1、中國現代普通外科進展基礎研究FundamentalResearch大鼠肝臟冷/熱缺血再灌注損傷鈉鉀ATP酶、鈣ATP酶及鎂ATP酶與肝細胞死亡方式的研究包維民1郭永章1唐映梅2陸曉青1孫輝1趙新文1昆明醫學院第二附屬醫院實驗中心(云南昆明650101)2中山大學附屬一院消化內科(廣東廣州510080)1【摘要】目的:研究肝臟冷/熱血再灌注損傷條件下,鈉鉀ATP酶、鈣ATPATP酶及鎂ATP酶活性與細胞凋亡和脹亡的關系,并探討減少此類損傷的途徑。方法:建立大鼠肝門部分阻斷熱缺血1h再灌注模型及大鼠原位肝移植冷缺血1h再灌注模型,分別于再灌注0h、1h、12h和72h處死取材,測定肝細胞鈉鉀ATP

2、酶、鈣ATP酶及鎂ATP酶活性。用形態學及AnnexinV、PI雙染法流式細胞儀定量測定早期細胞凋亡和脹亡百分數。結果:與對照組相比,冷/熱缺血1h(再灌注0h)后鈉鉀ATP酶、鈣ATP酶及鎂ATP酶活性均持續顯著下降,再灌注1h達低谷。但熱缺血再灌注后72h鈉鉀ATP酶活性恢復,鈣ATP酶及鎂ATP酶活性仍未恢復。冷缺血再灌注后12h鈣ATP酶先恢復活性,72h鈉鉀ATP酶、鎂ATP酶活性才恢復。細胞死亡方式:冷缺血再灌注損傷,細胞死亡以凋亡為主,并于再灌注后12h后到頂峰。熱缺血1h脹亡細胞顯著增多,再灌注1h后減少,細胞死亡方式轉為以凋亡為主。結論:肝臟冷/熱缺血再灌注損傷均能導致3種A

3、TP酶活性下降,細胞內離子濃度失衡,熱缺血期ATP酶活性嚴重下降,細胞死亡,以脹亡為主。冷缺血期ATP酶輕度下降,細胞死亡以凋亡為主。術前或術中給予能量物質,對提高鈉鉀ATP酶、鈣ATP酶及鎂ATP酶活性,減輕炎癥反應,延長肝門阻斷時間有利?！娟P鍵詞】缺血再灌注損傷Na+K+交換ATP酶Ca2+ATP酶Ca2+Mg2+ATP酶細胞凋亡細胞脹亡大鼠,Sprague2Dawley【中圖分類號】R363【文獻標識碼】A【文章編號】100929905(2004)0620343204Theeffectofcold/warmischemiareperfusioninjuryoncelldeathpatte

4、rnandtheactivitiesofNa2KATPase,Mg+2+2AT2PaseandCa2+ATPaseinliverofratsBAOWei2min1,GUOYong2zhang1,TANGYing2mei2,LUXiao2qing1,SUNHui1,ZHAOXin2wen11DepartmentofCenterLaboratoryofGeneralSurgery,TheSecondAffiliatedHospi2talofKunmingMedicalColleges(Kunming650101,China)2DepartmentofGastroenterology,TheFirs

5、tAffiliatedHospitalofZhongshanUni2versity(Guangzhou510080,China)作者簡介包維民(19752),男,博士研究生,主要從事肝膽外科專業。地址:云南省昆明市黃土坡麻園1號(650101)昆明醫學院第二附屬醫院實驗中心。Tel:(0871)53512812273113888515556E2mail:baoweimin343中國現代普通外科進展2004年12月第7卷第6期【ABSTRACT】Objective:Toseekeffectivewaytoreduceischemia/reperfusion(I/R)injury,weinvest

6、igatetherelationbetweentheactivitiesofionchannelsuchasNa2KATPase,Ca+2+ATPaseandMg2+ATPaseandthepercentageofapoptosishepatocytesandoncosishepatocytesinratliverfollowingcold/warmischemia/reperfusion.Methods:Modelsofwarmischemia/reperfusionofpartialliverveinandhepaticarteryofischemi2a,coldischemia/repe

7、rfusionoforthotopiclivertransplantationweremade.TheactivitiesofNa2KATPase,+2+2+CaATPaseandMgATPasewereexaminedat1h,12hand72hfollowingreperfusion,andat1hofischemi2a.Andthepercentageofapoptosishepatocytesandoncosishepatocyteswereobservedwithmethodofmor2phologyandAnnexinV,PIstain.Results:Ingroupsofwarm

8、ischemia,theactivitiesofATPasesreducedim2mediatelyfollowing1hofischemia,fellingintothelowestat1hofreperfusion.Andoncosiswasthedominantdeathmodelofhepatocytesduringtheischemiaphaseof1h.Afterreperfusion,theactivitiesofNa+2K+ATPaseincreasedandthedeathmodelofhepatocytesconversedintoapoptosis,buttheactiv

9、itiesofCaMg2+2+ATPaseandATPasewerestillonlowlevelafter72hofreperfusion.Incoldischemiagroups,theactivitiesofATPasesdecreasedcontinually,fellingintolowestat1hofreperfusion.Andapoptosiswasthedominantdeathmodelofhepatocytesduringtheischemiaandreperfusionphase.TheactivitiesofATPaseincreasedafterreperfusi

10、on,buttherecoveryofCa2+ATPasewasfasterthanthatofNa2KATPaseandMg+2+ATPase.Conclusion:BothcoldI/RinjuryandwarmR/IinjurycanmaketheactivitiesofATPasedecrease,leadingtoimbalanceofionicconcentrationincell,causingoncosisinperiodofwarmischemiaandapoptosisintheperiodofcoldischemia.Itwouldbeusefultoimprovethe

11、activitiesofNa+2K+ATPase,Ca2+ATPaseandMg2+ATPaseforreducingtheI/Rinjury,iftheenergywasaddministratedbeforeoperationorduringoperation.【KEYWORDS】IschemiaReperfusioninjuryNa+2K+2ExchangingATPaseCa2+2TransportingATPaseCa2+Mg2+2ATPaseApoptosisOncosisRats,Sparague2Dawley肝臟缺血再灌注損傷有熱缺血和冷缺血。兩種條件下細胞代謝,能量狀態變化,

12、治療和處理方法不同。本研究利用大鼠肝門阻斷再灌注模型熱缺血組及大鼠原位肝移植再灌注模型冷缺血組,探討熱/冷缺血再灌注條件下,鈉鉀ATP酶、鈣ATP酶及鎂ATP酶活性的變化及其對細胞凋亡和脹亡的影響。11材料與方法111建立大鼠肝臟冷/熱缺血再灌注損傷模型采用成年、清潔級SpragueDawley大鼠(昆明醫學院實驗動物中心提供),體重200300g,雌雄不限。實驗前12h禁食,自由飲水。動物隨機分為11組。對照組5只開腹后輕微翻動肝臟即處死取材。其余分為兩大組分別制做大鼠肝門部分阻斷熱缺血1h再灌注模型及大鼠原位肝移植冷缺血1h再灌注模型。并于再灌注0h、1h、12h和72h處死取材。取樣后所

13、有樣本處理均在低溫條件下完成。大鼠肝臟熱缺血再灌注模型參照Ohmori報道的方法1,制備大鼠70%肝臟1h缺血再灌注模型。術中注意保持大鼠腹腔內溫度。大鼠原位肝移植模型參照段偉東報道的方法稍加改進2。供體采用腹主動脈灌注法,熱缺血時間接近0min,供肝切取后立即保存于04°C的林格液中,移植肝冷缺血時間約為(60.9±5.6)min。受體手術無肝期為(18±4.9)min。112肝細胞鈉鉀ATP酶、鈣ATP酶及鎂ATP酶活性測定采用定磷法,試劑盒購自南京建成生物工程研究所,按說明書操作。ATP酶活性以每小時每毫克組織蛋白中ATP酶分解ATP產生1mol無機磷的量作

14、為一個ATP酶活力單位,即(molmg-1h-1)。113細胞凋亡和脹亡11311形態學鑒別采用透射電鏡觀察。11312定量學測定取肝組織1g,生理鹽水洗凈,剪碎,振蕩后300目篩網過濾,收集細胞,制成細胞懸液,并調整細胞濃度至(1×106)個/ml。加標記有異硫氰酸熒光素聯結素V(AnnexinV2FITC)與碘化丙錠(propdiumiodide,PI)(均購自法國Immunotech公司),混勻雙染色。避光冰浴10min。使用Coul2terEPICS2XL流式細胞儀上機檢測,計數1000個細胞。結果判斷:正?；罴毎?AnnexinV、PI均低染;早期脹亡細胞,An2nexin

15、V、PI均高染;早期凋亡細胞,AnnexinV高染、PI低染。114統計學分析用SPSS9.0軟件包進行分析,取雙側檢驗P<0.05為差異有統計學意義。2結果211肝臟冷/熱缺血再灌注不同時間后鈉鉀ATP酶、鈣ATP酶及鎂ATP酶活性比較再灌注后3種酶均持續下降,并于再灌注1h達低谷。熱缺血再灌注72h鈉鉀ATP酶活性恢復,鈣ATP酶及鎂ATP酶活性未恢復。冷缺血再灌注12h鈣ATP酶先恢復活性,72h鈉鉀ATP酶、鎂ATP酶才恢復。同期三種酶活性冷缺血再灌注組均大于熱缺血再灌注組。見表1。344包維民,等1大鼠肝臟冷/熱缺血再灌注損傷鈉鉀ATP酶、鈣ATP酶及鎂ATP酶與肝細胞死亡方式

16、的研究表1肝臟冷/熱缺血再灌注鈉鉀ATP酶、鈣ATP酶及鎂ATP酶活性的測定(molmg-1h-1)組別肝移植冷缺血再灌注肝門阻斷熱缺血再灌注鈉鉀ATP酶鈣ATP酶鎂ATP酶鈉鉀ATP酶鈣ATP酶鎂ATP酶對照組54.57±0.703.83±0.894.69±0.594.57±0.703.83±0.894.69±0.59再灌注組052.35±0.4732.09±0.7332.16±0.6031.15±0.2131.29±0.3831.39±0.31152.30±0.

17、4432.10±0.1532.05±0.6330.66±0.2430.91±0.3031.04±0.221252.90±0.4433.04±0.643.57±0.661.26±0.3731.20±0.2332.12±0.7337253.52±0.803.51±1.104.67±0.933.20±1.182.07±0.4633.06±0.7733P<0.05VS對照組212冷/缺血再灌注后細胞凋亡和脹亡情況見圖1。圖1細胞

18、凋亡和脹亡形態學透射電鏡觀察左:早期脹亡細胞及細胞器全面腫脹是脹亡的特征性表現(×6000)右:凋亡細胞表現為核固縮、胞質濃結、細胞體急劇變小、細胞骨架解體(×6000)細胞凋亡和脹亡的流式細胞定量學測定與對照組比較:熱缺血組再灌注0h脹亡細胞顯著增多,再灌注1h后減少,12h恢復如常;1h凋亡細胞顯著增多,其后逐漸下降但72h仍高于對照組。大鼠肝移植冷缺血組再灌注0h后凋亡細胞顯著增多,再灌注后1h繼續增多,并于再灌注后12h后達頂峰,72h逐漸下降;同期脹亡細胞變化不大。見表2、圖2。表2肝臟冷/熱缺血再灌注凋亡細胞和脹亡細胞百分比(%)組別只數肝移植冷缺血再灌注肝門阻

19、斷熱缺血再灌注脹亡凋亡脹亡凋亡對照52.5±1.826.40±1.572.52±1.826.40±1.57再灌注組052.7±1.313.5±3.2332.0±5.934.58±0.63152.3±0.718.3±2.7326.6±2.9318.7±2.431252.5±1.424.0±8.231.9±0.812.6±2.137252.4±0.916.2±2.631.7±0.911.6±1.333

20、P<0.05VS對照組3討論缺血再灌注損傷是肝臟外科最常見的非手術性損傷,研究發現,同一病灶中往往存在著兩種不同形式的細胞死亡(固縮或腫脹),1995年Majno和Joris將以胞質腫脹和核溶解為主要細胞損傷表現,死亡過程不同于凋亡的細胞死亡稱之為脹亡3。脹亡是細胞被動死亡,表現為以ATP耗竭下細胞離子泵活性喪失,膜通透性增加伴隨細胞內水份增加、圖2肝細胞Annexin2V、PI雙染對照組、冷/熱缺血1h(再灌注0h)流式細胞圖例左:對照組Annexin2V、PI雙染中:冷缺血1hAnnexin2V、PI雙染右:熱缺血1hAnnexin2V、PE雙染DNA隨意斷裂,最終細胞腫脹破裂,細胞

21、內容物溢出,引起炎癥反應,是導致炎癥“瀑布”反應的啟動因素。而鈉鉀ATP酶、鈣ATP酶及鎂ATP酶是細胞的主要離子泵,控制著細胞內的主要離子濃度,在細胞脹亡中具有重要意義。脹亡和凋亡存在許多相似之處,例如都存在雙鏈DNA的斷裂、染色質凝集、凝膠電泳分析DNA片段的梯狀分布、細胞膜損傷、細胞跨膜電位減少等,因此過去所用的方法如TUNEL,hochest33258染色,凝膠電泳,跨膜電位檢測都不能有效的區別兩種細胞4。目前主要根據其形態學因素及對膜的損傷不同,采取形態學鑒別和AnnexinV2FITC與PI混勻雙染色兩種較為可靠的方法。脹亡細胞的形態學表現為:早期細胞腫脹,體積增大,胞膜起泡,通透

22、性增加,細胞質空泡化,內質網、線粒體腫脹,最后細胞膜完整性嚴重破壞,出現胞膜崩解,細胞核溶解。由于胞內容物外溢,脹亡細胞周圍有明顯炎癥反應。凋亡細胞的形態學特征表現為核固縮、胞質濃結、細胞體急劇變小、細胞骨架解體。由于早期凋亡細胞與早期脹亡細胞兩者細胞膜上磷脂對稱性的改變使磷脂酰絲氨酸(PS)暴露于細胞膜外,PS可特異結合標記有異硫氰酸熒光素(FITC)的連接素V(AnnexinVFITC),但是單獨使用這種方法并不能完全地特異地區別兩種細胞,而變性染色質著色的熒光染料碘化丙錠不能進入細胞膜完整的細胞,只能穿過損傷的細胞膜結合在DNA雙股螺旋鏈之間。因為早期凋亡細胞細胞膜完整,所以只能結合An

23、nexinV;而早期脹亡細胞可同時結合上述二種染料,正常細胞則兩種染料均不染色,PI單染則表明細胞膜完整性完全被破壞,這可能是由于細胞本身損傷太重或是在預處理過程中機械因素,導致細胞膜完全損壞。鈉鉀ATP酶、鈣ATP酶及鎂ATP酶在生理條件下又稱依賴ATP的膜結合蛋白酶。三者對建立跨膜的離子梯度,維持細胞膜電位,細胞生理活動,控制細胞容量、體溫及正常代謝,并為其它離子和營養素的轉運提供動力具有重要作用。缺血再灌注后與對照組相比,冷/熱缺血1h(再灌注0h)后鈉鉀ATP酶、鈣ATP酶及鎂ATP酶活性持續顯著下降,再灌注1h達低谷?？赡茉?1)當肝臟缺血時,肝線粒體供氧不足,ATP合成減少,而耗

24、能并不減少,導致細胞內ATP濃度下降,3種ATP酶活性也下降。(2)再灌注后ATP酶活性下降:ATP酶蛋白損傷增加:再灌注后活性氧自由基,細胞內鈣離子超載,過度的炎性反應等損傷膜結合蛋白酶。ATP酶合成不足:.Petr發現缺血后鈉鉀ATP酶1,2,3和1亞基mRNA水平不同程度的下降,再灌注后1增加,同時,復流后的鈣超載氧化應激導致其余亞基仍減少5。也有研究發現鈣ATP酶再灌注后合成同樣減少。本研究發現,熱缺血后細胞以早期脹亡為主,原因在于345中國現代普通外科進展2004年12月第7卷第6期細胞內鈉鉀ATP酶、鈣ATP酶活性下降必然導致細胞內+2+Na、Ca超載,同時因鈉鉀ATP酶活性下降會

25、引起胞內+Na超載,后者又激活細胞膜上Na+2Ca2+交換蛋白,使過多Ca2+進入胞內。從亞細胞的角度看:Na+超載還會引起線粒體中Ca2+釋放,最終導致胞內鈣超載。鎂ATP酶活性下降會造成細胞內Mg2+減少,一方面削弱它對Ca2+增多的生理拮抗作用,另一方面,低Mg2+本身還可降低細胞內30多種酶的活力,抑制能量合成,增加細胞膜通透性和減少蛋白質合成,結果造成離子分布失衡,細胞內晶體滲透壓增高、水增加、細胞腫脹,最終導致細胞脹亡。再灌注后,再灌注還導致過量的氧自由基產生,直接損傷細胞膜,細胞膜通透性增加、鈣離子內流,進一步增高、鈣離子濃度,而細胞內鈣離子濃度增高又可激活鈣離子依賴性蛋白酶,催

26、化黃嘌呤脫氫酶(XDH)轉化為黃嘌呤氧化酶(XOD),XOD在有氧條件下能促進次黃嘌呤分解為尿酸同時產生大量的氧自由基,放大損傷效應,鈣超載可激活鈣離子依賴性的核酸內切酶,在核小體Linker部位裂解雙鏈DNA;還可激活蛋白酶C,使之轉移到細胞膜,G蛋白磷酸化,G蛋白減少,胞內cAMP增加,導致細胞凋亡。胞漿內Ca2+濃度持續升高,還能激活P2A,破壞細胞骨架和膜磷脂成分,最終可導致細胞結構的損傷、死亡甚至發生癌變6。研究還發現冷缺血組中3種ATP酶活性高于同期熱缺血再灌注組,原因可能為:(1)低溫保存使該酶的活性降低7,同時機體代謝率下降,ATP消耗減少,避免了劇烈變化造成的蛋白酶損害。Mi

27、taniA等用熒光微定量技術也證實,低溫能顯著抑制缺氧時所造成的鈣離子內流,降低細胞內的鈣離子濃度8。國內研究也證實低溫條件下鈉鉀ATP酶仍能部分地泵出Na+及泵入K+,以減輕細胞內的Na+負荷的作用,從而使細胞內的Na+減少。(2)再灌注后:低溫能抑制氧自由基產生,增強機體抗氧化,減輕細胞內ATP酶的損害9。結合熱缺血條件下,細胞死亡方式趨向脹亡,冷缺血條件下細胞以凋亡為主,提示ATP酶活性嚴重下降將導致細胞脹亡,輕度下降則會導致凋亡。當損傷不可避免時,如果在術前或術中給予能量物質,提高鈉鉀ATP酶、鈣ATP酶及鎂ATP酶的活性,則對于減少兩類損傷,特別是減少脹亡,減輕炎癥反應,延長肝門阻斷

28、時間有利。參考文獻1段偉東,劉永雄,杜國盛,等.三袖套法大鼠原位肝移植模型的體會J.中華肝膽外科雜志,1999,5(1):55.2OhmoriM,MiyashitaF,UchidaH,etal.Effectoferythromycinonis2chemia2reperfusioninjuryofliverinratsJ.(4):811TransplantProc,2000,323MajnoG,IJoris.Apoptosis,oncosisandnecrosis.AnoverviewofcelldeathJ.AmJPathol,1995,146(1):3.4VanCruchtenS,VanDe

29、nBroeckW.MorphologicalandBiochemicalAs2pectsofApoptosis,OncosisandNecrosisJ.AnatHistolEmbryol,2002,31(4):214.5OstadalP,ElmoselhiAB,ZdobnickaI,etal.Ischemia2reperfusionaltersgeneexpressionofNa+2K+ATPaseisoformsinratheartJ.BiochemBiophysResCommun,2003,306(2):457.6ClaphamDE.CalciumsignalingJ.Cell,1995,

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