1、細(xì)胞 CDK2/CYCLIN A激酶活性熒光共振能量轉(zhuǎn)移法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）主要用途細(xì)胞CDK2/CYCLINA 激酶活性熒光共振能量轉(zhuǎn)移法（FRET ）定量檢測試劑是一種旨在通過熒光探針EDANS供體和DABCYL受體雙重標(biāo)記的多肽底物，在CDK2/CYCLINE 抑制劑的存在下，受到CDK2/CYCLIN A 的磷酸化后，不能被位點(diǎn)特異性氨基肽酶切離，而發(fā)生熒光峰值的降低，即采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移法來測定樣品中酶活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)胞裂解萃取液樣品（動物、 人體）、部分或完全純化酶樣品中CDK2/CYCLIN A激酶的

2、特異活性定量檢測，以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，安全可靠。技術(shù)背景細(xì)胞周期素依賴性激酶2（cyclin dependent kinase 2 ；CDK2 ；），又稱為細(xì)胞分裂周期蛋白1（celldivision cycle1 ；CDC1 ）或 p33，屬于絲氨酸 /蘇氨酸激酶（ serine/threonine protein kinase）家屬成員之一。其與酵母細(xì)胞的 cdc28 和cdc2高度進(jìn)化保留。細(xì)胞周期素依賴性激酶2的催化亞體，與細(xì)胞周期素E然后A結(jié)合，允許細(xì)胞由 G1期進(jìn)入 DNA 合成期， 達(dá)到調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、 DNA 復(fù)制、細(xì)胞分裂等。

3、p21Cip1（CDKN1A ）and p27Kip1 （ CDKN1B ）是 CDK2 激酶的抑制劑。 CDK2/CYCLIN A激酶的磷酸化目標(biāo)序列為HHASPRK 。基于磷酸化多肽具有抗氨基肽酶切離的功能，通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移法（Fluorescence resonance energytransfer；FRET），即傳遞激發(fā)狀態(tài)的能量由處于較短波長的供體（donor）到覆蓋供體波長的受體 （acceptor），使得距離依賴性反應(yīng)的供體的散發(fā)光子淬滅（quench），使用 2個熒光探針 EDANS 供體和 DABCYL 受體作為FRET 對，來標(biāo)記的 CDK2 多肽底物的兩端，在氨基肽酶

4、（aminopeptidase）的作用下，釋放出強(qiáng)烈熒光的EDANS ；一旦在 CDK2/CYCLIN E 抑制劑二氨基吡唑 -1氫 4-基偶氮酚【 4- （3,5-diamino-1 H-pyrazol-4-ylazo ）-phenol】的存在下，底物受到 CDK2/CYCLIN A 的磷酸化（由 ATP的-磷酸根到多肽上單一絲氨酸殘基分子上），底物將不能被位點(diǎn)特異性氨基肽酶切離，而無法釋放出EDANS ，由此根據(jù)產(chǎn)物熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長340nm，散發(fā)波長 490nm）的降低，來定量測定細(xì)胞周期素依賴性激酶2/細(xì)胞周期素 A 的特異活性。CDK2/CYCLIN A反應(yīng)系統(tǒng)為：CDK2/CYC

5、LIN ADABCYL - HHASPRK - EDANS+ATPDABCYL -HHApSPRK - EDANSaminopeptidaseDABCYL -HHApSPRK - EDANSDABCYL -HHApSPRK - EDANSaminopeptidaseDABCYL - HHASPRK - EDANSDABCYL - HHA+SPRK - EDANS產(chǎn)品內(nèi)容清理液（ Reagent A）60 毫升裂解液（ Reagent B）10 毫升緩沖液（ Reagent C）1.5 毫升底物液（ Reagent D）50 微升1反應(yīng)液（ Reagent E）500 微升酶解液（ Reagen

6、t F）500 微升終止液（ Reagent G）500 微升標(biāo)準(zhǔn)液（ Reagent H）10微升磷酸化底物液（ Reagent I）50微升（另購）產(chǎn)品說明書1 份保存方式保存清理液（ Reagent A）和裂解液（ Reagent B）在 4冰箱里，其余的保存在20冰箱里；底物液（Reagent D）和標(biāo)準(zhǔn)液（ Reagent H）避免光照，有效保證6 月用戶自備CDK2/CYCLIN A激酶：用于抑制劑篩選磷酸化底物液（Reagent I）：用于測定樣品磷酸化程度的反應(yīng)試劑1.5 毫升離心管：用于標(biāo)準(zhǔn)樣品操作和樣品保存的容器15 毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器細(xì)胞刮脫棒：用于貼壁細(xì)

7、胞脫離（微型）臺式離心機(jī)：用于細(xì)胞預(yù)處理黑色酶標(biāo)板：用于反應(yīng)和比色的容器熒光酶標(biāo)儀：用于熒光分析實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)開始前，將20冰箱里的試劑置入冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作。一、樣品準(zhǔn)備1 準(zhǔn)備好 25cm2 細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm 細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細(xì)胞（1 至 5 X 10 6 細(xì)胞）2 小心加入 3 毫升清理液（ Reagent A），覆蓋生長表面3 小心抽去清理液4 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：避免使用胰酶消化 ）5 加入 3 毫升清理液（ Reagent A），混勻細(xì)胞6 移入到預(yù)冷的15 毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開始 ）7 放進(jìn) 4臺式離心機(jī)離心5 分鐘，速度為30

8、0g8 小心抽去上清液9 加入 500 微升裂解液（ Reagent B），充分混勻10轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5 毫升離心管11強(qiáng)力渦旋震蕩15 秒12置于冰槽里孵育30 分鐘13放進(jìn) 4微型臺式離心機(jī)離心5 分鐘，速度為16000g（或 13000RPM ，例如 eppendorf 5415）14小心移取500 微升上清液到新的預(yù)冷的1.5 毫升離心管15移取 10 微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒HL30030.1 ）216即刻放進(jìn) 70保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作二、 測定準(zhǔn)備1 準(zhǔn)備好待測樣品（例如細(xì)胞萃取液或純化酶樣品等），置于冰槽里2 設(shè)定好熒光

9、酶標(biāo)儀（溫度為25）：激發(fā)波長 360nm，散發(fā)波長 490nm，并置零3 準(zhǔn)備好 5個 1.5 毫升離心管，標(biāo)記為 1 至 5 號管4 加入 98 微升 緩沖液（ Reagent C）到 1 號管5 分別加入50微升 緩沖液（ Reagent C）到 2 至 5 號管6 移取 2微升標(biāo)準(zhǔn)液（ Reagent H）到 1 號管，混勻7 小心移取50微升 1號管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（ Reagent H）到 2 號管，混勻8 小心移取50微升 2號管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（ Reagent H）到 3 號管，混勻9 小心移取50微升 3號管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（ Reagent H）到 4 號管，混勻10將 1 至 5

10、號管放進(jìn)冰槽里備用；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見下表管號緩沖液（ Reagent C ）標(biāo)準(zhǔn)液（ Reagent H）標(biāo)準(zhǔn) EDANS 濃度198 微升2 微升5 微摩爾 /升250 微升50微升 1號管2.5 微摩爾 /升350 微升50微升 2號管1.25 微摩爾 / 升450 微升50微升 3號管0.625 微摩爾 /升550 微升00三、熒光測定（一）活性測定1 在 96 孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測樣品2 分別移取20微升 緩沖液（ Reagent C）到相應(yīng)孔中3 分別加入2 微升 底物液（ Reagent D）4 分別加入20微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液或待測樣品（20 微克純化酶或 100

11、微克細(xì)胞裂解萃取液蛋白） （注意：樣品須清澈 ）5 分別加入20微升 反應(yīng)液（ Reagent E）6 輕輕搖動96孔酶標(biāo)板 30 秒7 在室溫下孵育60 分鐘8 分別加入 20 微升酶解液（ Reagent F）9 輕輕搖動 96 孔酶標(biāo)板 30 秒10在室溫下孵育30 分鐘11分別加入20 微升終止液（ Reagent G）12即刻放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀檢測：獲得相對熒光讀數(shù)RFU（ Relative Fluorescence Unit ）13活性計(jì)算：1）構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y 軸）為相對熒光單位RFU；橫座標(biāo)（ X 軸）為標(biāo)準(zhǔn)EDAN 濃度（微摩爾 /升）2）根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中所釋放的E

12、DAN 濃度3）實(shí)際活性計(jì)算：3 樣品 EDAN 濃度（微摩爾 /升） X 樣品稀釋倍數(shù) ÷1（小時；反應(yīng)時間） 納摩爾 EDAN/ 毫升 /小時 ÷（樣品蛋白濃度）毫克 /毫升納摩爾 EDAN/ 毫克 /小時（二）活性抑制測定（抑制劑篩選）1 在 96 孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景、零抑制、完全抑制和待測抑制劑樣品2 按下表加入試劑內(nèi)容物樣本背景零抑制對照完全抑制對照待測抑制活性（ 0抑制）（ 100抑制）緩沖液（ Reagent17 微升20 微升40 微升15 微升C ）底物液（ Reagent2 微升2 微升2 微升D ）待測抑制劑5 微升5 微升用戶自備的純化酶2

13、0 微升20 微升20 微升20 微升反應(yīng)液（ Reagent20 微升20 微升20 微升E）96 孔板每孔總量背景孔（ 62 微升）3 輕輕搖動 96孔酶標(biāo)板30 秒4 在室溫下孵育60 分鐘5 分別加入 20微升 酶解液（ Reagent F）6 輕輕搖動 96孔酶標(biāo)板30 秒7 在室溫下孵育30 分鐘8 分別加入 20微升 終止液（ Reagent G）9 即刻放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀檢測：獲得相對熒光讀數(shù)零抑制孔完全抑制孔待測抑制劑樣品（62 微升）（62 微升）（ 62 微升）RFU（ Relative Fluorescence Unit ）10抑制活性計(jì)算：1） （完全抑制讀數(shù)零抑制讀數(shù)）

14、（抑制劑樣品讀數(shù)樣本背景讀數(shù)） ÷（完全抑制讀數(shù)零抑制讀數(shù)）實(shí)際抑制百分率2） IC50： 50抑制率所需的抑制劑濃度X （所需抑制劑濃度）（已知抑制劑樣品濃度÷實(shí)際抑制百分率）X 50 3）直接構(gòu)建抑制曲線：縱座標(biāo)（Y 軸）為相對熒光單位RFU；橫座標(biāo)（ X 軸）為已知抑制劑濃度（三）磷酸化百分率測定1 在 96 孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景、零磷酸化、完全磷酸化和待測樣品2 按下表加入試劑內(nèi)容物樣本背景完全磷酸化對照零磷酸化對照待測樣品磷酸化（100磷酸化）（ 0磷酸化）緩沖液（ Reagent22 微升40 微升40 微升20 微升C ）底物液（ Reagent2 微

15、升2 微升D ）樣品液20 微升20 微升4磷酸化多肽2 微升反應(yīng)液（ Reagent20微升20微升20微升20微升E）96 孔板每孔總量背景孔完全磷酸化孔零磷酸化孔待測樣品（ 62微升）（62微升）（62微升）（ 62微升）3 輕輕搖動 96 孔酶標(biāo)板 30 秒4 在室溫下孵育60 分鐘5 分別加入 20 微升酶解液（ Reagent F）6 輕輕搖動 96 孔酶標(biāo)板 30 秒7 在室溫下孵育30 分鐘8 分別加入 20 微升終止液（ Reagent G）9 即刻放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀檢測：獲得相對熒光讀數(shù)RFU（ Relative Fluorescence Unit ）10磷酸化百分率計(jì)算： （完全磷酸化讀數(shù)零磷酸化讀數(shù)）（樣品讀數(shù)樣本背景讀數(shù)） ÷（完全磷酸化讀數(shù)零磷酸化讀數(shù)）樣品磷酸化百分率注意事項(xiàng)1 本產(chǎn)品為 25 次操作，包括標(biāo)準(zhǔn)液2 操作時，須戴手套3 系統(tǒng)操作過程中，標(biāo)準(zhǔn)液測定只需1 次4 樣品須澄清，至關(guān)重要5 孵育反應(yīng)完成后即刻進(jìn)行熒光測定6 熒光濾波器可以使用激發(fā)波長在340±30nm，散發(fā)波長490±30nm7 待測樣本為粗提酶樣品，其蛋白濃度為20 微克 /20 微升；待測樣本為細(xì)胞裂解懸液，其蛋白濃度為100微克 /20 微升（本公