1、    人B淋巴母細(xì)胞株Yam 1B產(chǎn)生具有 免疫抑制作用的因子        【 摘要 】目的對(duì)Yam 1B細(xì)胞自發(fā)產(chǎn)生的一種可抑制人T、B細(xì)胞增殖的可溶性因子(Yam-SF)進(jìn)行研究。方法3H-TdR摻入法進(jìn)行淋巴細(xì)胞增殖抑制測(cè)定，ELISA法測(cè)定免疫球蛋白，間接免疫熒光法測(cè)定IL-2R，CTLL-2細(xì)胞3H-TdR摻入法測(cè)定IL-2活性。結(jié)果Yam-1B培養(yǎng)上清(Yam-SF)經(jīng)pronase水解消化而失活，經(jīng)56處理10分鐘，或在pH10環(huán)境中處理

2、6小時(shí)抑制活性喪失，在pH2.0環(huán)境中可保持其抑制活性。凝膠過(guò)濾試驗(yàn)表明，培養(yǎng)上清抑制活性分布在分子量4300067000范圍內(nèi)，且TGF-抗體不能阻斷其抑制活性。 結(jié)論Yam-SF可能是一種新的免疫調(diào)節(jié)因子，該因子可抑制人T細(xì)胞及B細(xì)胞的增殖，并抑制正常B細(xì)胞免疫球蛋白的產(chǎn)生，但對(duì)PHA剌激的人淋巴細(xì)胞IL-2的產(chǎn)生以及IL-2受體(IL-2R)的表達(dá)無(wú)抑制作用。【 主題詞 】免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子B淋巴母細(xì)胞 A soluble immunosuppressive factor released by Yam 1B cell of a human B-lymphoblastoid cell li

3、neZhang Yongfa*,Ruan Linhai, Zhang Yuzhen,et al.*Xinxiang Medical College,Xinxiang 453003AbstractYam 1B,a human B lymphoblastoid cell line, spontaneously produced an immunoregulatory factor,which suppressed the proliferation of human T and B lymphocytes and inhibited immunoglobulin generation by nor

4、mal B cells.The serum-free Yam 1B culture supernatant inhibited neither the expression of IL-2 receptor nor the production of IL-2 in the lymphocytes stimulated with PHA. The inhibitory activity of Yam 1B supernatant(Yam-SF) was inactivated at 56 for 10 min and at pH10.0 for 6h and abrogated by dige

5、stion with pronase, but remained at pH2.0. Gel-filtration column assay showed a peak of inhibitory activity in the fraction containing molecules of apparent MW of 43kD to 67kD. The inhibitory activity was not blocked by the anti-TGF-beta antibody. These results indicate that Yam-SF appear to produce

6、 a novel immunoregulatory factor.Subject wordsImmunoregulationCytokinsB lymphoblastoid cells在自身免疫病等難治性免疫相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制中，免疫調(diào)節(jié)功能失調(diào)及變態(tài)反應(yīng)發(fā)揮著重要作用。而近年來(lái)的一系列研究表明，由B細(xì)胞產(chǎn)生并釋放的細(xì)胞因子在免疫調(diào)節(jié)以及變態(tài)反應(yīng)的調(diào)節(jié)中極為重要15，在這些因子中，既有增殖因子也有包括TGF-在內(nèi)的非特異性抑制因子6，7。1993年，日本學(xué)者森川等從一成人T細(xì)胞性白血病(ATL)患者末梢血細(xì)胞中建立了Yam 1B細(xì)胞株，該細(xì)胞株細(xì)胞膜表面表達(dá)SmIgG及CD23等B細(xì)胞表面標(biāo)記

7、，細(xì)胞內(nèi)IgM+，培養(yǎng)液中有少量IgM(10100ng/ml)釋放，T細(xì)胞系、髓系及粒系表面標(biāo)記陰性，ATL病毒相關(guān)抗原(ATLA)陰性，表明Yam 1B細(xì)胞為B細(xì)胞系細(xì)胞8。我們的初步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Yam 1B 細(xì)胞在培養(yǎng)中可自發(fā)產(chǎn)生一種對(duì)人T細(xì)胞及B細(xì)胞增殖具有抑制作用的可溶性因子。我們對(duì)該抑制因子(我們稱之為Yam-SF)進(jìn)行了詳細(xì)的研究。材料與方法試劑與單克隆抗體：RPMI 1640培養(yǎng)基、PHA-P、ConA、PMA、SAC、Ficoll-Hypaque、Sephacryl S-300以及3H-TdR均購(gòu)自華美公司，鼠抗人TGF-抗體及TGF-購(gòu)自Pharmacia公司。細(xì)胞株：Yam

8、1B 由日本島根大學(xué)森川茂教授惠贈(zèng)，CTLL細(xì)胞為本室保存，B淋巴細(xì)胞株1E8和前B淋巴細(xì)胞株679均購(gòu)自ATCC公司。Yam 1B細(xì)胞培養(yǎng)上清抑制因子：5×105/ml Yam 1B細(xì)胞于無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)72小時(shí)，收獲上清，濃縮50700倍備用。取濃縮培養(yǎng)上清過(guò)Sephacryl S-300層析柱，并檢測(cè)其淋巴細(xì)胞增殖抑制活性。淋巴細(xì)胞制備：將手術(shù)摘出的人扁桃體制成單細(xì)胞懸液，以Ficoll-Hypaque密度梯度離心，收集單個(gè)核細(xì)胞，以花環(huán)沉降分離法9分離純化T細(xì)胞和B細(xì)胞。為進(jìn)一步純化B細(xì)胞，上述方法中收集非花環(huán)形成細(xì)胞以Percoll不連續(xù)梯度離心(4，2

9、500r/min,25分鐘)，收集60%/70%界面間細(xì)胞即獲得高密度小B淋巴細(xì)胞。健康人外周血淋巴細(xì)胞的制備方法同上。淋巴細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)：以含10%胎牛血清的RPMI 1640制備106/ml的淋巴細(xì)胞懸液，于96孔板中加入105/孔，然后分別加入一定劑量的PHA-P、ConA、PMA或SAC。實(shí)驗(yàn)組加入50倍濃縮的Yam 1B培養(yǎng)上清，使每孔液體量達(dá)到0.2ml；空白對(duì)照組則加入等量的RPMI 1640；1E8或679對(duì)照組則加入等量的50倍濃縮的1E8或679細(xì)胞培養(yǎng)上清，于5% CO2，37條件下培養(yǎng)72小時(shí)，收獲前8小時(shí)加入3H-TdR10l，使其終濃度為18.5kBq(0.5Ci

10、)/ml，收獲并測(cè)定其3H摻入量。免疫球蛋白產(chǎn)生及檢測(cè)：105/孔人外周血單個(gè)核細(xì)胞(RBMNC)或扁桃體MNC在PWM(最終稀釋度150)存在或不存在條件下，加入或不加入50倍濃縮的Yam 1B或1E8或679培養(yǎng)上清，于5% CO2，37條件下培養(yǎng)7天，收集培養(yǎng)上清，以ELISA法測(cè)定其中IgM和IgG含量。IL-2的產(chǎn)生，IL-2R表達(dá)及檢測(cè)：105/孔 PBMNC在PHA-P(最終稀釋度1100)存在或不存在條件下，加入或不加入50倍濃縮的Yam 1B或1E8或679培養(yǎng)上清，于5% CO2，37條件下培養(yǎng)48小時(shí)，分別收集細(xì)胞及培養(yǎng)上清，采用間接免疫熒光法測(cè)定IL-2R10，上清中I

11、L-2活性測(cè)定采用CTLL-2細(xì)胞3H-TdR摻入法11。結(jié)果Yam 1B上清對(duì)T、B淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用：如1A所示，Yam 1B培養(yǎng)上清可顯著抑制PHA-P、ConA及PMA剌激的T細(xì)胞增殖反應(yīng)，而且這一抑制作用呈明顯的Yam 1B上清濃度依賴性，當(dāng)加入不經(jīng)稀釋的50倍濃縮的Yam 1B培養(yǎng)上清時(shí)，T細(xì)胞的增殖被完全抑制；Yam 1B培養(yǎng)上清對(duì)SAC及PMA剌激的B細(xì)胞增殖也呈濃度依賴抑制(1B)。而1E8及679培養(yǎng)上清則無(wú)抑制作用。1Yam 1B上清對(duì)扁桃體T、B淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用Fig 1. Inhibitory effect of Yam 1B supernatant on

12、the proliferation of tonsil T(A) or B(B) lymphocytes A:PHA,Con A,PMA;B:PMA,SAC2Yam 1B 上清抑制活性分析Fig 2. Analysis of the inhibitory activity of Yam 1B supernatant 3H-TdR incorporation of PHA-P stimulated PBMNC;Protein concentration-;Molecular weight markers: Ferritin,LDS,BSA,OA,Cyt CYam 1B上清抑制免疫球蛋白的產(chǎn)生：在

13、PWM剌激下，PBMNC和扁桃體MNC可產(chǎn)生IgM和IgG型免疫球蛋白，其中PBMNC產(chǎn)生免疫球蛋白的能力明顯高于扁桃體MNC，且以產(chǎn)生IgM為主。當(dāng)在培養(yǎng)體系中加入Yam 1B培養(yǎng)上清時(shí)，則PBMNC和扁桃體MNC免疫球蛋白的產(chǎn)生均受到明顯抑制，而且，這一抑制作用呈明顯的Yam 1B上清濃度依賴性(表1)。而1E8及679培養(yǎng)上清則無(wú)抑制作用。 表1Yam 1B培養(yǎng)上清對(duì)PWM剌激的PBMNC和扁桃體MNC免疫球蛋白產(chǎn)生的影響Table 1. Effect of Yam 1B supernatant on the immunoglobulin productionin PBMNC or to

14、nsillar MNC culture system stimulated by PWMCell source PWMYam-SF(%, vol/vol)Amount of Ig(ng/ml)IgMIgGPBMNC0423100208770896865530112113.12659187*610112* 6.21346165*300100*12.51125122*16268*251151103*8940*TonsillarMNC01026224972027552032293200 3.121872431477238*6.21339116*124176*12.5104155*56762*2511

15、1279*44677*P0.01 compared with “PWM()， Yam-SF(0)” group Yam-SF的理化性質(zhì)：Yam 1B培養(yǎng)上清在pH10的環(huán)境中處理6小時(shí)其抑制活性喪失，而在pH2.0的環(huán)境中則可保持其抑制活性；當(dāng)將其加熱至56處理10分鐘也可使其失活，而-20凍存則可保持其活性；以蛋白水解酶，如pronase處理該培養(yǎng)上清同樣可使其失活。凝膠過(guò)濾實(shí)驗(yàn)表明，培養(yǎng)上清抑制活性分布在分子量(4367)×103范圍內(nèi)，其峰值活性位于48.5×103(2)。Yam-SF與TGF-活性比較：105PBMNC在PHA-P(最終稀釋度1100)剌激下培養(yǎng)3天

16、，可出現(xiàn)明顯的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，而當(dāng)加入Yam 1B培養(yǎng)上清(終濃度12.5%vol/vol)后，這種增殖反應(yīng)受到明顯抑制，且Yam 1B培養(yǎng)上清對(duì)淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的抑制作用不被TGF-抗體所阻斷；同樣，加入TGF-(終濃度1ng/ml)后，這種增殖反應(yīng)受到明顯抑制，但TGF-對(duì)淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的抑制作用則被TGF-抗體所完全阻斷(表2)。Yam 1B培養(yǎng)上清對(duì)IL-2受體及IL-2產(chǎn)生的影響：如表3所示，PBMNC在PHA-P剌激下培養(yǎng)48小時(shí)，可有明顯的IL-2產(chǎn)生，加入Yam 1B培養(yǎng)上清對(duì)IL-2的產(chǎn)生無(wú)影響；Yam 1B培養(yǎng)上清對(duì)IL-2受體的產(chǎn)生也無(wú)抑制作用。1E8及679培養(yǎng)上清

17、亦無(wú)抑制作用。表2抗TGF-抗體不能阻斷Yam 1B培養(yǎng)上清的抑制活性Table 2. Antibody to transforming growth factor-beta does notblock the inhibitory activity of Yam 1B supernatantGroupPHAYam-SFAnti-TGF-antibodyTGF-Lymphocyte proliferation3 H-TdR incorporation(cpm)1-3656519282-2011386*3-2298295*4-3528320435-7221216-15283347-8121008

18、-2355152*9-342392780*10-710132*P0.01 compared with group 1, *P0.05 compared with group 2, *P0.001 compared with group 8 表3Yam 1B培養(yǎng)上清對(duì)PBMNC IL-2產(chǎn)生及IL-2R表達(dá)的影響Table 3. Effect of Yam 1B supernatant on the production of IL-2and the expression of IL-2R of PBMNCPHA-PYam-SFNIL-2(U/ml)IL-2R(%)-3.

19、7-12121.6011.950.25.3612116.1010.0*51.15.77*-125.5*P0.05 compared with “PHA-P(), Yam-SF(-)” group 討論在參與免疫應(yīng)答及其調(diào)節(jié)的細(xì)胞因子中，有增殖因子，如IL-2等，也有抑制因子，如TGF-、IFN-6，7等。其中由B細(xì)胞產(chǎn)生的抑制因子主要有IFN-及TGF-等。我們的結(jié)果顯示，Yam 1B，一株來(lái)源于ATL患者外周血的B淋巴母細(xì)胞細(xì)胞株可以產(chǎn)生并分泌一種蛋白質(zhì)類免疫抑制因子，這一抑制因子(Yam-SF)在pH10的環(huán)境中處理6小時(shí)其抑制活性喪失，而在pH2.0的環(huán)境中則可保持

20、其抑制活性；當(dāng)將其加熱至56處理10分鐘也可使其失活，而-20凍存則可保持其活性；以蛋白水解酶，如pronase處理該培養(yǎng)上清同樣可使其失活。其分子量在(4367)×103范圍內(nèi)，其峰值活性位于48.5×103。Yam-SF不但可以抑制T細(xì)胞及B細(xì)胞的增殖，而且可以明顯抑制IgG類及IgM類免疫球蛋白的產(chǎn)生，但不抑制IL-2的產(chǎn)生及IL-2受體的表達(dá)。從理化性質(zhì)上來(lái)看，Yam-SF無(wú)論是分子量還是對(duì)pH及溫度的敏感性均與IFN-等存在著明顯的差異；而與TGF-相比，二者對(duì)pH及溫度的敏感性均無(wú)明顯的差異，即使其發(fā)揮作用的特點(diǎn)也存在著明顯的一致性；即二者的抑制作用均不通過(guò)IL

21、-2及IL-2受體調(diào)節(jié)系統(tǒng)。為此，我們進(jìn)一步比較了Yam-SF與TGF-的活性，結(jié)果顯示，Yam-SF的抑制活性不能被TGF-抗體所阻斷，但TGF-的抑制活性可以被TGF-抗體完全阻斷，這一結(jié)果清楚地表明，Yam-SF與TGF-不是同一種細(xì)胞因子，盡管二者的理化性質(zhì)及作用特點(diǎn)存在著明顯的一致性。關(guān)于Yam-SF的進(jìn)一步研究尚在進(jìn)行之中。本項(xiàng)目受河南省自然科學(xué)基金資助(9504162058)作者單位：453003 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院(張永法，張玉珍)；河南醫(yī)科大學(xué)一附院(宋永平)；洛陽(yáng)醫(yī)學(xué)專科學(xué)校(阮林海)參考文獻(xiàn)1Adolf G R,Hass O A,Fischer P,et al.Spontaneo

22、us production of alpha and beta interferons in human lymphoblastoid and lymphoma cell lines. Arch Virol, 1982, 72169-178.2Gordon J,Ley S C,Melamed M D,et al.:Soluble factor requirements for the autostimulatory growth of B lymphoblasts immortalized by Epstein-Barr virus.J Exp Med,1984,1541554-1559.3F

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