1、會計學1第1頁/共42頁第2頁/共42頁ES細胞或細胞或iPS細胞的密度要求細胞的密度要求無滋養(yǎng)層細胞較好無滋養(yǎng)層細胞較好n傳代后至克隆形態(tài)良好，密度適中。n通常傳至24孔板中。因為用Hochest染核對照也會將滋養(yǎng)層細胞的核同時染上，影響克隆定位。Oct4/DAPI第3頁/共42頁第4頁/共42頁材料材料流程流程把細胞固定在4PFA中，室溫放置30min 4多聚甲醛（4PFA, Paraformaldehyde）固定細胞之前，將培養(yǎng)基吸棄，用PBS涮2次 n0.1M的PBS配制（PH7.4），100mL PBS加4克多聚甲醛。n由于多聚甲醛難溶于水，需用磁力攪拌器加熱攪拌，溫度控制在60以下

2、。 第5頁/共42頁第6頁/共42頁材料材料流程流程n陽性陽性染色對照染色對照：染色呈陰性時，證實染色的有效性n陰性染色對照陰性染色對照：染色呈陽性時，證實染色的特異性n一抗、二抗、一抗、二抗、Hoechst（DAPI）：分別發(fā)揮如下作用：識別特異抗原、特異一抗及細胞核n抗體稀釋液抗體稀釋液：稀釋抗體n封閉液封閉液：封閉非特異性反應(yīng)洗滌細胞洗滌細胞透膜（僅限染核抗體）透膜（僅限染核抗體）一抗孵育一抗孵育二抗孵育二抗孵育染核定位（染核定位（Hochest）第7頁/共42頁材料材料n陽性陽性染色對照染色對照：以多能干細胞標記物染色為例，陽性染色對照細胞是確定表達相應(yīng)抗體的細胞，如ES細胞或經(jīng)過驗證

3、的iPS細胞n陰性染色對照陰性染色對照：是確定不表達相應(yīng)抗體的細胞，如成纖維細胞等。n一抗一抗：要確保所購買的一抗識別所染細胞的物種；要做預(yù)實驗以確定最適的抗體濃度n二抗二抗：要根據(jù)所染細胞自身所帶的熒光類型決定相應(yīng)的二抗的熒光類型，二者應(yīng)不同。nHoechst：英文名稱：bisBenzimide（Sigma B1155）；以PBS配制成1mg/ml 的母液，分裝后于-20保存；常用的可置于4 ，染色時以1XPBS 1000倍稀釋。 n抗體稀釋液抗體稀釋液：0.2%BSA和0.1%TritonX100溶于1XPBS； 4 保存；盡量現(xiàn)用現(xiàn)配，因含蛋白成分，容易變質(zhì)，長菌。n封閉液封閉液：含1%

4、BSA+4% normal serum+0.4%TritonX100的1XPBS溶液；4 保存；盡量現(xiàn)用現(xiàn)配，因含蛋白成分，容易變質(zhì)，長菌。第8頁/共42頁流程流程l所有洗滌，浸泡步驟都在搖床上進行。目的是為了洗滌，浸泡充分均勻。l“洗滌”指將平板置于搖床上搖洗35分鐘 把細胞固定在4PFA中，室溫放置30min 1X PBS 洗滌2次 抗體稀釋液洗滌兩次 無水乙醇中浸泡兩次，每次20min（或3次，10min/次）(此步僅限于核蛋白染色，如Oct4，Nanog或Rex1等，不能用于膜蛋白) 1X PBS洗滌1次 封閉液封閉細胞，室溫，封閉液封閉細胞，室溫，1h 將一抗稀釋在抗體稀釋液中，加到

5、樣品上，室溫將一抗稀釋在抗體稀釋液中，加到樣品上，室溫2h或或4 放置過夜放置過夜(以以24孔板為例，孔板為例，一抗的體積：一抗的體積：200ul/孔孔) 第9頁/共42頁流程流程吸棄一抗，用PBT（0.1%TritonX100 in PBS）洗滌細胞35次將二抗稀釋在抗體稀釋液中，并加到樣品孔里，室溫放置1h; (以24孔板為例，二抗的體積：200ul/孔) 用PBT洗滌3次，約5min/次 用PBS洗滌兩次，5min/次 再用4PFA室溫固定30min 最后再用PBS洗滌兩次，每次5min Hoechst染核, 室溫放置5min 第10頁/共42頁第11頁/共42頁iPS細胞染色實例細胞染

6、色實例n多能干細胞標記物的常用抗體：n膜抗體：SSEA-1、 SSEA-3、 SSEA-4n胞漿抗體：Tra-1-60、 Tra-1-81n核抗體：Oct4、Nanog、Rex1h陽性對照陽性對照陰性對照陰性對照Rat-iPSCs第12頁/共42頁iPS細胞染色實例細胞染色實例陽性對照陽性對照陰性對照陰性對照hhESCsTra-1-60第13頁/共42頁iPS細胞染色實例細胞染色實例Pig-iPSCs第14頁/共42頁iPS細胞染色實例細胞染色實例Human-iPSCs EB 分化染色分化染色Sox17AFPNestin -actinSMATuj1內(nèi)胚層內(nèi)胚層中胚層中胚層外胚層外胚層第15頁/

7、共42頁第16頁/共42頁第17頁/共42頁ES細胞或細胞或iPS細胞的收集細胞的收集n細胞數(shù)量：一個細胞數(shù)量：一個T75長到長到80-90%滿時，細胞數(shù)大約為滿時，細胞數(shù)大約為1000萬萬個，可以打兩個點，即每個點約個，可以打兩個點，即每個點約300-500萬個細胞；萬個細胞；n細胞處理：細胞處理： 小鼠及大鼠小鼠及大鼠iPS細胞：將細胞消化成單細胞；細胞：將細胞消化成單細胞；1200rpm離心離心5min后棄上清；以小于后棄上清；以小于400ul的的10%DMEM重懸；重懸； 人人iPS細胞：將消化下來的細胞吹打成較小塊；靜置至細胞細胞：將消化下來的細胞吹打成較小塊；靜置至細胞團塊沉底，并

8、棄上清；以小于團塊沉底，并棄上清；以小于400ul的的hES培基重懸；培基重懸；n收集細胞到收集細胞到1ml注射器內(nèi)并注射。注射器內(nèi)并注射。第18頁/共42頁ES細胞或細胞或iPS細胞的注射細胞的注射n材料：多重免疫缺陷小鼠（ NODSCID小鼠）n注射部位：后腿內(nèi)側(cè)肌肉注射第19頁/共42頁畸胎瘤的生長和摘取畸胎瘤的生長和摘取n通常注射30-40天之后，畸胎瘤就長成直徑大概1-2cm左右的球體n當畸胎瘤長到一定體積時，手術(shù)摘除畸胎瘤n通常畸胎瘤都是實質(zhì)性的，也有個別呈空泡狀。約約1-2cm第20頁/共42頁第21頁/共42頁流程流程固定包埋切片切片材料材料n4%PFA：固定畸胎瘤組織用n石蠟

9、石蠟（熔點約50-60度）：包埋組織n石蠟包埋機石蠟包埋機（非必須）：包埋組織，還需要包埋盒、包埋底n石蠟切片機石蠟切片機（必須）：切半薄“Semi-thick”石蠟切片n染色缸、染色架、載玻片、蓋玻片染色缸、染色架、載玻片、蓋玻片n溶液溶液：n載玻片：載玻片：防脫片；也可以自制“蛋白膠”涂在切片上晾干乙醇（EtOH）、二甲苯（Xylene）、氯仿（Chloroform）HE染色液（H：Hematoxyline蘇木精、E：Eosin 伊紅）封片樹脂染色架染色缸撈片、展片撈片、展片染色第22頁/共42頁流程流程固定在4%PFA中固定，4 （浸泡）過夜換成新鮮的 4%PFA ，再次4浸泡過夜（過長

10、時間浸在固定液中會降低樣品的抗原性，影響后續(xù)的免疫染色）l4固定是為了更好的保持標本的抗原性，室溫也可以第23頁/共42頁流程流程固定包埋之脫水、透明70 EtOH 1h80 EtOH 1h90 EtOH 1h95 EtOH 1h100EtOH 1hFresh 100EtOH 1h Fresh 100EtOH overnight氯仿氯仿 1h新鮮氯仿新鮮氯仿 1h新鮮氯仿新鮮氯仿 overnight 脫水脫水透明透明第24頁/共42頁流程流程包埋包埋石蠟包埋盒經(jīng)透明經(jīng)透明處理的處理的樣品樣品溶解溶解石蠟石蠟1h2h溶解溶解石蠟石蠟50-60，取決于石蠟的融點，取決于石蠟的融點固定包埋之包埋第2

11、5頁/共42頁流程流程固定包埋 之 包埋n如果沒有石蠟包埋機，可以用60 烘箱代替；n利用酒精燈加熱鑷子可代替高溫鑷子；n將樣品快速放到石蠟包埋底內(nèi)，蓋上包埋盒的底座，直至石蠟全部凝結(jié)；n修整蠟塊形狀、備用。溶解蠟存放槽出蠟口冷凍臺高溫鑷子石蠟包埋盒和包埋底存放槽各種規(guī)格的石蠟包埋底第26頁/共42頁n用單面刀片修整蠟塊，并達到以下要求：n（1）蠟塊呈正方形或長方形，蠟塊各面要平直，樣品位于蠟塊正中央；n（2）樣品邊緣與蠟塊邊緣的距離約3mm。 流程流程固定包埋 之 修整蠟塊樣品與蠟樣品與蠟塊邊緣有塊邊緣有一定距離，一定距離，以便切片以便切片能夠連成能夠連成蠟帶蠟帶平行平行第27頁/共42頁流

12、程流程固定包埋切片切片蠟塊固定座刀片切片厚度微調(diào)旋鈕手動切片轉(zhuǎn)輪切片厚度：切片厚度：5微米微米蠟帶毛筆第28頁/共42頁固定包埋切片切片撈片、展片撈片、展片流程流程37蒸餾水蒸餾水載玻片置于37-42 的烘片臺（平面）上樣品切樣品切片片切片借助水的表面張力展開至平整吸除多余水分，37 烤片過夜,備用做好樣品ID的標記第29頁/共42頁流程流程烤片機烤片機37 烤片過夜，防止脫片烤片過夜，防止脫片展片溫水槽展片溫水槽溫度設(shè)定：溫度設(shè)定：37-42左右左右固定包埋切片切片撈片、展片、烤片撈片、展片、烤片第30頁/共42頁第31頁/共42頁流程流程 脫蠟親水脫蠟親水100% EtOH浸泡2次 10m

13、in/次95% EtOH 5min90% EtOH 5min80% EtOH 5min70% EtOH 5min蒸餾水浸洗3次， 5min/次Xylene1Xylene3Xylene2Xylene4脫蠟脫蠟親水親水（非一次性使用，可反復(fù)多次使用）二甲苯浸泡4次 5min/次第32頁/共42頁流程流程 染色染色在鹽酸酒精溶液內(nèi)浸一下至變成接近紅色，此步驟稱為“鹽酸分化”(1%鹽酸酒精溶液：指染色缸中70酒精中含1%鹽酸)將切片 在自來水龍頭下流水沖洗15-20分鐘，至切片呈理想的紫藍色，此步驟稱“藍化”（顏色的適宜度取決于染色者的經(jīng)驗）蒸餾水中涮洗一下切片在Eosin溶液中染5min自來水涮洗至

14、水接近無色蒸餾水涮洗一下切片在 Hematoxylin 溶液中浸泡 10min自來水中涮洗2、3次至水接近無色蒸餾水中涮洗1次第33頁/共42頁流程流程 脫水封片脫水封片100% EtOH浸泡2次 10min/次脫脫水水二甲苯浸泡4次 5min/次Xylene1Xylene3Xylene2Xylene4透透明明（非一次性使用，可反復(fù)多次使用）70% EtOH short time80% EtOH short time90% EtOH short time樹脂封片，顯微鏡下觀察(以上幾步一方面是為了脫水，另一方面是為了脫去多余以上幾步一方面是為了脫水，另一方面是為了脫去多余的的Eosin顏色，所以，要注意觀察切片顏色的變化。顏色，所以，要注意觀察切片顏色的變化。70和和80的酒精只要稍稍浸一下即可，的酒精只要稍稍浸一下即可，90的酒精是調(diào)的酒精是調(diào)整顏色的關(guān)鍵步驟，在這一步要依靠染色者根據(jù)切片顏整顏色的關(guān)鍵步驟，在這一步要依靠染色者根據(jù)切片顏色自覺調(diào)整時間。新鮮的無水酒精沒有脫色作用色自覺調(diào)整時間。新鮮的無水酒精沒有脫色作用)第34頁/共42頁流程流程在樣品中