，包括mRN

3、A加工成熟水平上的調加工成熟水平上的調控控(differential processing of RNA transcript);翻譯水平上的調控翻譯水平上的調控(differential translation of mRNA)。 無論原核還是真核生物，其基因調控主要發生無論原核還是真核生物，其基因調控主要發生在轉錄水平上，包括在轉錄的起始階段和終止階段。在轉錄水平上，包括在轉錄的起始階段和終止階段。 n對于原核生物，以營養狀況對于原核生物，以營養狀況(nutritional status)和環境因素和環境因素(environmental factor)為主要的基為主要的基因表達影響因素。在

4、真核生物尤其是高等真核生因表達影響因素。在真核生物尤其是高等真核生物中，激素水平物中，激素水平(hormone level)和發育階段和發育階段(developmental stage)是基因表達調控的最主是基因表達調控的最主要手段，而營養和環境因素的影響力大為下降。要手段，而營養和環境因素的影響力大為下降。n在轉錄水平上對基因表達調控取決于在轉錄水平上對基因表達調控取決于DNA的結構、的結構、RNA聚合酶的功能、蛋白因子及其他小分子配基聚合酶的功能、蛋白因子及其他小分子配基的相互作用。的相互作用?；?本本 概概 念念 操縱子操縱子operon） 很多功能上相關的結構基因在染色體上串連很多功

5、能上相關的結構基因在染色體上串連排列，由排列，由 一個共同的控制區來操縱這些基因的轉錄。包一個共同的控制區來操縱這些基因的轉錄。包含這些結構含這些結構 基因和控制區的整個核苷酸序列就稱為操縱子基因和控制區的整個核苷酸序列就稱為操縱子(operon)。 一個完整的操縱子主要包括啟動子、操縱基一個完整的操縱子主要包括啟動子、操縱基因、構造因、構造 基因和終止子?；蚝徒K止子。 2. 阻遏物和激活物阻遏物和激活物reperssor and activator）結構基因：編碼蛋白質或結構基因：編碼蛋白質或RNA的基因。的基因。調節基因：參與其它基因表達調控的調節基因：參與其它基因表達調控的RNA和蛋白

6、和蛋白質的編碼基因。其編碼的調節蛋白稱為阻遏物或激質的編碼基因。其編碼的調節蛋白稱為阻遏物或激活物?；钗铩Ｕ{節蛋白具有與其它調節蛋白具有與其它DNA結合蛋白類似的結構特結合蛋白類似的結構特征：螺旋征：螺旋-轉角轉角-螺旋螺旋helix-turn-helix，HTH）。）。兩個螺旋分別由兩個螺旋分別由7-9個氨基酸殘基構成，其間間隔個氨基酸殘基構成，其間間隔4個氨基酸殘基。兩個螺旋之間約為直角，螺旋個氨基酸殘基。兩個螺旋之間約為直角，螺旋2嵌入嵌入DNA雙螺旋大溝內，負責與雙螺旋大溝內，負責與DNA的特異性結的特異性結合，稱為合，稱為“識別螺旋識別螺旋”；螺旋；螺旋1中的氨基酸與中的氨基酸與DN

7、A的磷酸戊糖骨架非特異性結合，基本上平行于雙螺的磷酸戊糖骨架非特異性結合，基本上平行于雙螺旋。旋。C蛋白蛋白的的N端含端含有有5個個螺旋螺旋,第第2和第和第3個個螺旋形螺旋形成成HTH(螺螺旋旋-轉角轉角-螺旋螺旋)3. 負調控和正調控負調控和正調控negative and positive regulation）調節蛋白與調節蛋白與DNA特定位點的相互作用，啟動或增強特定位點的相互作用，啟動或增強操縱子的轉錄活性，這種調控方式叫做正調控，如激操縱子的轉錄活性，這種調控方式叫做正調控，如激活物參與的調控?；钗飬⑴c的調控。調節蛋白與調節蛋白與DNA特定位點的相互作用，關閉或降低特定位點的相互作用

8、，關閉或降低操縱子的轉錄活性，這種調控方式叫做負調控，如阻操縱子的轉錄活性，這種調控方式叫做負調控，如阻遏物參與的調控。遏物參與的調控。4. 誘導物和共阻遏物誘導物和共阻遏物inducer and corepressor）效應物效應物effector）：能與調節蛋白結合并改變其性）：能與調節蛋白結合并改變其性質的小分子化合物。質的小分子化合物。誘導物：與調節蛋白結合后啟動操縱子轉錄的效應物。誘導物：與調節蛋白結合后啟動操縱子轉錄的效應物。共阻遏物：與調節蛋白結合后關閉操縱子轉錄的效應共阻遏物：與調節蛋白結合后關閉操縱子轉錄的效應物。物。第一節第一節 轉錄水平的調控轉錄水平的調控一、轉錄的起始一

9、、轉錄的起始 轉錄是原核生物基因表達的主要調控點，轉錄是原核生物基因表達的主要調控點，主要涉及兩個方面：主要涉及兩個方面：1、RNA合成的酶系；合成的酶系；2、RNA合成起始和終止信號，即合成起始和終止信號，即DNA分分子上的特定序列。子上的特定序列。 通過通過RNA聚合酶、轉錄因子和啟動子的聚合酶、轉錄因子和啟動子的相互作用實現轉錄調控，改變細胞的表型，相互作用實現轉錄調控，改變細胞的表型，從而實現細胞生理狀態和環境的變化。從而實現細胞生理狀態和環境的變化。1. RNA聚合酶聚合酶(RNA polymerase)： 大腸桿菌的大腸桿菌的RNA聚合酶：由聚合酶：由5個亞基組成，個亞基組成，即即

10、2，有時還有，有時還有2個個 亞基。以亞基。以2組組成的酶稱全酶。成的酶稱全酶。 亞基與其他亞基結合較松弛，亞基與其他亞基結合較松弛，易從全酶上解離；其余部分易從全酶上解離；其余部分2稱為核心酶稱為核心酶(core enzyme)。n在大腸桿菌中還發現一種新的在大腸桿菌中還發現一種新的因子，稱為因子，稱為因子，因因子，因此將含有此將含有亞基的全酶稱為全酶亞基的全酶稱為全酶I，含有，含有亞基的稱為亞基的稱為全酶全酶。二者的不同在于：全酶。二者的不同在于：全酶可以利用雙鏈可以利用雙鏈DNA為模板合成為模板合成po1yA)。 n亞基作用：參與啟動子的識別和結合以及轉錄起始復亞基作用：參與啟動子的識別

11、和結合以及轉錄起始復合物的異構化。細胞內哪條合物的異構化。細胞內哪條DNA鏈被轉錄、轉錄方向鏈被轉錄、轉錄方向與轉錄起點的選擇都與與轉錄起點的選擇都與亞基有關。亞基有關。n離體實驗表明：全酶所轉錄的離體實驗表明：全酶所轉錄的RNA和細胞內所轉錄出和細胞內所轉錄出的的RNA，其起始點相同，序列相同，若僅用核心酶進，其起始點相同，序列相同，若僅用核心酶進行轉錄，則模扳鏈和起始點的選擇都有很大的隨意性，行轉錄，則模扳鏈和起始點的選擇都有很大的隨意性，而且往往同一段而且往往同一段DNA的兩條鏈都被轉錄。的兩條鏈都被轉錄。n由此可見：由此可見：亞基對識別亞基對識別DNA鏈上的轉錄信號是不可鏈上的轉錄信號

12、是不可缺少的，它是核心酶和啟動子之間的橋梁。缺少的，它是核心酶和啟動子之間的橋梁。 因子的因子的取代在細胞發育和對環境應答的反應中起主導作用。取代在細胞發育和對環境應答的反應中起主導作用。2. 啟動子啟動子 (promotor)： 轉錄的起始是基因表達的關鍵階段，啟動子就是轉錄的起始是基因表達的關鍵階段，啟動子就是連接在基因連接在基因5端上游的端上游的DNA序列，其長度從序列，其長度從100 bp到到200 bp不等，是轉錄起始時不等，是轉錄起始時RNA聚聚合酶識別、結合的特定部位，但其本身并不被合酶識別、結合的特定部位，但其本身并不被轉錄。此外，啟動子還包括與調節蛋白結合的轉錄。此外，啟動子

13、還包括與調節蛋白結合的位點。位點。在啟動子與終止子之間是一個轉錄單位，通常將在啟動子與終止子之間是一個轉錄單位，通常將mRNA開始的一個核苷酸定為起點開始的一個核苷酸定為起點(即即+1)由由此向右常稱為下游此向右常稱為下游(downstream)，其核苷酸，其核苷酸依次編為正序號；起始點左例稱為上游依次編為正序號；起始點左例稱為上游(upstream)其核苷酸則依次以負號表示緊其核苷酸則依次以負號表示緊接起始點左側的核昔酸為接起始點左側的核昔酸為-1。u啟動子區的上游激活序列和操縱基因啟動子區的上游激活序列和操縱基因u啟動子區中與正調節蛋白結合的位點，叫做上游激啟動子區中與正調節蛋白結合的位點

14、，叫做上游激活序列活序列upstream activating sequence，UAS），），一般位于一般位于-35區上游；與負調節蛋白結合的位點稱操區上游；與負調節蛋白結合的位點稱操縱基因縱基因operator），一般與啟動子重疊。），一般與啟動子重疊。 u具有具有UAS序列的啟動子，一般沒有典型的序列的啟動子，一般沒有典型的-35區，區，因此因此RNA聚合酶不能很好地與之結合。只有當激活蛋聚合酶不能很好地與之結合。只有當激活蛋白結合在白結合在UAS上后，通過與上后，通過與RNA聚合酶在空間上相互聚合酶在空間上相互作用或改變啟動子區中與作用或改變啟動子區中與RNA聚合酶結合部位的聚合酶結合

15、部位的DNA的構型，從而提高啟動子的活性。如大腸桿菌中依賴的構型，從而提高啟動子的活性。如大腸桿菌中依賴cAMP-CAP激活的乳糖、半乳糖、阿拉伯糖等操縱子。激活的乳糖、半乳糖、阿拉伯糖等操縱子。有時，一個基因或操縱子需要有時，一個基因或操縱子需要2個相互分開的操縱個相互分開的操縱基因，一個位于轉錄起點附近，另一個在距離啟動子基因，一個位于轉錄起點附近，另一個在距離啟動子區約幾百區約幾百bp的上游或下游。其中每個操縱基因都與的上游或下游。其中每個操縱基因都與一個阻遏物結合，然后兩個阻遏物在空間上相互作用，一個阻遏物結合，然后兩個阻遏物在空間上相互作用，形成一個形成一個DNA環，從而抑制環，從而

16、抑制RNA聚合酶與啟動子的聚合酶與啟動子的結合。結合。二、二、因子與轉錄起始調控因子與轉錄起始調控- 因子的替代可以控制起因子的替代可以控制起始始1. 1. 在在E.coliE.coli，不同類型的啟動子需要不同類型的，不同類型的啟動子需要不同類型的因子因子n在正常的溫度和環境下，大腸桿菌主要依靠在正常的溫度和環境下，大腸桿菌主要依靠70 進進行基因的轉錄。行基因的轉錄。n當環境溫度升高時，許多原核和真核生物都會產生熱當環境溫度升高時，許多原核和真核生物都會產生熱激狀態，正常表達的基因會關閉或表達水平下降，而激狀態，正常表達的基因會關閉或表達水平下降，而編碼熱激蛋白編碼熱激蛋白heat sho

17、ck protein的基因開始表的基因開始表達，這些蛋白質能提高菌體對高溫的抵抗力，此即謂達，這些蛋白質能提高菌體對高溫的抵抗力，此即謂熱激反應。熱激反應。n在大腸桿菌中，編碼熱激蛋白的基因有在大腸桿菌中，編碼熱激蛋白的基因有30多種，其多種，其中絕大多數熱激基因的啟動子是中絕大多數熱激基因的啟動子是32。2. 枯草芽孢桿菌中枯草芽孢桿菌中亞基的更替與生活周期的轉變亞基的更替與生活周期的轉變u目前已從枯草芽孢桿菌中發現至少目前已從枯草芽孢桿菌中發現至少10種種因子，因子，其中正常生活的其中正常生活的RNA聚合酶的聚合酶的因子為因子為43，識別，識別與與70 相同的啟動子保守序列。相同的啟動子保

18、守序列。u大部分大部分因子轉換的例子都發生在孢子形成因子轉換的例子都發生在孢子形成sporulation中。中。u 孢子形成分為三個階段孢子形成分為三個階段u （1DNA復制；復制；u （2在細胞的一端基因組被分離；在細胞的一端基因組被分離；u （3分離的基因組外包上一層子外殼。分離的基因組外包上一層子外殼。芽孢的形成芽孢的形成軸絲形成軸絲形成形成隔膜形成隔膜形成前芽孢形成前芽孢孢子囊破裂，孢子囊破裂，芽孢釋放芽孢釋放芽孢成熟芽孢成熟形成孢子衣形成孢子衣芽孢外殼）芽孢外殼）形成皮層形成皮層 前孢子 母細胞 43 H 磷酸化激活了 全酶含有43 F和proE 和H 的合成 F pro-E F 取

19、代了核 心酶上的43 F-核心酶復合 E被活化并取 體轉錄孢子形成 代了43 的早期基因 G 早期基因產 產生了K基因 生了G E轉錄K基因 K G被活化并取代 K被激活并 了F 取代了E 活化的G負責 活化的K負責 轉錄晚期基因 轉錄晚期基因 圖16-34 孢子形成涉及到因子的改變，從爾控制RNA Pol 起始轉錄的特異性 (仿B.Lewin:GENES,1997, Fig .11.24) F 對對 E的活性控制的活性控制n在前孢子中由早期基因產生在前孢子中由早期基因產生G, G使使RNA聚合酶在前孢子中轉錄晚期孢子形成基因。聚合酶在前孢子中轉錄晚期孢子形成基因。n另一個早期孢子形成基因產物

20、負責和母細胞另一個早期孢子形成基因產物負責和母細胞中的成分聯系，中的成分聯系，F激活激活SpoR，SpoR由由前孢子分泌，然后它激活膜結合蛋白前孢子分泌，然后它激活膜結合蛋白SpoGA。 n活化的活化的SpoGA在母細胞中剪切失活的前體在母細胞中剪切失活的前體物物Pro- E使其成為活化因子使其成為活化因子E。四種四種sigma 因子的活化調節因子的活化調節三、轉錄的終止和抗終止三、轉錄的終止和抗終止1. 終止子的結構終止子的結構 DNA上提供轉錄停止信號的一段序列稱為上提供轉錄停止信號的一段序列稱為終止子終止子(terminator)，是一個基因的末端或是，是一個基因的末端或是一個操縱子的末

21、端的一段特定序列。與啟動子一個操縱子的末端的一段特定序列。與啟動子不同，終止子能被轉錄成不同，終止子能被轉錄成mRNA。類型：強終止子和弱終止子類型：強終止子和弱終止子強終止子：不依賴于強終止子：不依賴于Rho蛋白質輔助因子而能蛋白質輔助因子而能實現終止作用，這類終止子屬于強終止子；實現終止作用，這類終止子屬于強終止子；弱終止子：依賴于弱終止子：依賴于Rho因子才能實現終止作用，因子才能實現終止作用，這類終止子屬于弱終止子。蛋白質輔助因子稱這類終止子屬于弱終止子。蛋白質輔助因子稱為釋放因子，通常稱為為釋放因子，通常稱為因子。因子。n所有原核生物的終止子共同的序列特征：即在轉錄終止點之所有原核生

22、物的終止子共同的序列特征：即在轉錄終止點之前有一段回文結構，因而所產生的前有一段回文結構，因而所產生的mRNA可形成莖環狀的發可形成莖環狀的發夾結構，它可使夾結構，它可使RNA聚合酶的移動停止或減緩。聚合酶的移動停止或減緩。n強終止子回文結構中富含強終止子回文結構中富含GC對，在回文序列的下游常有對，在回文序列的下游常有68個個A，因此這段終止子轉錄后形成的，因此這段終止子轉錄后形成的RNA具有與具有與A相對應的相對應的寡聚寡聚U，是使，是使RNA聚合酶脫離模板的信號。聚合酶脫離模板的信號。n依賴于依賴于因子的終止子其回文序列中因子的終止子其回文序列中GC對含量較少，回文序對含量較少，回文序列

23、下方沒有固定結構，其列下方沒有固定結構，其AU對含量也較低；由于其莖環結對含量也較低；由于其莖環結構常較短，在沒有構常較短，在沒有因子時這種莖環結構不穩定。如果沒有因子時這種莖環結構不穩定。如果沒有因子存在，因子存在，RNA聚合酶會繼續轉錄下去，產生通讀聚合酶會繼續轉錄下去，產生通讀(read through)，當，當因子存在時，轉錄才能終止。因子存在時，轉錄才能終止。u在強終止子中，轉錄的在強終止子中，轉錄的RNA在終止子部位形成的發在終止子部位形成的發夾結構破壞了轉錄泡中夾結構破壞了轉錄泡中RNA-DNA雜合鏈的形成，而雜合鏈的形成，而RNA-DNA雜合鏈能幫助雜合鏈能幫助RNA聚合酶固定

24、在聚合酶固定在DNA鏈上，鏈上，因此轉錄泡中的因此轉錄泡中的RNA-RNA發夾結構使發夾結構使RNA聚合酶變聚合酶變得不穩定，結果得不穩定，結果RNA聚合酶和聚合酶和RNA都從都從DNA鏈上脫離，鏈上脫離，轉錄終止。轉錄終止。u因子輔助的終止作用因子輔助的終止作用 因子結合于正在合成的因子結合于正在合成的RNA的的rutrho utilization site位點如果位點如果rut位點被核位點被核糖體翻譯，則糖體翻譯，則因子不能與之結合），利用其依賴于因子不能與之結合），利用其依賴于RNA的的ATP酶活性水解酶活性水解ATP獲得能量沿獲得能量沿RNA按按5-3方向移動；方向移動；當當RNA聚合

25、酶遇到終止子而暫停轉錄時，聚合酶遇到終止子而暫停轉錄時， 因子得以在因子得以在終止子處追上終止子處追上RNA聚合酶并進入轉錄泡的聚合酶并進入轉錄泡的RNA-DNA雜合雜合鏈中；其鏈中；其RNA-DNA解旋酶活性使雜合雙鏈解旋，釋放解旋酶活性使雜合雙鏈解旋，釋放RNA聚合酶，轉錄終止。聚合酶，轉錄終止。2. 基因表達的極性效應基因表達的極性效應在正常情況下原核基因表達時，其轉錄出來的在正常情況下原核基因表達時，其轉錄出來的mRNA隨隨即進行翻譯，這時整個即進行翻譯，這時整個mRNA都覆蓋著核糖體，都覆蓋著核糖體， 因子無因子無法接近法接近mRNA，而，而RNA聚合酶早已越過前面的基因的依聚合酶早

26、已越過前面的基因的依賴賴因子的終止子，所以轉錄實際上并不停止，而是繼續因子的終止子，所以轉錄實際上并不停止，而是繼續轉錄后續基因。如果在某一基因的依賴于轉錄后續基因。如果在某一基因的依賴于的終止子之前的終止子之前發生無義突變，核糖體便從無義密碼子上解離下來，翻譯發生無義突變，核糖體便從無義密碼子上解離下來，翻譯停止，于是停止，于是就可以自由進入就可以自由進入RNA并移動，直到趕上停留并移動，直到趕上停留在終止子上的在終止子上的RNA聚合酶，結果使聚合酶，結果使RNA聚合酶釋放，不聚合酶釋放，不能再轉錄下游基因。能再轉錄下游基因。基因表達的極性現象：在某些情況下同一轉錄單元里，由基因表達的極性現

27、象：在某些情況下同一轉錄單元里，由于一個基因的無義突變，阻礙了下游相鄰基因表達的效應，于一個基因的無義突變，阻礙了下游相鄰基因表達的效應，就稱為基因表達的極性現象。就稱為基因表達的極性現象。除了無義突變可以導致極性現象外，插入序列除了無義突變可以導致極性現象外，插入序列IS1、IS2等等DNA片段插入到操縱子的基因中也會發生極性現象。片段插入到操縱子的基因中也會發生極性現象。3. 抗終止作用抗終止作用anti-termination） 因子的作用可以被抗終止因子所抵消，這樣，因子的作用可以被抗終止因子所抵消，這樣，RNA聚合酶便可通過終止子聚合酶便可通過終止子(依賴于依賴于因子的因子的)繼續繼

28、續轉錄后面的基因，這種現象稱為抗終止作用轉錄后面的基因，這種現象稱為抗終止作用(anti-termination)。第二節第二節 操縱子類型操縱子類型l可誘導負控制系統可誘導負控制系統l可誘導正控制系統可誘導正控制系統l可阻遏負控制系統可阻遏負控制系統l可阻遏正控制系統可阻遏正控制系統操縱子調控系統的基本類型操縱子調控系統的基本類型 負調控 正調控 Lac O Ara O 誘 導 失活的阻遏物 活化的激活蛋白 阻遏物 誘導物 失活的活性蛋白 誘導物 阻遏 誘導 阻遏 誘導 Trp O 阻 遏 失活的活性蛋白 輔-阻遏物 活化的激活蛋白 輔-阻遏物 失活的活性蛋白 誘導 阻遏 誘導 阻遏 圖 1

29、6-1 原核生物結構基因的 4 種表達調控類型 (仿 B.Lewin:GENES,1997, Fig .12.21) 原原核核生生物物結結構構基基因因表表達達的的4種種調調控控類類型型一、大腸桿菌乳糖操縱子一、大腸桿菌乳糖操縱子1大腸桿菌的乳糖利用系統大腸桿菌的乳糖利用系統 大腸桿菌的乳糖代謝需要有大腸桿菌的乳糖代謝需要有-半乳糖苷酶半乳糖苷酶-galactosidase的催化，這種酶能把乳糖水解為半乳糖的催化，這種酶能把乳糖水解為半乳糖和葡萄糖，或轉化為異乳糖作為誘導物和葡萄糖，或轉化為異乳糖作為誘導物 。另外有。另外有-半乳半乳糖苷透性酶和糖苷透性酶和-半乳糖苷轉乙酰酶，前者協助乳糖分子半

30、乳糖苷轉乙酰酶，前者協助乳糖分子穿膜進入細胞內，后者可將乙酰基從乙酰輔酶穿膜進入細胞內，后者可將乙?；鶑囊阴］o酶A上轉移至上轉移至-半乳糖苷上。三種酶協同作用，使得乳糖得以分解和半乳糖苷上。三種酶協同作用，使得乳糖得以分解和利用。利用。 乳糖操縱子的負調控乳糖操縱子的負調控 H OH HO H OH H H CH2OH H O OH HO O H O CH2 CH2OH H OH OH H HO O H 別乳糖 H O OH H H H OH OH H H H2O H H H O OH CH2OH CH2OH H OH CH2OH H O OH HO O OH H H OH H OH H HO

31、 H H H H OH H OH 葡萄糖 半乳糖 圖 16- 乳糖分解的不同產物-半乳糖苷酶催化乳糖的兩種反應半乳糖苷酶催化乳糖的兩種反應誘導物誘導物的加入的加入和去除和去除對對lac mRNA及及LacZ合成合成的影響的影響項目項目功能功能結構結構基因基因3個不同結構基因能夠產生個不同結構基因能夠產生3種不同的酶。種不同的酶。（lacZ、Y、A）操縱操縱基因基因（O）是結構基因的開關是結構基因的開關.通過對通過對RNA聚合酶阻聚合酶阻抑與否來控制結構基因的轉錄或停止。抑與否來控制結構基因的轉錄或停止。啟動啟動子（子（P）是是RNA聚合酶與聚合酶與DNA結合的部位，可識結合的部位，可識別轉錄起

32、始點。別轉錄起始點。調節調節基因基因（I）有自己獨立的轉錄單位，能產生阻遏蛋有自己獨立的轉錄單位，能產生阻遏蛋白，通過與操縱基因的結合與否來控制白，通過與操縱基因的結合與否來控制操縱基因的關閉和開啟。操縱基因的關閉和開啟。乳糖操縱子的結構和功能乳糖操縱子的結構和功能2乳糖操縱子的負調控可誘導）乳糖操縱子的負調控可誘導）誘導因子：異乳糖、誘導因子：異乳糖、-半乳糖苷、異丙基半乳糖苷、異丙基-D-硫代硫代 半乳糖苷半乳糖苷IPDG）。）。機制：沒有誘導物時，具有活性的阻遏物和操縱基因機制：沒有誘導物時，具有活性的阻遏物和操縱基因結合，轉錄不能進行。有誘導物時，乳糖與阻遏物結結合，轉錄不能進行。有誘

33、導物時，乳糖與阻遏物結合，使阻遏物發生構象變化而失活，不能與操縱子結合，使阻遏物發生構象變化而失活，不能與操縱子結合，結構基因正常轉錄，進而再翻譯出蛋白質。合，結構基因正常轉錄，進而再翻譯出蛋白質。 CH2O H CH3 H O O S C CH3 H CH3 O H HH H H O H圖16-6 異 丙 基 - -硫 代 半 乳 糖 苷 的 分 子 結 構IPTG：有極強的誘導效應，本身又不被分解，稱為非底物誘導：有極強的誘導效應，本身又不被分解，稱為非底物誘導 未 誘 導 ： 結 構 基 因 被 阻 遏 阻 遏 物 四 聚 體 L acI P O lacZ lacY lacA 圖 16-

34、 當 無 誘 導 物 時 阻 遏 物 結 合 在 操 縱 基 因 上 轉錄起始點 DNA 解鏈區 50 40 30 20 10 1 10 20 30 RNA 聚合酶結合的起動子區 阻遏物結 合的操縱基因區 圖 16-4 在 lac 操縱子上阻遏物結合區和 RNA 聚合酶結合區的重疊 誘導：基因被打開 -半乳糖苷酶 透性酶 乙酰轉移酶 圖16-7 誘導物和阻遏物成為調節操縱子的開關 誘導誘導物和物和阻遏阻遏蛋白蛋白結合結合的模的模型型 維 持 阻 遏 過 量 的 阻 遏 物 可 結 合 在D N A 阻 遏 物 結 合 在 的 其 它 位 點 操 縱 基 因 上 aaaa aaa a a 誘 導

35、 物 a 誘 導 所 有 的 阻 遏 物 都 結 合 a a 在D N A的 隨 機 位 點 上 a a a aa 誘 導 物 解 離 a 建 立 阻 遏 阻 遏 物 恢 復 活 性 狀 態 a a a 阻 遏 蛋 白 通 過 直 接 取 代 a 從 隨 機 位 點 移 向 a 操 縱 基 因 a a a a a a 圖16-14 在 細 胞 中 所 有 的 阻 遏 蛋 白 都 結 合 在D N A上 (仿B .L ew in: G E N E S ,1997, Fig .12.18) 3乳糖代謝的突變型乳糖代謝的突變型n1961年年 Jacob & Monod等通過對突變體的研究，證

36、明了等通過對突變體的研究，證明了調節基因和操縱基因的存在。調節基因和操縱基因的存在。n通過構建部分二倍體，如：通過構建部分二倍體，如：n FlacI-lacZ+Y-A+ X F-lacI+lacZ-Y+A-nlacI-lacZ+Y-A+/lacI+lacZ-Y+A-，發現了以下突變：，發現了以下突變：nlacI S 阻遏蛋白不可誘導性突變，阻遏蛋白失去誘導物結阻遏蛋白不可誘導性突變，阻遏蛋白失去誘導物結合位點，始終作用于結構基因，為超阻遏突變型。合位點，始終作用于結構基因，為超阻遏突變型。nlacI - 阻遏蛋白不能形成寡聚物，對阻遏蛋白不能形成寡聚物，對lacI+ 隱性。隱性。nlacI -

37、d 阻遏蛋白不能和阻遏蛋白不能和DNA結合，且呈負互補結合，且呈負互補(反式顯性反式顯性)nO c 操縱基因的組成型突變，只對同一染色體上的結構操縱基因的組成型突變，只對同一染色體上的結構基因起作用，為順式顯性?；蚱鹱饔茫瑸轫樖斤@性。 Active repressor cannot bind to O c mutant operantor Operon is transcribed and translated lacI O c operantor -半乳糖苷酶 透性酶 乙酰轉移酶 圖16-7 操縱基因發生組成型突變，操縱子組成型表達 Inactive repressor lacIgenes

38、ythesizes defective repressor that does not bind to DNA LacI + gene sythesizes lacI Operator wild-type repressor which bind to operator lacI + Inducer displaces wild-type repressor from operator as usual 圖圖 16- Constitutive mutations in the lacI gene are recessive. Repressor has lost lacI S genesyth

39、esizes Iducer-binding site defective repressor that cannot bind inducer; it binds permanently to operator lacI S Operantor lacI + wild-type repressor does not influence DNA-binding of LacS repressor 圖圖 16- Uninducible lac S mutations are dominant 表 16-1在單倍體和部分二倍體中-半乳糖苷酶透過酶的合成基因型-半乳糖苷酶透過酶不誘導誘導不誘導誘導 I

40、 +Z +Y + I Z +Y +I +Z Y + / FI Z +Y +I Z Y + / FI +Z +Y +I Z Y + / FI Z +Y -(I,Z,Y)/ FI Z +Y +O +Z +Y +O +Z +Y + / FO +Z Y +O cZ +Y +O +Z +Y- / FO cZ +Y +O +Z +Y + / FO cZ Y +O +Z Y + / FO cZ +Y -I sO +Z +Y +/FO cZ +Y +:表示缺失， “”表示酶以最高水平存在， “”表示酶以最低水平存在 關于關于lacI -du阻遏蛋白上具有兩種不同類型的結合位點：阻遏蛋白上具有兩種不同類型的結合

41、位點：DNA-結合位點識別結合位點識別操縱基因，誘導物結合位點與小分子誘導物結合。一旦與誘導物操縱基因，誘導物結合位點與小分子誘導物結合。一旦與誘導物作用使其構象發生改變而失去與操縱基因作用使其構象發生改變而失去與操縱基因DNA結合的能力。結合的能力。DNA-結合位點的突變是組成型的因為阻遏物不能和結合位點的突變是組成型的因為阻遏物不能和DNA結合結合來阻斷轉錄）。誘導物結合位點的突變是不可誘導性的由于誘來阻斷轉錄）。誘導物結合位點的突變是不可誘導性的由于誘導物不能減少阻遏物和導物不能減少阻遏物和DNA的親和力）。的親和力）。u阻遏物功能的一個重要的特點是形成多聚體蛋白。在細胞中阻阻遏物功能的

42、一個重要的特點是形成多聚體蛋白。在細胞中阻遏蛋白的亞基隨機結合成四聚體。當不同的遏蛋白的亞基隨機結合成四聚體。當不同的lacI 等位基因存在時，等位基因存在時，它們的產物作為亞基結合成異聚四聚體，其特性和同聚四聚體不它們的產物作為亞基結合成異聚四聚體，其特性和同聚四聚體不同。這種亞基之間的作用類型具有多聚體蛋白的性質，被稱為等同。這種亞基之間的作用類型具有多聚體蛋白的性質，被稱為等位基因間的互補位基因間的互補interallelic complementation）。）。 Helix-turn-helix Core domain1 Core domain2 1 51 80 360 DNA bi

43、nding Hinge Inducer binding Oligomerization 圖16- 阻遏蛋白單體的結構和功能阻遏蛋白的結構：阻遏蛋白的結構：N端：端：159aa，頭部片段，為，頭部片段，為HTH，與操縱基因，與操縱基因DNA大大溝結合；溝結合；核心區：有核心區：有6個個折疊，誘導物就結合在兩個核心區之間的折疊，誘導物就結合在兩個核心區之間的裂縫中；裂縫中；C端：為兩組亮氨酸拉鏈，形成四聚體。端：為兩組亮氨酸拉鏈，形成四聚體。阻遏蛋白單體的三級結構u負的互補負的互補negative complementation）：此）：此lacI-d的突變的突變導致阻遏蛋白不能和操縱基因結合。因

44、此它像導致阻遏蛋白不能和操縱基因結合。因此它像lacI - 等位基因一等位基因一樣，使操縱子呈組成型表達。由于樣，使操縱子呈組成型表達。由于lacI- 類型的突變產生的阻遏物類型的突變產生的阻遏物沒有活性，它相對于野生型基因是隱性的，而沒有活性，它相對于野生型基因是隱性的，而“-d這個符號表這個符號表示負互補這種突變類型是顯性的。這種突變稱反式顯性示負互補這種突變類型是顯性的。這種突變稱反式顯性trans-dominant），也稱為顯性失活），也稱為顯性失活dominant negatives）。）。u這種顯性的原因是由于這種顯性的原因是由于lacI-d等位基因產生一個等位基因產生一個“壞的亞

45、基，壞的亞基，減少了與減少了與DNA結合位點的數目，使四聚體和操縱基因的親和力減結合位點的數目，使四聚體和操縱基因的親和力減少。不僅它本身不能結合操縱基因的少。不僅它本身不能結合操縱基因的DNA，而且它還通過作為四，而且它還通過作為四聚體的一部分阻止四聚體中聚體的一部分阻止四聚體中“好的亞基與好的亞基與DNA結合。這就意味結合。這就意味著阻遏蛋白四聚體是作為一個總體，而不是單個單體的簡單的集著阻遏蛋白四聚體是作為一個總體，而不是單個單體的簡單的集合，這對完成阻遏來說是很必要的。在體外將合，這對完成阻遏來說是很必要的。在體外將“好的亞基和好的亞基和“壞的亞基混合起來也會產生破壞作用。壞的亞基混合

46、起來也會產生破壞作用。2.乳糖操縱子的正調控乳糖操縱子的正調控1cAMP-CAP的正調控作用的正調控作用cAMP由腺苷環化酶由腺苷環化酶adenylate cyclase催化合成。催化合成。CAPcatabolite activator protein，分解代謝物激活蛋，分解代謝物激活蛋白白22.5kD，是原核生物基因表達的一種正調節蛋白。，是原核生物基因表達的一種正調節蛋白。cAMP-CAP以兩種方法來激活轉錄：以兩種方法來激活轉錄： （1它可能直接和它可能直接和RNA Pol相互作用；相互作用； （2） 作用于作用于DNA，改變其結構，從而幫助，改變其結構，從而幫助RNA Pol結合。結合

47、。CAP-I：-70-50；CAP-II：-50-40P: -82+1O: -7+28 轉錄起點 gal lac ara 啟動子 CAP結合位點 操縱基因 圖16-20 CAP蛋白可結合于相對于啟動子的不同位點 (仿B.Lewin:GENES,1997, Fig .12.25) cAMP-CAP可結合于相對于啟動子的不同位點可結合于相對于啟動子的不同位點2分解代謝產物阻遏作用分解代謝產物阻遏作用當培養基中有葡萄糖存在時，即使有乳糖存在，也不誘當培養基中有葡萄糖存在時，即使有乳糖存在，也不誘導靶基因表達。這種現象稱為葡萄糖效應或分解代謝產導靶基因表達。這種現象稱為葡萄糖效應或分解代謝產物阻遏，這

48、樣的操縱子稱葡萄糖敏感操縱子。物阻遏，這樣的操縱子稱葡萄糖敏感操縱子。葡萄糖抑制操縱子的原理：葡萄糖抑制操縱子的原理：cAMP-CAP復合物的形成取復合物的形成取決于決于AMP的濃度，當以葡萄糖為能源時，由于其抑制腺的濃度，當以葡萄糖為能源時，由于其抑制腺苷酸環化酶的活性，苷酸環化酶的活性，ATP不能轉化為不能轉化為cAMP， cAMP濃濃度下降，不能形成度下降，不能形成cAMP-CAP復合物，復合物，RNA聚合酶無聚合酶無法結合在法結合在DNA上，結構基因不表達。上，結構基因不表達。3代謝物阻遏與誘導的關系代謝物阻遏與誘導的關系受受CAP調控的操縱子，其轉錄必須滿足調控的操縱子，其轉錄必須滿

49、足2個條件：個條件：培養基中缺少葡萄糖；培養基中缺少葡萄糖；有操縱子的誘導物存在。有操縱子的誘導物存在。乳糖操縱子：兩個開關乳糖操縱子：兩個開關 第一：第一：cAMP -CAP復合物復合物 受葡萄糖影響受葡萄糖影響 第二：異乳糖復合物第二：異乳糖復合物受乳糖影響受乳糖影響二、半乳糖操縱子二、半乳糖操縱子(galactose operon)大腸桿菌半乳糖操縱子包括大腸桿菌半乳糖操縱子包括3個結構基因：個結構基因： 異構酶異構酶(UDP-galactose-epimerase, galE)半乳糖半乳糖-磷酸尿嘧啶核苷轉移酶磷酸尿嘧啶核苷轉移酶(galactose transferase, galT

50、)半乳糖激酶半乳糖激酶(galactose kinase, galK)這這3個酶的作用是使半乳糖變成葡萄糖個酶的作用是使半乳糖變成葡萄糖-1-磷酸。磷酸。因為半乳糖的利用效率比葡萄糖低，人們猜想葡萄糖因為半乳糖的利用效率比葡萄糖低，人們猜想葡萄糖存在時半乳糖操縱子不被誘導，但實際上有葡萄糖存存在時半乳糖操縱子不被誘導，但實際上有葡萄糖存在時，在時，gal 操縱子仍可被誘導。操縱子仍可被誘導?，F已分離到一些突變株，其中一類突變株能在不含葡現已分離到一些突變株，其中一類突變株能在不含葡萄糖的培養基中高水平合成半乳糖代謝酶類萄糖的培養基中高水平合成半乳糖代謝酶類gal 結構結構基因高效表達）；基因高

51、效表達）；而另一類突變株中而另一類突變株中gal 基因的表達完全依賴于葡萄糖，基因的表達完全依賴于葡萄糖，培養基中如無葡萄糖存在，這些細菌的培養基中如無葡萄糖存在，這些細菌的gal 基因不表達，基因不表達，不合成半乳糖代謝酶類。不合成半乳糖代謝酶類。n分析分析gal 操縱子操縱子P-O區的區的DNA序列發現，該操縱子確實存序列發現，該操縱子確實存在兩個相距僅在兩個相距僅5bp的啟動子，可以分別起始的啟動子，可以分別起始mRNA的合成。的合成。每個啟動子擁有各自的每個啟動子擁有各自的RNA聚合酶結合位點聚合酶結合位點S1和和S2。n從從S1起始的轉錄只有在培養基中無葡萄糖時，才能順利進起始的轉錄

52、只有在培養基中無葡萄糖時，才能順利進行，行，RNA聚合酶與聚合酶與S1的結合需要半乳糖、的結合需要半乳糖、CAP和較高濃度和較高濃度的的cAMP。n從從S2起始的轉錄則完全依賴于葡萄糖，高水平的起始的轉錄則完全依賴于葡萄糖，高水平的cAMP-CAP能抑制由這個啟動子起始的轉錄。當有能抑制由這個啟動子起始的轉錄。當有cAMP-CAP時，時，轉錄從轉錄從S1開始，當無開始，當無cAMP-CAP時，轉錄從時，轉錄從S2開始。開始。 結構特點結構特點 (1)雙啟動子：雙啟動子：P1依賴于依賴于cAMP-CAP，轉錄起點為，轉錄起點為+1，-10順順 序位于序位于-12-6，稱為，稱為-10S1；P2不

53、依賴于不依賴于cAMP-CAP，轉，轉 錄起點為錄起點為-5，-10順序位于順序位于-17-11，稱為，稱為-10S2； (2)雙操縱基因：雙操縱基因：OE 位于位于CAP位點內，位點內，OI 在在galE內部；內部； (3) 無無-35順序。順序。 Gal 既可為碳源，同時既可為碳源，同時UDP-Gal又是合成細菌細又是合成細菌細胞壁的重要前體。胞壁的重要前體。 gal E P 1 cA M P-CA P galK TE OI P 2 OE (17 ) galR galU (62 ) (27 ) K T E PO galU galR m R N A G lu-1-P 阻 遏 物 G al激

54、酶 G al轉 移 酶 表 面 異 構 酶 尿 苷 轉 移 酶 U UD DP P- -G Gl lu u G al G Ga al l- -1 1- -P P U UD DP P- -G Ga al l + + G Ga al l- -1 1- -P P 圖16-23 E.coli gal 操 縱 子 的 結 構 ， 在 染 色 體 上 的 分 布 及 其 產 物 gal 操縱子的結構操縱子的結構 AAATTCTTGTGTAAACGATTCCACTAATTTA P1 -17 -11 P2 +CAP galE 起始點 TATGCTA CAP GGAA 76 CAP 位點 47 cAMP-CAP

55、 位點 -10S2 S-D galOI 90 90 80 80 70 70 60 60 50 50 40 40 30 30 20 20 10 +1 +10 +20 +30 +40 +50 +6010 +1 +10 +20 +30 +40 +50 +60 TTGTGTAAACGATTCCACTAA TATGGTT GalOE 12 (10S1 ) 6 圖 16-24 Gal 操縱子具有雙啟動子(P1，P2 )和雙操縱基因 (galOE,galOI )(1) 有有Gal P1啟動啟動 K,T,E 轉錄轉錄 無無 Glc 無無Gal P1不啟動不啟動 無無Gal OE 與與O I 結合形成環，僅轉結

56、合形成環，僅轉 有有 錄錄20bp 有有Gal P2啟動啟動 S2 轉錄轉錄galE，組成型，組成型(2) CAP-cAMP對對P1 正調節，對正調節，對P2 抑制抑制 (3) 阻遏物對阻遏物對P1，P2 都是負調控，都是負調控， CAP-cAMP 含量少時含量少時P2 可轉錄可轉錄 (機制不清機制不清)(4)P1與與RNA Pol親和力親和力 P2與與RNA Pol親和力，所親和力，所以在沒有以在沒有Glc而有而有Gal存在時，存在時，P1轉錄，而轉錄，而P2不轉錄。不轉錄。2. 調節調節沒有葡萄糖的條件下沒有葡萄糖的條件下有有Gal存在時，存在時，gal R位于位于62編碼的阻遏物失活，編

57、碼的阻遏物失活，CAP結合在結合在-4723區域，區域，RNA Pol結合在結合在-10S1區，區，CAP和和RNA Pol直接相互作用，使直接相互作用，使P1順利轉錄；順利轉錄；無無Gal時，時，Gal R結合在結合在OE上，上， OE離啟動子有一段距離，離啟動子有一段距離，當當Gal R結合在結合在OE上時不大可能像上時不大可能像lac操縱子中操縱子中lacI阻遏阻遏那樣去阻礙那樣去阻礙RNA Pol的結合，它阻斷的結合，它阻斷S1的轉錄可能有兩的轉錄可能有兩種方式：影響種方式：影響cAMP-CAP和和RNA聚合酶的作用；或通過聚合酶的作用；或通過干擾干擾cAMP-CAP與與DNA的相互作

58、用來阻斷。的相互作用來阻斷。有葡萄糖存在的情況下，有葡萄糖存在的情況下，cAMP -CAP含量少含量少當當Gal存在時，存在時，P1 不能啟動而不能啟動而P2 啟動，啟動，RNA聚合酶結聚合酶結合在合在-10 S2順序上，順序上，-10 S2TATGCTA和和-10 S1TATGGTT順序相似，從順序相似，從S2開始轉錄開始轉錄gal E而不轉錄而不轉錄另外的另外的2個基因個基因gal T和和gal K。若無若無Gal存在，存在，Gal R可結合在可結合在OE和和OI上，并使上，并使DNA彎彎曲形成莖環結構。曲形成莖環結構。S2位點阻遏作用和位點阻遏作用和S1的阻遏機制完的阻遏機制完全不同，在

59、上述條件下，即使有全不同，在上述條件下，即使有Gal R存在，存在，P2 仍不受仍不受阻遏開始轉錄組成型），但由于阻遏開始轉錄組成型），但由于OI上也有上也有Gal R的結的結合并且成環，故轉錄只進行合并且成環，故轉錄只進行20 bp便停止，這個過程如便停止，這個過程如何發生尚不清楚。何發生尚不清楚。為什么為什么gal 操縱子需要兩個轉錄起始位點？操縱子需要兩個轉錄起始位點？n半乳糖不僅可以作為唯一碳源供細胞生長，而且與之相關的物半乳糖不僅可以作為唯一碳源供細胞生長，而且與之相關的物質質-尿苷二磷酸半乳糖尿苷二磷酸半乳糖UDPgal是大腸桿菌細胞壁合成的是大腸桿菌細胞壁合成的前體。在沒有外源半

60、乳糖的情況下，前體。在沒有外源半乳糖的情況下，UDP-gal是通過半乳糖差是通過半乳糖差向異構酶的作用由向異構酶的作用由UDP-葡萄糖合成的，該酶是葡萄糖合成的，該酶是galE基因的產基因的產物。物。n生長過程中的所有時間里細胞必須能夠合成差向異構酶。假如生長過程中的所有時間里細胞必須能夠合成差向異構酶。假如只有只有S1一個啟動子，那么由于這個啟動子的活性依賴于一個啟動子，那么由于這個啟動子的活性依賴于cAMP-CAP，當培養基中有葡萄糖存在時就不能合成異構酶。，當培養基中有葡萄糖存在時就不能合成異構酶。n假如唯一的啟動子是假如唯一的啟動子是S2，那么，即使在葡萄糖存在的情況下，那么，即使在葡萄糖存在