1、    孤兒肽在自發性高血壓大鼠和家兔心血管系統的分布米立國魏英杰丁金鳳 【摘要】目的研究孤兒肽(orphanin FQ,OFQ)在自發性高血壓大鼠和家兔心血管系統的分布。方法采用反轉錄 -聚合酶鏈反應(RT-PCR)法和免疫組織化學方法。結果RT-PCR的結果顯示，OFQ的前體mRNA在自發性高血壓大鼠的主動脈、肺動脈、腎動靜脈均有較高的表達，其表達水平與腦組織表達水平相似，心房組織也有弱的表達，但在心室組織未見OFQ前體mRNA的表達。免疫組織化學結果顯示，心肌細胞OFQ免疫反應陰性，心房內膜的內皮細胞和主動脈、腎動靜脈的內皮細胞及血管平滑肌細胞均含

2、有OFQ免疫反應陽性顆粒，此外在腎小球也觀察到了OFQ反應陽性細胞。結論OFQ可能是對心血管系統和腎臟功能有一定調節作用的調節肽，但其具體的功能及調節機制尚待進一步研究。 【關鍵詞】孤兒肽心血管系統反轉錄-聚合酶鏈反應免疫組織化學家兔自發性高血壓大鼠 CARDIOVASCULAR DISTRIBUTION OF ORPHANIN FQ IN SPONTANEOUSLY HYPERTENSIVE RAT AND RABBIT Mi Liguo, Wei Yingjie, Ding Jinfeng (Cardiovascular Institute and Fu Wai Hospital, Chi

3、nese Academy of Medical Sciences Peking Union Medical College, Beijing) 【Abstract】 Objective To investigate the cardiovascular distribution of orphanin FQ (OFQ) and OFQ precursor mRNA in spontaneously hypertensive rat(SHR) and rabbit. Methods Reverse transcription-polymerase chain reacrtion(RT-PCR),

4、 and immunohistochemical method were used. Results The expression of OFQ precursor mRNA was detected from aorta, pulmonary artery, renal artery and vein of rat at a high level comparable with the amounts of brain, and a weak expression signal could also be observed in the atrium. The positive immuno

5、reactive OFQ was detected in the tissues of aorta, atrium and renal of rabbit, as well as in smooth cells, endothelium and glomerulus. Conclusion These observations suggest that orphanin FQ might play a role in regulating the function of cardiovascular system and kidney, but the exact underlying mec

6、hanism needs further studying. 【Key words】 Orphanin FQ; Cardiovascular system; Reverse transcription-polymerase chain reaction; Immunohistochemistry; Rabbit;Spontaneously hypertensive rat 1995年Meunier1和Reinscheid2等分別自大鼠和豬的腦組織中分離出一種新的17肽，稱為孤兒肽(orphanin FQ, OFQ)或痛敏肽(nociceptin)，OFQ來自一個較大的前體，與阿片肽有較高的同源

7、性，并被證明為阿片受體樣受體(opioid receptor-like receptor, ORL1)的內源性配體1、2，故很快引起人們的關注。OFQ前體mRNA在中樞神經系統有廣泛的分布，在外周組織如脾、胎兒腎、卵巢等也觀察到了OFQ前體mRNA的表達35，但在心血管系統是否有OFQ分布尚未見報道。此外，最近的研究證明：經靜脈或側腦室注射OFQ可引起大鼠動脈壓降低和抗鈉利尿等功能6，7。本研究用RT-PCR和免疫組織化學方法分別對自發性高血壓大鼠和家兔的心血管系統進行了研究，以觀察心血管組織中是否有OFQ的分布，并為進一步探討OFQ的心血管效應及作用機制提供參考。 材料和方法 1. RT-P

8、CR 選用體重250g的自發性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat,SHR)，雌雄不拘,(由北京阜外醫院實驗動物科提供)依據Chomczynski等8建立的一步法提取各組織的總RNA，采用紫外吸收法進行RNA定量，各組RNA樣品的A260/A280nm吸光度比值均在1.82.0之間。將2g的總RNA反轉錄成相應的cDNA。 據已報道的OFQ前體cDNA核甘酸序列4合成引物，正義鏈引物(sense primer)為：5"-T GGA TCC CAC GGC TGC ACC ATG AA-3",+9+23,反義鏈引物(antisense pr

9、imer)為：5"-GAA TTC GGC TCC TTC TGG CTA CAC ATT AC-3"，+563+591，由Sangon公司合成，此對引物的擴增片段長為585bp。PCR參照Martin等9建立的方法進行。PCR條件為：94變性1min，56退火1.5min，72延伸2.5min，擴增30個循環。取15l PCR產物在含有溴化乙啶的1.5%的瓊脂糖凝膠上電脈，電泳結果應用Doc1000分析儀(Bio-Rad公司)進行分析。 2. 免疫組織化學染色 抗兔OFQ抗體由美國Phoenix公司提供，免疫組織化學染色試劑盒購自北京華美生物工程公司。選用體重1.8kg家

10、兔，1.3%戊巴比妥鈉麻醉后取心，主動脈，腎和腦組織用中性福爾馬林固定12h以上，冰凍切片，厚10m，0.3%H2O2封閉內源性過氧化物酶，0.1%胰蛋白酶修復抗原，25%小牛血清封片，上述各步間用PBS洗3×5min，以下染色程序按試劑盒要求進行。第一抗體的稀釋度為1500。陰性對照省去一抗。 結果 1. RT-PCR結果 1.5%瓊脂糖凝膠電脈后的影像顯示：陰性對照(水)中未見任何擴增條帶，心室組織未見585bp的條帶，心房組織可觀察到熒光信號較弱的585bp條帶，主動脈、肺動脈、腎動脈和腎靜脈組織均有585bp條帶，其熒光信號的強度和帶形與陽性對照腦組織近似，各組織內的內參照-

11、actin的熒光信號強度和帶形一致(圖1)。可見OFQ前體mRNA在主動脈、肺動脈、腎動脈和腎靜脈組織均有較高表達，其表達量近似于腦組織，而在心房組織中，OFQ前體mRNA的表達水平較低。 圖1心血管系統OFQ前體mRNA的RT-PCR產物的瓊脂糖 凝膠電泳結果：M.Marker,A.陽性對照(腦組織)，B.心房，C.心室， D.主動脈，E.肺動脈，F.腎動脈，G.腎靜脈，H.陰性對照(水) Fig.1 Amplification of OFQ precursor mRNA in cardiovascular system by RT PCR.PCR products were analyze

12、d by agarose gel electrophoresis.M，molecular mass marker;A，positive control(brain);B，atrium;C，ventricle;D，aorta;E，pulmonary artery;F，renal artery,G，renal vein;H，negative control(water). 2.免疫組織化學染色結果 免疫反應細胞呈棕色，背底不著色或呈淺黃色。免疫組織化學染色結果與RT-PCR結果一致，并進一步確定了OFQ在各組織中的具體分布位置。在心房組織中內皮細胞呈OFQ免疫反應性，心肌細胞中未見OFQ免疫反應顆

13、粒(圖2)。主動脈組織中內皮細胞和平滑肌細胞呈OFQ免疫反應性(圖3)，此外，腎臟血管內膜的內皮細胞和中膜的平滑肌細胞呈現OFQ陽性反應，在腎小球內也觀察到了OFQ反應細胞(圖4)。陽性對照組織(大腦皮質)有OFQ陽性反應神經元(圖5)，陰性對照均呈陰性。 討論 盡管OFQ與阿片肽，ORL1與阿片肽受體、和有較高的同源性，但OFQ不能與阿片受體結合而發揮作用，而且阿片肽也不與ORL1結合，說明OFQ有其獨特的作用機制和途徑。經靜脈或側腦室注射OFQ可引起大鼠動脈壓降低和抗鈉利尿，其反應程度與注射劑量有關，因此Kapusta等6認為內源性的OFQ可能通過中樞神經對機體的水電解質平衡及動脈壓調節發

14、揮重要作用。心血管系統和腎臟是否可以合成及分泌OFQ尚未見報告。本研究用RT-PCR和免疫組織化學染色方法分別對自發性高血壓大鼠和家兔的心血管系統的研究結果顯示：心房和血管的內皮細胞，血管平滑肌細胞和腎小球均有OFQ的分布，在腎小球尚不能確定OFQ反應陽性細胞為何種細胞，這需進一步研究確定。可見除了神經系統可合成和分泌OFQ，參與神經系統功能的調節外，心血管系統和腎臟也可合成和分泌OFQ，它們可能以自分泌或旁分泌的形式參與心血管和腎功能的調節。但也有報道4用Northern blot雜交技術在胎兒腎觀察到OFQ前體mRNA表達，而在胎兒心和成人腎、心及大鼠腎臟均未觀察到其表達。這些報道與本研究

15、結果有所不同，推測其原因可能是Nothacker等所用Northern blot雜交技術的靈敏度較RT-PCR方法低，當組織中的mRNA表達量很低時不易被檢測出來。 圖2心房：箭頭示OFQ免疫反應陽性細胞內皮細胞；m示OFQ免疫反應陰性細胞心肌細胞.×200 圖3主動脈：內皮細胞()和平滑肌細胞(s)呈OFQ免疫反應陽性.×400 圖4腎臟：動脈(A)和靜脈(V)的管壁及腎小球(G)內均可見OFQ免疫反應陽性顆粒，箭頭示OFQ免疫反應陽性的內皮細胞.×100 圖5陽性對照(腦組織)：箭頭示OFQ免反應陽性神經元.×1 000 Fig.2Atrium:th

16、e arrow shows the OFQ immuno-reaction positive endothelium. m shows the OFQ reaction negative myocardium of atrium. ×200 Fig.3 Aorta:the OFQ immuno-reaction positive particles can be detected in epithelium() and smoth cells (s)×400 Fig.4 Kidney: the OFQ immunoreaction positive particles ca

17、n be detected in the artery (A), vein(V) and glomeruli(G). The arrow shows the OFQ immuno-reaction positive cells-endothelium. ×100 Fig.5 Positive control(brain):the arrows show the OFQ immuno-reaction positive neuron ×1 000 * 河北醫科大學CMB學員 Molecular Medicine Center of Cardiovascular Institu

18、te, Chinese Academy of Medical Sciences Peking Union Medical College, Beijing 100037, China 作者單位:米立國*魏英杰丁金鳳(中國醫學科學院 中國協和醫科大學心血管病研究所；阜外心血管病醫院，北京100037) 參考文獻 1Meunier JC, Mollereau C, Toll L, et al. Isolation and structure of the endogenous agonist of opioid receptor-like ORL1 receptor. Nature, 1995,3

19、77(12):532 2Reinscheid RK, Nothacker HP, Bourson A, et al. Orphanin FQ: a neuropeptide that activates an opioidlike G protein-coupled receptor. Science, 1995,270(3):792 3Mollereau C, Simons MJ, Soularue P, et al. Structure, tissue distribution and chromosomal Loca lization of the prepronociceptin ge

20、ne. Proc Natl Acad Sct(USA), 1996,93(8):8666 4Nothacker HP, Reinschid RK, Mansour A, et al. Primary structure and tissue distribution of theorphanin FQ precursor. Proc Natl Acad Sct(USA),1996,93(8):8677 5Houtani T, Nishi M, Takeshima H, et al. Structure and regional distribution of nociceptin/orphaninFQ precursor. Biochem Biophys Res Commun, 1996,219(3):714 6Kapusta DR, S