1、制劑無菌檢查及微生物限度檢查方法學驗證及驗證結果的技術評價 制劑無菌檢查及微生物限度檢查方法學驗證及驗證結果的技術評價 錢維清 （上海市食品藥品檢驗所 7>201203 ） 擇要： 本文從為什么必須開展制劑無菌檢查、微生物限度檢查的方法學驗證試驗出發（why ），說明了開 展驗證的思路和程序、驗證的重點（what ）、如何驗證（how ）、什么時候驗證（when ），及怎樣對 驗證結果和驗證報告進行技術評價等問題。 關鍵詞：無菌檢查方法驗證；微生物限度檢查方法驗證；驗證結果的技術評價 2005 年版藥典無菌檢查法和微生物限度檢查法的最重大增訂是要求對檢驗方法進行驗 證，及對驗證方法給出了

2、系統的規定。 這是我國藥品微生物學檢查方法與先進國家藥典接 軌、符合國際人用藥品注冊技術要求協調會（ICH ）的要求、邁向科學化、合理化的一個重 要標志，也是促進我國藥品微生物學檢查標準化建設的重要途徑。為了確保開展微生物學檢 驗方法的驗證，國家局、藥典會、中檢所都先后發布了要求執行驗證的相關法規和文件1 一、驗證的必要性和意義（Why ） 1、隨著科學技術的迅速發展，藥品質量標準中的鑒別、有關物質、含量測定等項的檢測 方法都不斷地在精密度、準確度上逐步提高。但 2005 年版以前的藥典對藥品微生物污染檢 查方法的準確性、可靠性基本無要求，造成長期來在藥品生產工藝、藥品檢驗、藥品技術審 評中對

3、與人民用藥安全有效密切相關的微生物污染監控、監測方法缺乏警惕和衡量的標準， 與先進國家的藥典和藥品技術審評要求脫節。 2 、對所用的檢驗方法進行驗證，是分析測量科學的基本要求，是各種法規遵循工作的基 礎。藥品微生物學的檢查作為整個藥品質量體系中的一個環節，也應與化學分析的嚴謹要求 靠攏，保證檢驗結果的準確可靠。 3、通過驗證試驗，可對每種藥品的具體檢驗方法的可靠性及結果的準確性予以確認，從 而形成標準化的操作。這是促進藥品無菌、微生物限度檢查走向標準化的重要途徑。 4 、通過對同品種但不同批號或不同生產廠家的產品的微生物學驗證試驗比較，可以發現 產品所用原料質量或工藝流程中是否存在污染抑菌物質

4、的問題，具有藥品質量控制的意義。 二、開展驗證的思路和程序 1 首先了解供試品是否有抑菌性、抑什么菌。 2 考慮和選擇出適當的方法消除或降低供試品的抑菌性。 3 用實驗證明你所用的方法已消除抑菌性 能使人工加入的各種試驗菌生長良好。特別 是能滿足對產品最敏感菌的生長。 4 將所作實驗記錄在案 即為確認該供試品在該檢驗量，在該檢驗條件下已充分消除 抑菌性，能確保實驗結果正確可靠的驗證試驗結果報告。 以上4 點思路和程序也是對驗證報告進行技術評價和審核時必須注意和考察的 4 點。 三、驗證的重點是什么？（what ） 無菌、微生物限度檢查的驗證試驗可概括描述為：在采用的檢驗方法和過程中，通過分 別

5、加入規定量的代表性微生物，以試驗供試品是否在規定的檢驗量、在所采用的檢驗條件下 1 無抑菌性，或已充分消除了抑菌性（供試品本身的以及操作系統中可能對微生物生長有影響 的各種因素），并且所用方法對微生物生長無不良影響，從而確認檢驗方法的有效性，保證 檢驗結果的準確可靠。因此，整個實驗過程中的每一個環節均應有合理的證明，保證其對結 果判斷沒有影響。按樣品的檢驗流程，驗證的重點環節分布如下： 需前處理 驗證前處理方法對污染菌生長、檢出的影響。 樣品 有抑菌作用 去除抑菌作用 不需前處理 通過驗 驗證抑菌活性去除方法的有效 證實驗判 性及對污染菌檢出無影響。 無抑菌作用 檢驗 What1 ：驗證制成適

6、宜供試液的前處理方法，證明方法對微生物生長、檢出無影響。 What2 ：驗證樣品有無抑菌性、抑什么菌 ？最敏感的菌是那一個？ 其結果將直接影響 下續檢驗方法的選擇和操作步驟的進行，并是最終所選檢驗方法和操作步驟合理性的證明。 What3 ：驗證消除樣品抑菌活性的方法，證明方法的有效性及方法對污染菌生長無影響。 如何選擇合理、適宜、簡單有效的消除抑菌活性的方法是當前驗證工作的關鍵。 驗證報告對以上 3 個環節的情況是否都有交待；所采用的方法是否科學、合理、有效， 并且提供了實驗的證明，也是對驗證報告進行技術評價和審核時必須注意考察的 3 點。 四、怎么驗證？（How ） 按藥典對樣品無菌檢查的規

7、定和要求，或是微生物限度檢查的規定和要求進行，對每一 試驗菌應逐一進行驗證試驗。微生物學的驗證試驗一般分 4 個步驟進行： 1、制備驗證試驗用菌液How1 ： 按藥典無菌檢查法中培養基靈敏度檢查項中試驗用菌液制備的方法將規定需用的試驗菌 分別制成每毫升中含 10100 個菌（CFU ）的供試菌液。驗證報告中應給出各種試驗用菌液 的制備和菌液含菌量計數的原始記錄。 2 、樣品的前處理方法How2 ： 為達到制備成均勻的供試液及為后續采取消除抑菌活性的方法作準備，將所采取的前處 理方法應用和參加到驗證試驗中，以證明所用處理方法對各試驗菌的生長無影響。 按供試品的性狀選用以下適宜的方法，或幾種方法聯

8、合使用： 溶解： 驗證所用溶液、助溶劑和水浴助溶溫度對微生物生長無影響。 乳化： 驗證所用乳化劑和水浴助溶溫度的有效性、使用量及對微生物生長無影響。 破乳： 驗證所用破乳劑的有效性、使用量及對微生物生長無影響。 萃取： 驗證有機相選擇的合理性、有效性及對微生物生長無影響。 2 稀釋： 驗證降低供試品相對抑菌濃度的有效稀釋倍數。 離心： 驗證所用轉速、時間和微生物的分布情況。 驗證報告中應有采取某種前處理方法的原因有說明，并記錄操作步驟以增加重現性。樣 品如不需要特別的前處理就能制成均勻的供試液，那么這一步驟可省掉，直接進入確定樣品 有無抑菌性的How3 3、確定供試品是否有抑菌性、抑什么菌Ho

9、w3 ： 可通過查閱臨床藥物實驗手冊、文獻資料（特別是雜志“Drug”，每一種新藥上市，都有 專門的綜述）、申報資料中的藥效學資料，關注其對不同細菌的 MIC 情況、參考已經驗證過 的品種、抗菌藥物可根據抗菌譜確定其敏感菌、中成藥如果抗菌譜不清楚，至少需選擇一株 細菌和一株真菌來試驗等方法。也可直接通過驗證實驗確定之。 用實驗確定是否具有抑菌性的方法：在規定量的供試液中加入實驗用微生物 10100 個， 如微生物生長良好，即說明供試品對該種微生物無抑菌活性。如已用藥典規定的各試驗菌試 驗，結果均能生長良好，說明供試品無抑菌性，可用常規方法檢驗之。 將這些試驗記錄在 案就是證明該供試品無抑菌性的驗證試驗部分；如加入的微生物不生長或生長緩慢，說 明供試品有抑菌性，將這些試驗記錄在案就是證明該供試品有抑菌性的驗證試驗部分； 如加入的微生物中有某一種菌最不能生長或生長最緩慢，這一種菌就是該樣品的敏感菌。 4 、選擇適當的方法消除或有效降低供試品的抑菌活性How4 ： 根據供試品特性選擇藥典規定的消除供試品抑菌活性的方法（一種或幾種聯合），或利 用藥物化學知識，尋找出其他合理、有效的方法，特別是有效的中和劑（這是值得鼓勵的 發展方向）。并通過模擬實驗（驗證試驗）對消除或降低抑菌活性的效果加以檢驗。 無菌檢查中可采用： 薄膜過